全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (5): 642-648, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-09-18; 接受日期: 2007-04-16
基金项目: 黑龙江省自然科学基金(No. C0212)和黑龙江省攻关课题(No. GB06B30304)
* 通讯作者。E-mail: swxhaoaiping@126.com
.组织培养简讯.
白桦愈伤组织化学诱变
詹亚光 1 , 郝爱平 2*, 唐敬轩 1
1东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨 150040; 2牡丹江师范学院生物系, 牡丹江 157012
摘要 用不同浓度的甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)对白桦(Betula platyphalla Sak.)愈伤组织进行化学诱
变处理。结果表明: EMS诱变剂的浓度和处理时间对愈伤组织的存活率有很大影响。在高浓度EMS短时间处理和低浓度EMS
长时间处理条件下得到叶柄、叶片愈伤组织的半致死剂量。通过观察半致死剂量下愈伤组织的染色体发现, 诱变后细胞中单
倍体、非整倍体及多倍体比例均高于对照, 这说明EMS的诱变处理引起了愈伤组织细胞中染色体数量的变化。
关键词 白桦, 愈伤组织, 甲基磺酸乙酯(EMS)
詹亚光, 郝爱平, 唐敬轩 (2007). 白桦愈伤组织化学诱变. 植物学通报 24, 642-648.
化学诱变是重要的变异途径之一(安学丽等, 2003; 刘
进平和郑成木, 2004; 董颖苹等, 2005)。利用组织培养
技术进行化学诱变已在许多物种中得到应用( Ashfaq et
al., 1997; Rao et al., 1997; 沈银柱等, 1997; 严兴洪等,
2000; Joong and Seung, 2002; Rodrigo et al., 2004; Liu
et al., 2005; 王瑾等, 2005), 但白桦(Betula platyphalla)
尚无此方面研究的报道。本文用化学诱变剂处理白桦组
培苗不同部位, 诱导获得愈伤组织, 通过比较化学诱变前
后愈伤组织染色体数目变异频率以及诱变后各处理条件
下的变异差异和规律, 旨在探索白桦愈伤组织化学诱变理
论, 为丰富白桦优良的基因资源、创造新品种奠定理论
基础, 同时也为其它林木诱变育种工作提供理论依据。
1 材料与方法
实验材料为白桦(Betula platyphalla Sak.)组培苗的叶
片、叶柄诱导获得的愈伤组织。
1.1 研究方法
1.1.1 EMS溶液浸泡白桦愈伤组织
将白桦组培苗由叶片、叶柄诱导获得的愈伤组织切割
成约 0.5 cm3的小块, 放入继代培养基中预培养 1周。
然后把经预培养的愈伤组织浸泡在浓度分别为 0.1%、
0.3%、0.5%、0.7%和 1.0%的甲基磺酸乙酯(ethyl
methane sulfonate, EMS)溶液中。处理时间以小时为单
位, 从1小时开始, 隔一段时间取出部分愈伤组织, 然后用
无菌蒸馏水冲洗3-5次, 洗去残留的EMS, 放入继代培养
基中。用蒸馏水和磷酸盐缓冲液浸泡相同时间的愈伤组
织作为对照处理。20天后统计愈伤组织的存活率。
1.1.2 培养基中加入 EMS诱变愈伤组织
在灭菌后的继代培养基没有凝固前, 在无菌的条件下加
入一定量灭菌的EMS, 然后分装在三角瓶中, 配成浓度
分别为 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和 1.0%的 EMS
培养基。将经预培养的愈伤组织接种于上述配好的不
同浓度的 EMS培养基中, 以不加 EMS的培养基为对
照。培养 20天后统计愈伤组织的存活率。对 2种诱变
方法达到半致死剂量下的愈伤组织用常规压片法观察细
胞染色体数目。
2 结果与分析
2.1 不同EMS浓度及浸泡时间对白桦叶柄愈伤
组织诱变效果的影响
不同EMS浓度及相应处理时间对叶柄愈伤组织存活
643詹亚光等: 白桦愈伤组织化学诱变
状况有很大影响。EMS 浓度与处理时间呈负相关 ,
即高浓度 EMS需要较短处理时间、低浓度 EMS需
要较长处理时间使叶柄愈伤组织全部致死。0.1%的
EMS对叶柄愈伤组织的存活率没有影响, 即使处理时
间达到50小时, 叶柄愈伤组织仍长势良好, 甚至比对
照的叶柄愈伤组织长势还好, 颜色为深绿色。这说明
0.1%的EMS对叶柄愈伤组织的生长有一定的促进作
用。由表 1 可以看出 , 0 . 3 % E M S 处理 5 小时、
0 . 5% EM S 处理 4 小时、0 .7 %E MS 处理 3 小时、
1.0%EMS处理1小时可分别作为叶柄愈伤组织的半
致死条件。
2.2 不同EMS浓度及浸泡时间对白桦叶片愈伤
组织诱变效果的影响
EMS浓度及处理时间对叶片愈伤组织的诱变效果与叶
柄愈伤组织类似, 即 EMS浓度与处理时间呈负相关。
表 1 不同 EMS浓度及处理时间对叶柄愈伤组织存活率的影响
Table 1 Effect of various EMS concentrations and inducing time on the survival rate of callus of petiole
Concentration of EMS (%) Inducing time (h) Number Survival numbers Survival rate (%)
0.1 1 30 30 100
2 30 30 100
24 31 31 100
50 42 42 100
0.3 2 35 35 100
4 35 25 71
5 83 39 46
0.5 2 32 32 100
4 34 20 58
0.7 2 36 36 100
3 36 19 52
4.5 30 0 0
1.0 0.5 30 21 70
1 29 15 51
2 33 0 0
表 2 不同 EMS浓度及处理时间对叶片愈伤组织存活率的影响
Table 2 Effect of various EMS concentrations and inducing time on the survival rate of callus of lamina
Clone Concentration of EMS (%) Inducing time (h) Number Survival numbers Survival rate (%)
No.3 0.1 1 32 32 100
2 33 33 100
0.3 4 27 27 100
5 35 27 77
6 73 42 57
0.5 2 31 28 90
5 29 14 48
0.7 2 33 15 45
4 24 0 0
1.0 1 35 12 34
2 32 3 9
3 31 0 0
No.30 0.7 2 24 8 33
1.0 1 28 13 46
644 植物学通报 24(5) 2007
同时可以从图1和图2中得出结论: 叶片愈伤组织比叶
柄愈伤组织具有更强的耐药性。在相同的EMS浓度下
(0.3%和0.5%), 叶片愈伤组织半致死剂量比叶柄愈伤组
织半致死剂量所需的处理时间要长。不同无性系, 如
30号与 3号, 在相同浓度的EMS处理下所需的半致死
量时间相同, 这说明不同无性系之间对EMS诱变敏感性
无差异。从表2 中可知: 叶片愈伤组织半致死条件分别
是 0.3%EMS处理 6小时, 0.5% EMS处理 5小时,
0.7% EMS处理 2小时, 或 1.0% EMS处理 1小时。
2.3 培养基中加入EMS对于白桦愈伤组织诱变
效果的影响
将由白桦组培苗的叶片、叶柄和茎段诱导出的愈伤组
织经继代培养基培养后分别放入浓度为 0.1%、0.2%、
图 1 叶柄愈伤组织在不同浓度 EMS处理下的生长状况
(A) 0.1%EMS处理 50小时;
(B) 0.3%EMS处理 5小时;
(C) 0.7%EMS处理 3小时;
(D) 0.7%EMS处理 4.5小时
Figure 1 The petiole calli were treated with different concen-
trations of EMS
(A) treated with 0.1% EMS for 50 h;
(B) treated with 0.3% EMS for 5 h;
(C) treated with 0.7% EMS for 3 h;
(D) treated with 0.7% EMS for 4.5 h
表 3 不同无性系间的诱变情况
Table 3 Treatment of EMS on different clones
Concentration of EMS (%) Clone Type of calli Number Survival numbers Survival rate (%)
0.1 No.3 Lamina 30 30 100
Petiole 30 30 100
Stem segment 57 57 100
No.4 Lamina 31 31 100
No.37 Lamina 19 19 100
Petiole 29 29 100
0.3 No.3 Lamina 30 0 0
Petiole 30 0 0
Stem segment 55 0 0
No.4 Petiole 24 0 0
0.5 No.3 Lamina 27 0 0
Petiole 29 0 0
Stem segment 35 0 0
No.4 Petiole 24 0 0
No.37 Lamina 21 0 0
Petiole 21 0 0
645詹亚光等: 白桦愈伤组织化学诱变
0.3%和 0.5%的 EMS培养基中, 诱变结果如表 3。
由表3可以看出, 除EMS浓度为0.1%的培养基之
外, 其它培养基中的愈伤组织在1周后全部致死。在培
养1周的过程中, EMS浓度为0.3%的培养基中的愈伤
组织并非立即致死, 而是随着诱变时间的延长逐渐死亡,
如在第 3天观察 3号茎段和 4号叶柄的愈伤组织时, 发
现存活率分别为 16%和17%, 之后存活率逐步降至0。
这说明 EMS对白桦愈伤组织有较强的杀伤力, 高浓度
EMS培养基中难以获得存活变异体。此外, 不同无性
系之间的诱变结果大体相同, 并无明显差异。
2.4 叶柄、叶片愈伤组织在半致死剂量下的染
色体变异
将半致死剂量下存活的愈伤组织转入继代培养基中, 培
养1周后取材, 用0.2%秋水仙素处理2小时, 然后用卡
诺固定液固定2小时, 用蒸馏水洗净后经卡宝品红染色,
表 4 半致死剂量下的叶柄愈伤组织细胞染色体统计
Table 4 Statistics of chromosome numbers of half death of petiole callus cells
Concentration Half death Sum of Aneuploid Haploid Hypoctiploid Diploid Hyperploid
of EMS (%) of time (h) observed cell 2n<14 (%) 2n=14 (%) 14<2n<28 (%) 2n=28 (%) 28<2n<42 (%)
0.3 5 96 13.5 4.2 76.0 2.1 4.2
1.0 1 94 11.7 4.3 73.3 6.4 4.3
Control 0 126 1.8 3.5 67.5 22.4 4.8
图 2 叶片愈伤组织在不同浓度 EMS处理下的生长状况
(A) 1.0%EMS处理 3小时;
(B) 0.5%EMS处理 5小时;
(C) 1.0%EMS处理 1小时;
(D) 0.7%EMS处理 4小时
Figure 2 The lamina calli were treated with different concen-
trations of EMS
(A) treated with 1.0% EMS for 3 h;
(B) treated with 0.5% EMS for 5 h;
(C) treated with 1.0% EMS for 1 h;
(D) treated with 0.7% EMS for 4 h
制片观察细胞染色体数目(图 3)。以未经 EMS处理过
的愈伤组织作为对照, 结果见表 4。
由表4可以看出, 诱变前后叶柄愈伤组织细胞中的
染色体数量发生了明显的变化。诱变前叶柄愈伤组织
细胞中单倍体和非整倍体比例均很小, 而诱变后叶柄愈
伤组织细胞中单倍体和非整倍体比例增加, 尤其是非整
倍体增加了10%左右; 诱变后愈伤组织细胞中二倍体水
平明显下降, 亚二倍体明显增加。这说明 EMS对叶柄
愈伤组织有一定的诱变作用。EMS诱变机理主要是通
过将烷基引入到DNA的核苷酸鸟嘌呤上, 使DNA在复
制时错误地将G-C碱基对转换为A-T碱基对; 或者这些
被烷基化的鸟嘌呤自动降解, 在DNA链上出现空位, 使
DNA链断裂、易位甚至死亡。研究表明, EMS化学诱
变产生点突变的频率高, 而染色体畸变相对较少(史桂荣,
1994)。本研究结果也表明, EMS引起了白桦叶柄愈伤
组织染色体数量的变异。
646 植物学通报 24(5) 2007
由表5可以看出, 诱变后叶片愈伤组织细胞中染色
体数量与叶柄愈伤组织细胞染色体数量变异有所不同。
在EMS浓度为 0.3%和 1.0%时, 叶片愈伤组织细胞中
非整倍体少, 而单倍体、二倍体和超二倍体的数目略多
于诱变后的叶柄愈伤组织。说明叶柄与叶片的愈伤组
织对于 EMS诱变反应产生了不同的效果。但相同的
是, 诱变后多倍体和非整倍体增多。多倍体和非整倍体
在作物遗传中, 是很好的遗传材料。它不仅可用来进行
遗传分析, 合成新的物种, 而且是很好的种质资源, 为作
物遗传育种、新品种培育打下物质基础(冯海生和陈志
国, 1998)。而对于白桦诱变后的染色体变异的情况, 愈
伤组织分化率有可能下降, 但是却可能得到有利的变异
植株, 这为丰富白桦优良的基因资源、创造新品种奠定
了理论基础。
3 讨论
朴铁夫等(1995)使用EMS处理由水稻成熟胚诱导的愈
伤组织时, 发现低浓度的EMS对愈伤组织生长和植株分
化有一定刺激作用。本研究也表明, 低浓度(0.1%)的
EMS 对白桦愈伤组织的生长有促进作用, 因此可用
0.1%的EMS来促进白桦愈伤组织的分化。在 EMS诱
变过程中, EMS的浓度与处理时间对于愈伤组织的存活
起决定性的作用。将 3号、4号、30号和 37号无性
系的愈伤组织分别放入含有EMS的培养基中, 除浓度为
0.1%外, 其它浓度的处理 1周后全部致死, 这与 EMS
溶液浸泡的结果大不相同, 因为前者的诱变处理时间较
长。将诱变处理时间由 1周变为 3、4天, 则 0.3%浓
度下的培养基中有部分愈伤组织存活, 因此在培养基中
加入EMS的诱变方法需进一步探索。此外, 除EMS浓
度与处理时间外, 愈伤组织的大小、继代时间的长短等
对于诱变也有影响。建议可将不同大小、不同继代时
间的愈伤组织进行EMS诱变, 然后进行染色体观察与比
较, 进一步完善诱变方法。
人工诱变是植物育种的一条有效途径, 而应用化学
诱变剂诱发生物体变异, 定向培育植物新品种, 其优点是
突变的遗传性状稳定快、可以缩短育种周期(魏玉昌等,
1999)。同时在组织培养过程中存在细胞无性系变异
(詹亚光等, 2006), 细胞无性系变异与化学诱变技术相结
合, 可以在保持无性系育种优点的基础上, 进一步提高变
图 3 半致死条件下愈伤组织细胞中染色体数目观察
Figure 3 Observation of chromosome numbers of half death
of calli cells
(A) 2n=24; (B) 2n=21; (C) 14<2n<28; (D) 2n=6
表 5 半致死剂量下的叶片愈伤组织染色体统计
Table 5 Statistics of chromosome numbers of half death of lamina calli cells
Concentration Half death Sum of Aneuploid Haploid Hypoctiploid Diploid Hyperploid
of EMS (%) of time (h) observed cell 2n<14 (%) 2n=14 (%) 14<2n<28 (%) 2n=28 (%) 28<2n<42 (%)
0.3 6 94 5.3 6.3 73.4 9.6 5.3
0.5 5 102 9.8 4.9 70.6 8.8 5.9
0.7 2 108 13.9 8.3 64.7 7.4 9.3
1.0 1 110 4.5 7.3 62.7 14.5 10.9
Control 0 113 3.3 5.8 50.0 38.5 1.9
647詹亚光等: 白桦愈伤组织化学诱变
异频率, 拓宽变异谱, 从而为育种选择提供更大的空间和
可能性(沈圣泉等, 2003)。白桦愈伤组织在培养的过程
中, 能产生一定程度的染色体数目变异, 二倍体细胞占
20%-30%。但经过EMS处理后, 染色体数目变异大大
提高, 二倍体细胞比例下降为10%以下。愈伤组织染色
体数目变化幅度较大, 多达 56个; 少至 6个, 已不到一
个基因组(图 3D)。愈伤组织中, 只有 10%左右的细胞
仍具有2n=28的二倍体染色体数, 其它则为包含了不同
倍性染色体的细胞, 且多数为非整倍体, 这说明EMS对
白桦愈伤组织染色体数目变异有较强的诱变效应。
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648 植物学通报 24(5) 2007
Chemical Mutagenesis in Betula platyphylla Sak. Callus
Yaguang Zhan1, Aiping Hao2*, Jingxuan Tang1
1 College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
2 Department of Biology, Mudanjiang Normal College, Mudanjiang 157012, China
Abstract In this study, we investigated the survival rate of Betula platyphylla Sak. calli treated with different concentrations of
ethyl methane sulfonate (EMS) and treatment times. Half of the calli died under high-concentration EMS (for 1 or 2 h) or low-
concentration EMS (for 5 or 6 h). Mutation resulted in varied numbers of chromosomes in induced calli. The ratios of diploid, aneuploid
and polyploid of induced calli were higher than those of controls. EMS exacerbated the extent of ploidy change in callus cells.
Key words Betula platyphalla Sak., callus, ethyl methane sulfonate (EMS)
Zhan YG, Hao AP, Tang JX (2007). Research into chemical mutagenesis in Betula platyphylla Sak. callus. Chin Bull Bot 24, 642-648.
(责任编辑: 白羽红)
*Author for correspondence. E-mail: swxhaoaiping@126.com
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