全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (3): 283-289, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.03.004
收稿日期: 2009-03-18; 接受日期: 2009-03-31
基金项目: 海外青年学者合作研究基金(No.30428026)
*通讯作者。E-mail: songcp@henu.edu.cn
.研究报告.
低温胁迫下拟南芥CBF1超表达突变体胞质中Ca2+浓度的变化
张国增, 白玲, 宋纯鹏*
河南大学生命科学学院, 河南省植物逆境生物学重点实验室, 开封 475001
摘要 低温严重影响植物的生长, 低温刺激可引起植物细胞中Ca2+浓度迅速升高。以拟南芥(Arabidopsis thaliana) CBF1
超表达突变体为材料, 研究了低温处理时CBF1基因的表达情况及胞质Ca2+的浓度变化。结果表明, CBF1本身可受低温诱导。
同时将水母发光蛋白基因转入该拟南芥突变体中并检测Ca2+的浓度变化, 发现低温刺激时突变体细胞质中Ca2+的浓度变化幅
度明显高于野生型, 但液泡的胞质面两侧Ca2+的浓度变化相似。用EGTA和LaCl3处理拟南芥后, 胞质Ca2+的浓度升高被抑制,
并且CBF1突变体及对照胞质中的Ca2+浓度下降到同一水平。上述结果表明, Ca2+参与了CBF1应答低温信号的转导过程, 并
且CBF1超表达突变体可能是通过提高胞质Ca2+浓度来提高植物的抗低温胁迫能力。
关键词 水母发光蛋白, 拟南芥, 钙离子, CBF1, 低温胁迫
张国增, 白玲, 宋纯鹏 (2009). 低温胁迫下拟南芥CBF1超表达突变体胞质中Ca2+浓度的变化. 植物学报 44, 283-289.
低温不仅限制植物的地理分布和生长发育 , 而且也
严重影响着农作物的产量和品质, 是农业生产中常见的
限制因子。当植物经受不同程度的非结冰低温处理后,
其抗低温能力会有所提高, 即所谓的冷驯化( c o l d
acclimation)(Thomashow, 1999)。许多研究表明, 冷
驯化可以使植物体内发生一系列的生理生化变化以适应
低温胁迫, 例如积累脯氨酸和甜菜碱等一些保护性物
质、合成能改变冰点的蛋白质、积累活性氧、增加内
源ABA以及调控相关基因表达来增强植物的抗低温能
力(Chinnusamy et al., 2006; Maeda et al., 2006;
Suzuki and Mittler, 2006)。尽管如此, 植物耐受低温
胁迫的信号转导机制仍不十分清楚。
Ca2+被认为是细胞内广泛存在的信使。在植物细
胞中, Ca2+参与调节许多生理过程, 许多生物及非生物
胁迫均可引起植物细胞内Ca2+浓度([Ca2+]cyt)的变化。
植物可以根据[Ca2+]cyt变化的差异, 如位置、幅度和频
率, 解码不同的刺激从而做出特异的应答反应(Rudd and
Franklin-Tong, 2001)。 Knight等(1996)报道低温刺激
可引起植物细胞中的Ca2+浓度瞬时升高。电生理学实
验也证明, Ca2 +通道的活性受低温调节(Ding and
Pickard, 1993)。Ca2+螯合剂、Ca2+通道抑制剂以及
Ca2+依赖的蛋白激酶抑制剂均可以阻断冷驯化(Knight
et al., 1996), 这为Ca2+作为第二信使参与植物低温信
号转导过程提供了直接证据。
对Ca2+信号转导途径的认识, 在很大程度上取决于
Ca2+浓度测定技术的发展状况(Plieth, 2001)。Prasher
等(1985)从维多利亚多管水母(Aequorea victoria)中克隆
了脱辅基水母发光蛋白(apoaequorin)基因并将其在大肠
杆菌(Escherichia co li )中表达, 孵育其辅基腔肠素
(coelenterazine)后, 重组形成有生物活性的水母发光蛋
白。后来研究发现, 水母发光蛋白是由脱辅基水母发光
蛋白、氧分子和腔肠素 3部分构成。其中脱辅基水母
发光蛋白由189个氨基酸残基组成, 有3个Ca2+结合的
EF 手结构; 腔肠素是一个分子量约为400 kDa的疏水
基团, 它可以自由穿越细胞膜。当 3个Ca2+与水母发
光蛋白结合后, 造成脱辅基水母发光蛋白和腔肠素之间
的共价键断裂, 腔肠素被氧化成coelenteramide并释放
出CO2和1个质子, 同时发出波长为465 nm的蓝色光
(Charbonneau et al., 1985)。这种发光强度与Ca2+浓
度之间呈线性关系, 因此, 能在整体水平上简便而快速
284 植物学报 44(3) 2009
地测定Ca2+浓度的瞬时变化(Knight et al., 1996)。
CBF1(C-repeat-binding factor 1)作为转录因子, 在拟南
芥中属于DNA结合蛋白家族的Apetala2/乙烯反应元件
结合蛋白(AP2/EREBP)(Stockinger et al., 1997), 可以
结合应答冷和脱水反应的DNA调节因子CRT/DRE, 并
增强冷驯化过程中相关基因的表达, 例如应答脱水基因
(responsive to dehydration, RD)、早期应答脱水基因
(early responsive to dehydration, ERD)、冷调节基因
(cold regulated, COR)以及低温诱导基因(low-tempera-
ture induced, LTI) (Zhu, 2001)。Jaglo-Ottosen等
(1998)研究了拟南芥CBF1超表达突变体后, 提出该突
变体是通过上调COR等基因的表达来增强拟南芥抗低
温胁迫能力的。
目前, 对低温信号转导途径的遗传学研究已取得了重
要进展, 发现了许多与之相关的拟南芥突变体(Zhu et al.,
2007)。同时, 细胞内Ca2+浓度的变化已被证明是低温信
号转导通路中的重要环节; 但是, 至今有关植物细胞识别
特异标识(Ca2+ signature)的分子基础并不清楚。因此, 本
研究通过将水母发光蛋白基因转入低温不敏感的CBF1超
表达突变体中, 测定低温刺激时该突变体细胞内Ca2+的浓
度变化, 以实现细胞内Ca2+浓度变化的实时监控, 进而分
析Ca2+信号系统在低温信号转导途径中的位置和作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.) CBF1超表达突变体
及其对照株系由美国密执安州立大学MF Thomashow
教授提供, 生态型是Wassilewskija (Ws)-2。水母发光
蛋白表达载体 pMAQ2和HVA1-2.2由英国牛津大学
H Knight教授惠赠, 农杆菌GV3101由本实验室保存。
SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自TaKaRa公司, Trizol
购自 Invitrogen公司, 腔肠素和M-MLV反转录酶购自
Promega公司, EGTA和 LaCl3购自Sigma公司。
1.2 Real-time PCR分析
将在MS培养基中生长14天的拟南芥幼苗放入4°C光
照培养箱中, 分别处理1、3、6和12小时, 再用Trizol
方法提取RNA。利用M-MLV反转录酶合成第1链cDNA
作为模板, 按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒的说明书
进行real-time PCR扩增, 同时设立负对照。每次加样,
每个模板重复3次。Real-time PCR的程序为: 95°C 60
秒; 95°C 10秒, 57°C 20秒, 72°C 15秒, 40个循环;
Melt曲线从72°C至99°C, 第1步维持45秒, 以后每升
高 1°C维持5秒。每个样品进行3次重复实验。Real-
time PCR使用的仪器为MX3005P(Stratagene)。以
Ubiqui tin 为内参对基因进行相对定量。Real-time
PCR引物: CBF1 Sense, 5-GCATGTCTCAACTT-
CGCTGA-3, CBF1 Anti-sense, 5-ATCGTCTCCTCC-
ATGTCCAG-3; Ubiquitin Sense, 5-ATTACCCGATG-
GGCAAGTCA-3, Ubiquitin Anti-sense, 5-CACAAAC-
GAGGGCTGGAACA-3。
1.3 拟南芥的转化与筛选
使用液氮冻融法(Miao et al., 2006)将水母发光蛋白表
达载体 pMAQ2和HVA1-2.2转入农杆菌GV3101中。
再用花序浸染法(Miao et al., 2006)转化生长4周左右
的拟南芥。然后, 将F1代种子置于卡那霉素平板上进行
筛选, 得到潜在转基因拟南芥, 利用PCR方法鉴定转基
因植株。PCR扩增所用水母发光蛋白基因引物: Sen-
se, 5-ATGACCAGCGAACAATACTCAGT-3; Anti-
sense, 5-TTAGGGGACAGCTCCACCGTAGA-3。
1.4 水母发光蛋白的重组
将生长7-8天的转基因拟南芥幼苗放入蒸馏水中, 加入
腔肠素母液, 使腔肠素的终浓度为2.5 mmol.L-1。室温
避光孵育 16-20小时。
1.5 胞质Ca2+浓度的测定
将孵育过腔肠素的拟南芥幼苗放入盛有100 mL水(室温)
的离心管中, 静置1-2分钟后, 再放入发光光度计中(20/
20n, Turner Biosystems), 记录静息态发光数值(每隔
0.2秒记录1次)。记录20秒后, 迅速加入0.6 mL (0°C)
水, 继续记录其发光值。记录60秒后, 再加入0.6 mL
285张国增等: 低温胁迫下拟南芥CBF1超表达突变体胞质中Ca2+浓度的变化
2 mol.L-1 CaCl2和20%乙醇的混合物, 记录剩余发光
值。保证每个实验记录和处理条件一致。按照下面的
公式计算Ca2+浓度的变化: pCa＝0.332 588 (-log k)
+5.559 3。式中k为速率常数(rate constant), 其值等
于每秒记录的发光数值除以细胞内残存水母发光蛋白的
发光总值(Knight et al., 1996)。
1.6 抑制剂的处理
拟南芥幼苗经腔肠素重组形成具备功能的水母发光蛋白后,
分别加入LaCl3和EGTA (ethylene glycoltetraacetic acid),
使它们的终浓度分别为 10 mmol.L-1和 20 mmol.L-1,
孵育1小时后, 再按照1.5节中Ca2+浓度的测定方法检测
细胞内Ca2+浓度的变化。
2 结果与讨论
2.1 低温处理时CBF1的表达情况
为了研究低温刺激时CBF1本身的表达情况, 使用real-
time PCR对CBF1的表达模式进行研究, 结果如图1所
示。未受胁迫时, CBF1的表达量很低; 低温处理 1小
时后, 其表达开始增强; 随着处理时间的延长, CBF1的
表达量逐渐上升, 到第6小时达到最高, 而后逐渐回落。
说明CBF1不但诱导COR等相关基因的表达, 而且其本
身也受低温的诱导。
2.2 转化水母发光蛋白基因拟南芥的获得与鉴定
为了探索低温处理时CBF1超表达突变体中Ca2+浓度的
变化, 我们将编码水母发光蛋白的载体 pMAQ2 和
HVA1-2.2转入CBF1超表达突变体中, 以获得表达水母
发光蛋白的拟南芥植株(图2)。从图2中可以看出, 转化
水母发光蛋白基因的拟南芥可以扩增出目的片段, 而野生
型拟南芥则不能扩增出相应的条带, 表明水母发光蛋白基
因已被转入拟南芥植株中。
2.3 低温处理时CBF1超表达突变体中Ca2+浓度的变化
利用转入水母发光蛋白基因的拟南芥, 测定低温(0°C)刺
激时其细胞内Ca2+浓度的变化, 结果如图3A所示。低
温刺激可诱导CBF1超表达突变体和野生型拟南芥细胞
内Ca2+浓度的升高。但是, 在CBF1超表达突变体中
Ca2+浓度上升的平均值为(1.69±0.063) mmol.L-1, 而野
生型拟南芥中则仅为(1.43±0.039) mmol.L-1, 统计学分
析显示二者差异显著。可见, 低温刺激时CBF1超表达
突变体细胞内Ca2+浓度增加的幅度大于野生型拟南芥。
为了进一步探索低温刺激时CBF1调节Ca2+浓度增
加的机制, 将HVA1-2.2质粒转入该突变体中, 该质粒表
图 1 CBF1基因在低温胁迫下转录水平的 real-time PCR分析
Figur e 1 Analysis of the transcript levels of CBF1 gene
under cold stress by using real-time PCR
图 2 转水母发光蛋白基因拟南芥的PCR检测
M: 标准样; 1: 野生型; 2-4: 转pMAQ2株系; 5-7: 转HVA1-2.2株
系
Figure 2 PCR analy sis of aequorin gene in transgenic
Arabidopsis lines
M: Marker; 1: Wild-type; 2-4: Transgenic pMAQ2 lines; 5-7:
Transgenic HVA1-2.2 lines
286 植物学报 44(3) 2009
达的水母发光蛋白特异地定位于液泡的胞质面上, 因此
可以检测液泡附近Ca2+浓度的变化(Knight et a l. ,
1996), 结果如图3B所示。低温刺激后CBF1超表达突
变体和野生型拟南芥细胞内Ca2+浓度的变化基本一致,
突变体内 Ca 2 +浓度增加的平均值为( 1 .3 2±0.0 36)
mmol.L-1, 野生型为(1.29±0.068) mmol.L-1。经统计
学分析二者差异不显著, 说明低温刺激时CBF1超表达
突变体细胞质Ca2+浓度的变化高于野生型, 且这种差异
与液泡中Ca2+的释放无关。
2.4 低温刺激时EGTA和LaCl3对CBF1超表达突
变体细胞内Ca 2 +浓度变化的影响
为了进一步证实低温刺激时CBF1超表达突变体细胞中
较高浓度Ca2+的来源, 预先用不同的Ca2+信号抑制剂
处理拟南芥。EGTA作为一种金属离子螯合剂, 能螯合
细胞壁的Ca2+, 并能阻止Ca2+的进入, 从而降低细胞内
游离的Ca2+浓度。使用浓度为20 mmol.L-1的EGTA
处理拟南芥后, 再检测低温刺激时细胞内Ca2+浓度的变
化, 结果如图 4A和图 4B所示。从图中可以看出, 用
EGTA处理后, 无论是在野生型还是在CBF1超表达突
变体中Ca 2 +浓度的峰值均明显下降; 其中野生型的
Ca2+浓度从未处理时的(1.43±0.039) mmol.L-1下降到
(0.898±0.079) mmol.L-1, CBF1超表达突变体则从
(1.69± 0.063) mmol.L-1下降到(1.01±0.039) mmol.L-1
(图4C)。LaCl3是细胞质膜上Ca2+通道的抑制剂, 可以
阻止Ca2+的跨膜运输。用 10 mmol.L-1的 LaCl3处理
拟南芥, 得到的结果与用EGTA处理的结果类似(图4D,
E), 在野生型和CBF1超表达突变体中的Ca2+浓度分别下
降到(0.761±0.094) mmol.L-1和(0.81±0.086) mmol.L-1
(图4F)。EGTA和LaCl3不仅抑制了低温刺激时细胞内
Ca2+浓度的升高, 而且在CBF1超表达突变体和野生型
的胞质中Ca2+浓度基本下降到同一水平(图4C, F)。
2.5 讨论
目前, 对于低温信号转导的研究主要集中在2个方面。
(1) 通过筛选突变体, 寻找低温信号转导途径的中间成分
(Jaglo-Ottosen et al., 1998; Chinnusamy et al., 2006;
Dong et al., 2006); (2) 研究低温刺激时植物体内Ca2+
浓度的变化(Knight et al., 1996)。目前尚未见关于
Ca2+浓度的变化与低温刺激表型相联系的报道。为了
建立Ca2+ 标识与低温信号转导的关系, 我们选取了低温
不敏感的CBF1超表达拟南芥突变体, 检测了低温刺激
时其细胞内Ca2+浓度的变化。
当植物受到外界环境刺激时, 细胞内Ca2+的浓度将
会上升。不同刺激引起的细胞内Ca2+浓度的变化幅度
及动力学特征有所不同, 这种Ca2+ 标识被视为不同刺激
引起的不同最终反应(Knight et al., 1998)。植物受到
图 3 低温刺激引起拟南芥CBF1超表达突变体(CBF1-OX)细胞
内Ca2+浓度变化的动力学曲线
(A) 细胞质中Ca2+浓度变化曲线; (B) 液泡附近Ca2+浓度变化曲
线
Figure 3 Kinetic changes of the cold-induced [Ca2+] in CBF1
overexpression (CBF1-OX) mutant plants
(A) The conc entration of cytosoli c free calc ium ([Ca2+]cy t)
enhancement; (B) The concentration of calcium adjacent to the
vacuolar membrane ([Ca2+]md) enhancement. Mean values ± SE
are given in the text
287张国增等: 低温胁迫下拟南芥CBF1超表达突变体胞质中Ca2+浓度的变化
低温刺激后, 细胞内Ca2+浓度会迅速升高, 无论是在冷
敏感植物, 还是冷不敏感植物中这种现象普遍存在
(Knight et al., 1996)。Ca2+浓度的变化触发了下游许
多应答反应。CBF1超表达突变体具有更强的抗冷性
(Jaglo-Ottosen et al., 1998)。那么该突变体在感知低
温刺激时其Ca2+标识是否与野生型存在差异？我们利
用农杆菌介导法, 将水母发光蛋白基因转入CBF1超表
达突变体中, 检测了低温刺激时植物体内Ca2+浓度的变
化情况。结果显示, 低温刺激时CBF1超表达突变体细
胞质中的Ca2+浓度变化幅度高于野生型, 而在液泡附近
二者Ca2+的浓度变化相似(图3), 表明CBF1超表达突变
体能够调节胞质中Ca2+浓度的上升, 同时也暗示低温刺
激时该突变体中Ca2+浓度升高与液泡中Ca2+的释放无
关。用Ca2+螯合剂EGTA和质膜Ca2+通道抑制剂LaCl3
处理拟南芥后, 发现CBF1超表达突变体和野生型细胞
质中的Ca2+浓度升高均被抑制, 并且最终Ca2+浓度变
化两者趋于一致(图4C, F)。说明低温刺激时, CBF1超
表达突变体与野生型拟南芥细胞内Ca2+浓度变化的差
异可能与细胞外的Ca2+进入细胞有关。
Ca2+作为植物体内一种保护性物质, 其浓度的升高
有利于低温胁迫时植物的生存, 究其原因是质膜被认为
是低温伤害的首要位点(Thomashow, 1999; Uemura et
al., 2006), 而Ca2+能够使质膜绷紧, 从而减少细胞中溶
质的渗漏, 同时使质膜具有更强的疏水性, 因此能够增强
图 4 EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid)和 LaCl3对低温刺激下拟南芥CBF1超表达突变体(CBF1-OX)(B), (E)和野生型(WT)(A),
( D )细胞内[Ca2+]cy t变化的影响
(A)、 (B)、 (D)和(E)图中显示了一条代表性曲线; (C)与(F)分别表示EGTA和 LaCl3处理时拟南芥细胞内Ca2+浓度变化的平均值
Figure 4 Effects of EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid) and LaCl3 on cold-shock induced [Ca2+]cyt transients in CBF1
overexpression mutant (CBF1-OX) (B), (E) and wild-type Arabidopsis thaliana (WT) (A), (D)
A representative curve is shown in (A), (B) and (D), (E); (C) is the average [Ca2+]cy t achieved per seedling in (A) and (B); (F) is the
average [Ca2+]cy t achieved per seedling in (D) and (E). Mean values ± SE are given in the text
288 植物学报 44(3) 2009
质膜的稳定性、细胞的完整性和对胁迫的抗性(Plieth,
2001)。如果除去质膜中的Ca2+就会削弱质膜的稳定
性(Hirschi, 1999)。因此, CBF1超表达突变体较野生
型具有更强的耐冷性, 可能与低温刺激时该突变体细胞
内较高的Ca2+浓度有关。
通过分析CBF1超表达突变体与Ca2+信号系统的关
系, 可以确定低温信号传递至细胞核引起基因表达变化
过程中Ca2+的调控位点, 利用这些结果可以进一步建立
Ca2+在冷胁迫信号转导中的时空作用模式, 为阐明低温
信号转导机理奠定坚实的细胞学和遗传学基础。
致谢 英国牛津大学 H Knight教授为本研究提供
pMAQ2和 HVA1-2.2质粒。美国密执安州立大学MF
Thomashow教授提供CBF1超表达拟南芥突变体种子。
英国杜伦大学MR Knight教授为本研究提供技术支持。
在此表示感谢。
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289张国增等: 低温胁迫下拟南芥CBF1超表达突变体胞质中Ca2+浓度的变化
Intracellular Ca2+ Changes During Cold Stress in CBF1-
overexpress Arabidopsis
Guozeng Zhang, Ling Bai, Chunpeng Song*
The Laboratory of Plant Stress Biology, Department of Biology, Henan University, Kaifeng 475001, China
Abstract Plant growth is greatly affected by low temperature. Cold shock elicits an immediate increase in free Ca2+ concentration
in plant cells. Here, we focused on the expression of CBF1 under low temperature treatment and the cold-triggered Ca2+ responses
in CBF1-overexpressing Arabidopsis. CBF1 was induced by low temperature. To address the relation between CBF1 and Ca2+, we
measured cold-triggered Ca2+ responses in CBF1-overexpressing Arabidopsis. CBF1-overexpressing plants exhibited a higher
mean peak Ca2+ concentration than did wild-type plants, but the Ca2+ signature adjacent to the vacuolar membrane increased to
similar levels in both plants. In Arabidopsis seedlings pretreated with EGTA or LaCl3, the cold shock-induced increase of Ca2+
concentration was inhibited. The cytoplasmic Ca2+ concentration in CBF1-overexpressing and wild-type plants decreased to the
same level. Thus, the results suggest that Ca2+ is involved in the process of the CBF1 response to low-temperature signal
transduction, and the CBF1-overexpress may enhance freezing tolerance of plants by increasing the cytoplasmic free Ca2+
concentration.
Key words aequorin, Arabidopsis thal iana, calcium, CBF1, cold stress
Zhang GZ, Bai L, Song CP (2009). Intracellular Ca2+ changes during cold stress in CBF1-overexpress Arabidopsis. Chin Bull Bot 44,
283-289.
* Author for correspondence. E-mail: songcp@henu.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)