全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (3): 332-336, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-11-26; 接受日期: 2008-01-27
基金项目: 广东省自然科学基金(No. 5005912)和广东省科技计划项目(No. 2005B20901014)
*通讯作者。E-mail: pengjz@scnu.edu.cn
.技术与方法.
琼脂糖印迹法: 观察植物表皮细胞的一种简易方法
吴杰, 梁敏婷, 王小菁, 彭建宗 *
华南师范大学生命科学学院, 广州 510631
摘要 本文介绍一种获得完整植物器官表皮细胞大小和数目的简易方法: 琼脂糖印迹法。该方法根据琼脂糖凝固时具有可
塑性的原理, 通过对材料固定、包埋、切胶和显微观察等步骤从而获得材料表皮细胞的轮廓。该方法具有简单迅速、图像清
晰、观测结果准确且应用广泛等优点, 可使统计植物发育过程中细胞数目及大小的工作变得简单易行。
关键词 琼脂糖印迹, 细胞大小, 表皮细胞
吴杰 , 梁敏婷 , 王小菁 , 彭建宗 (2008). 琼脂糖印迹法: 观察植物表皮细胞的一种简易方法. 植物学通报 25, 332-336.
在植物发育过程中, 细胞的大小和形状对植物形态
建成具有重要的贡献(Kim and Sinha, 2003; Guimil and
Dunand, 2006)。目前, 对植物叶的形态发生与发育的
研究较多, 并在叶形态决定的细胞学基础理论方面提出
了不同的观点。物种决定理论(Kaplan and Hagemann,
1991)认为, 遗传信息对叶形状的决定独立于细胞大小、
形状及分裂的遗传控制, 但是这种理论无法解释一些实
验现象及结果。而 Tsukaya(2003)提出的细胞决定理
论, 则认为细胞是生物体的基本单位, 也是器官发生和形
态建成的单位, 细胞的形状和行为决定了叶的形状。这
种理论强调, 叶的最终形状是细胞学水平各种状态的叠
加, 并在原有细胞理论的基础上增加了新内容, 认为细胞
的状态和行为之间存在着相互影响, 特别是叶细胞数量
和体积相互补偿。因此, 研究植物发育过程中细胞数目
和大小的变化对阐明植物发育过程中的细胞学基础理论
具有十分重要的意义。
在细胞学、育种学以及植物生理学的研究过程中,
经常需要测定叶下表皮气孔的分布、形状和大小等数
据。许多研究者会直接撕取植物材料的表皮制成临时
装片, 在显微镜下观察, 但是这种方法对有些植物材料来
说并不能取得很好的观察效果, 例如对于一些幼嫩的材
料就很难撕取到完整的表皮。另外一种常用的方法是
印迹法, 即在植物叶的表面涂抹火棉胶(或牛皮胶液)和醋
酸纤维素胶液等, 还有人利用指甲油(Ferris and Tayler,
1994; 林月惠, 1996; Berger and Altmann, 2000)和乒
乓球制液(张秀芳等, 2002), 胶体风干后凝成薄膜, 此膜
就印有表皮组织各细胞的界迹边痕及气孔结构。该种
方法的优点是胶膜干燥速度快, 缺点是薄膜太薄, 在取下
的过程中薄膜易拉伸变形, 背景反差较小, 摄影效果也不
佳。在测定水稻叶片气孔密度时, 董克(1989)采用水浸
火棉胶膜并在显微镜下直接观察, 得到了长期保存的水
稻叶气孔制片。但是这种方法比较繁琐, 耗时较长。此
外, 还有人利用透明胶带粘取叶片表皮(陈佰鸿等,
2003)。Hor iguc hi 等(2006)还发明了一种凝胶干燥
法, 该方法利用琼脂糖凝固、溴酚蓝染色、干燥, 观
察材料部分表皮细胞。本文在对各种方法进行比较
的基础上, 探索出一种获取植物表皮细胞大小和数目
数据的新方法。
1 材料和方法
1.1 材料
非洲菊 (Gerbera hybrida Hore)的舌状花花瓣、蓝猪耳
(Torenia fournieri L.)的花瓣和叶、水稻 (Oryza sativa
333吴杰等: 琼脂糖印迹法: 观察植物表皮细胞的一种简易方法
L.)的茎和叶、高粱(Sorghum b icolor L.)的叶、拟南
芥 (Arab idops is thaliana L. )的茎和叶以及蝴蝶兰
(Phalaenopsis amabil is L.)的叶。非洲菊花瓣P1-P6
分期参考Meng 和 Wang (2004)。
1.2 方法
1.2.1 固定
采用福尔马林 -醋酸 -乙醇固定液 (formalin acetic ac id
alcohol solution, FAA)。固定时间可以根据植物材料
的幼嫩程度做相应调整, 一般固定 24 小时。
FAA的配方为: 90 mL 50% 或 70% 乙醇 + 5 mL
冰醋酸 +5 mL 福尔马林 (37%-40% 甲醛)。
1.2.2 包埋
称取 1.5 g琼脂糖 (Bio Basic Inc.公司产品) 溶于 100
mL ddH2O中, 滴入 3-5滴 1% 番红乙醇染液(或 1%孔
雀石绿染液)使琼脂糖着色, 反复煮沸 2-3次, 使琼脂糖
完全溶解。取 1张粘有双面胶的滤纸, 将从固定液中取
出的材料, 用吸水纸吸干水分后粘固在双面胶上展平, 放
入培养皿中。将冷却至 50-60°C的琼脂糖倒入培养皿
中, 淹没材料即可, 静置待其凝固(图 1)。
1.2.3 制片
将培养皿倒置取出琼脂糖凝胶, 切取含拓痕的凝胶, 将拓
痕面朝上放置在载玻片上, 在显微镜 (OLYMPUS-BX51)
下观察并导入 DP Control ler系统拍照。
2 结果与分析
2.1 琼脂糖印迹法与其它方法的比较
火棉胶印迹法、透明胶带粘取表皮细胞和用镊子撕取
表皮制片法是目前观察植物表皮细胞和气孔变化最常用
的方法。但每种方法都有其不足之处, 对于较幼嫩的植
物材料而言, 用镊子撕取表皮细胞难度较大, 并且很难得
到完整的表皮组织; 火棉胶印迹法虽然能一次得到材料
的整个表皮轮廓, 但由于火棉胶具有挥发性而不易保存,
且对人体有害, 同时在操作过程中容易拉伸变形, 使结果
失真; 透明胶带粘取表皮轮廓虽然简单快捷, 但对于一些
幼嫩的植物表皮就很难得到清晰的图片。而琼脂糖印迹
法则是一种在火棉胶印迹法的基础上改良后的新方法。
从表 1和图 2可以看出, 琼脂糖印迹法与徒手撕取
表皮法获得的植物表皮细胞大小接近, 经过DPS数据分
析, 不存在显著差异, 表明琼脂糖印迹法所得到的植物表
皮细胞数据有较好的保真性。所以, 利用琼脂糖印迹法
是可行的。此外, 从图 2中我们还可以看出, 徒手撕取
表皮法得到的图片虽然可以显示细胞轮廓及部分细胞器,
但是由于表皮上不可避免地会粘附一些叶肉细胞, 从而使
得图片比较模糊; 而琼脂糖印迹法得到的图片中细胞轮廓
清晰, 有利于测定细胞大小及细胞的数目。 所以, 琼脂
糖印迹法对于研究植物器官发育过程中细胞大小及数目
的变化是可行的, 并且具有简便、清晰和保真的优点。
表 1 琼脂糖印迹法与徒手撕取表皮法获得的表皮细胞大小比较
Table 1 Comparison of cell size betw een agarose-blotting
and peeled epidermis
Cell length (mm) Cell w idth (mm)
Agarose-blotting epidermis 161.17±18.59** 22.39±1.66**
Peeled epidermis 156.14±23.56** 22.64±1.50**
每组样品测定1 000个细胞。** 无极显著性差异
1 000 cells w ere measured for cell length or cell w idth. ** No
signif icantly diff erent
图 1 琼脂糖印迹法示意图
1: 培养皿; 2: 琼脂糖; 3: 植物材料; 4: 含材料表皮印迹的琼脂; 5:
载玻片
Figur e 1 Illustration of agarose-blotting
1: Culture vessel; 2: Agarose; 3: Plant mater ial; 4: Agarose
w ith blotting; 5: Microscope slide
334 植物学通报 25(3) 2008
图 3 琼脂糖印迹法观察不同植物材料的表皮细胞
(A) 高粱叶片上表皮; (B) 水稻叶片上表皮; (C) 拟南芥叶片上表皮; (D) 拟南芥叶片下表皮; (E) 拟南芥茎表皮; (F) 蝴蝶兰叶片上表皮;
(G) 蓝猪耳叶片上表皮; (H) 蓝猪耳花瓣上表皮; ( I) 非洲菊P6舌状花上表皮
Figur e 3 Observation of epidermal cells from diff erent plants by us ing agarose-blotting
(A) A daxial epidermal cells of Sorghum bi color leaf ; (B) A daxial epidermal cells of Oryza sativa s sp. indica leaf ; (C) A daxial
epidermal cells of Arab idopsi s thal iana leaf ; (D) A baxial epidermal cells of Arab idopsi s thali ana leaf; (E) Epidermal cells of
Arab idops is thal iana stem; (F) A daxial epidermal cells of Phal aenopsi s amabi li s leaf ; (G) A daxial epidermal cells of Toreni a
fournier i leaf; (H) A daxial epidermal cells of Toreni a fournier i petal; (I) A daxial epidermal cells of Gerbera hybrida petal (per iod 6)
图 2 非洲菊舌状花表皮细胞观察
(A) 徒手撕取表皮法; (B) 琼脂糖印迹法; (C) 火棉胶印迹法
Figur e 2 Epidermal cells of rf petal in Gerbera hybr ida observed by dif ferent methods
(A) Peeled epidermis; (B) A garose-blotting; (C) Collodion-blotting
335吴杰等: 琼脂糖印迹法: 观察植物表皮细胞的一种简易方法
2.2 琼脂糖印迹法的适用性
除了非洲菊的花瓣之外, 本文还利用琼脂糖印迹法对其
它植物不同器官的表皮细胞进行了观察。
从图 3可以看出, 无论是单子叶植物高粱、水稻、
蝴蝶兰还是双子叶植物拟南芥、蓝猪耳、非洲菊都可
以用琼脂糖印迹法来获得并观测植物表皮细胞的形态
和大小。此方法不但适用于叶片, 还适用于花瓣和茎
等器官的表皮细胞观测。此外, 对于一些幼嫩的植物
器官, 如早期的花瓣等也都可以通过琼脂糖印迹法得到
清晰的表皮细胞轮廓。
3 讨论
琼脂糖印迹法操作过程中应该注意以下 2点。首先, 根
据不同的研究目的选择不同的固定液, 同时根据材料的
年龄确定固定时间的长短。常用的固定液有: 福尔马
林 -醋酸 -乙醇固定液(FAA)、福尔马林 -丙酸 -乙醇固
定液 (formalin propionac id ethanol, FPE)、乙醇 -醋
酸 -氯仿固定液(卡诺固定液(carnoy fixat ive))和铬酸 -醋
酸 -福尔马林混合液等。其中 FA A 固定液既可固定植
物的一般组织, 又可作为保存液, 是一种较常用的固定
剂。一般来说, 材料表面如果有较厚的蜡质层, 则应先
除蜡后再固定, 而较幼嫩的植物材料固定时间应相应减
少。其次, 琼脂糖一定要反复煮沸 2-3次, 使之完全溶
解, 煮沸后应先冷却到 50-60°C, 再倒到材料上。如果
琼脂糖凝胶温度过高会使植物材料变形。倒胶时注意
不要倒得太厚, 刚刚淹没材料即可。
除以上提到的几种方法外, 研究植物细胞大小和数
目的方法还有许多, 如石蜡切片、超薄切片、扫描电
镜以及 Confocol和 Probit方程拟合分析法(钱伯林和程
水源, 1995)等。石蜡切片及超薄切片等方法一般适合
于观察植物切面组织的细胞, 且仅适用于研究动植物器
官的某一部位细胞。虽然采用扫描电镜及激光共聚焦
扫描显微镜观察幼嫩组织的细胞比较有效并可以观察整
个器官组织细胞, 但是这些方法操作难度大、程序复杂
且对仪器设备要求较高; Probit 方程拟合分析法是利用
参数对发育过程中细胞变化的一种模拟分析, 并不能真
实反映细胞变化。相比之下, 琼脂糖印迹法具有设备简
单、操作方便、快捷、真实性强、图像清晰和便于
测量统计等优点, 为定量统计植物细胞大小和数目提供
了简单实用的观测技术, 并且这种方法普遍适用于单子
叶植物和双子叶植物, 可以测定花、叶和茎的表皮细
胞。但是, 如果植物器官过于幼嫩, 表皮细胞过于微小
(如长度仅为3 mm左右的非洲菊舌状花 P1期花瓣), 用
该种方法很难得到理想的结果。另外, 琼脂糖印迹法也
有局限性, 它只适用于对表皮细胞大小和形状的观察, 不
能观察到细胞的内部结构特点, 如细胞器和色素等。
参考文献
陈佰鸿 , 李新生 , 曹孜义 , 姚庆荣 (2003) . 一种用透明胶带粘取叶
片表皮观察气孔的方法. 植物生理学通讯 40, 215-218.
董克 (1989). 水稻气孔测试的几种方法. 沈阳农业大学学报 20, 167-
169.
林月惠 (1996). 气孔复型法. 植物杂志 (4), 39-39.
钱伯林 , 程水源 (1995). 银杏种实生长过程细胞发育的研究. 湖北
农学院学报 15, 214-215.
张秀芳 , 石东里 , 张兰 (2002). 观察植物气孔结构的简易方法. 生
物学通报 37, 42-42.
Ber ger D, Altmann T (2000). A subtilisin- like serine protease
involved in the regulation of stomatal density and distribution in
Arabidopsis thal iana. Genes Dev 14, 1119-1131.
Ferris R, Tayler G (1994). Stomatal characteris tics of four na-
tive herbs f ollow ing exposure to elevated CO2. Ann Bot 73,
447-453.
Guimil S, Dunand C (2006). Patterning of Arabidopsis epidermal
cells: epigenetic factors regulate the complex epidermal cell
fate pathw ay. Trends Plant Sci 11, 601-608.
Hor iguchi G, Fujik ura U, Ferjani A, Ishikawa N, Tsukaya H
(2006). Large-scale histological analysis of leaf mutants us-
ing tw o simple leaf observation methods: identif ication of novel
genetic pathw ays governing the s ize and shape of leaves.
Plant J 48, 638-644.
Kaplan DR, Hagem ann W (1991) . The relationship of cell and
organism in vascular plants. Biosci ence 41, 693-703.
Kim M, Sinha N (2003) . Regulating shapes and sizes. Dev Cell
4, 441-447.
Meng X, Wang X (2004). Regulation of f low er development and
anthocyanin accumulation in Gerbera hybrida. J Hortic Sci
336 植物学通报 25(3) 2008
Agarose Blotting: a Simple Way to Observe Plant Epidermal Cells
Jie Wu, Minting Liang, Xiaojing Wang, Jianzong Peng*
Co lle ge o f L ife Sci ences, So uth Chi na Normal Uni versity, Guan gzho u 5 106 31, Chi na
Abstr act We describe a new method, agarose blotting, used to detect epidermal cell size and number of plant organs. With this
method, clear images of epidermal cell shape can be observed through several s teps of f ixation, agarose embedding, and agarose
cutt ing by using the plasticity of agarose. This method is easy to use, saves time, is w idely applicable and produces accurate
results w ith a clear pic ture, in compiling statist ics of cell size and number dur ing the process of plant development.
Ke y w ords ag aro se b lot tin g, cell si ze, ep ide rmal ce ll
Wu J, Lia ng MT, Wa ng XJ, Peng J Z (200 8). Aga rose b lot ting : a si mpl e wa y to o bse rve pla nt epi dermal cel ls. Ch in Bull Bo t 25 , 33 2-
33 6.
* Author for correspondence. E-mail: pengjz@scnu.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)
Biotechnol 79, 131-137.
Tsukaya H (2003). Organ shape and s ize: a lesson f rom
studies of leaf morphogenesis . Curr Opin Plant Biol 6, 57-
62.
2008年全国植物生物技术专题讲座
中国科学院植物研究所将于 2008年6月4-7日举办“全国植物生物技术”专题讲座。本讲座由中国科学院植物研究所
主办, 文献与信息管理中心学术交流与培训部承办。
本次讲座主题：生物技术是当今科技史中发展速度最快的高新技术, 如何将各种分析手段运用到研究工作中。为满足
研究工作者的需求, 帮助研究生及年轻的研究人员了解并掌握现代生命科学的最新进展, 现定于2008年6月在北京中国科学
院植物研究所举办“全国植物生物技术”专题讲座, 讲座内容涉及细胞工程、植物次生代谢工程、转基因工程、生物安
全评估、植物原位杂交技术和植物显微技术等几个方面。邀请的专家均是多年从事本领域研究的老专家, 也有近年来脱颖
而出的年轻科学家。
举办本次讲座的目的是为了使从事生物工程的同仁们扩大知识面, 开阔科学研究思路。欢迎相关领域的研究人员和研究
生届时参加。
联系地址: 北京市海淀区香山南辛村 20号 中国科学院植物研究所文献中心学术交流与培训部 邮编: 100093
电话: 010-62836216; 传真: 010-82598261; E-mai l: hs q50@ibcas.ac.cn