全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (4): 452-458, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-09-18; 接受日期: 2007-01-05
基金项目: 宜昌市科技发展计划项目(No. A04401-8)
* 通讯作者。E-mail: yuechaoyin@163.com
.实验简报.
不同调控序列作用下 GUS基因在烟草中瞬时表达活性
谢伟, 乐超银*, 郭政宏, 戴志鹏, 刘敏, 姚伟
三峡大学生物技术研究中心, 宜昌 443002
摘要 以pBI121为出发质粒, 利用烟草泛素启动子Ubi.U4、CaMV35S启动子以及Kozak序列构建4种GUS基因表达载体,
通过叶盘转化法转化烟草叶片, 检测瞬时表达活性, 研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用。结果表明: CaMV35S启
动子附加Kozak序列后使GUS活性比独立使用CaMV35S提高了近2倍; 双CaMV35S启动子附加Kozak序列驱动GUS基因的
表达活性与单CaMV35S附加Kozak序列相当; 烟草泛素启动子附加Kozak序列的表达活性为CaMV35S启动子附加Kozak序
列的1.5倍; Ubi.U4-CaMV35S复合启动子附加Kozak序列驱动GUS基因表达水平最高, 其表达效率是双CaMV35S启动子附
加Kozak序列调控下GUS表达效率的3倍, 为CaMV35S独立作用时的10倍。
关键词 GUS分析, Kozak 序列, 转基因烟草, 瞬时表达, 序列泛素启动子
谢伟, 乐超银, 郭政宏, 戴志鹏, 刘敏, 姚伟 (2007). 不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性. 植物学通报 24, 452-458.
启动子是决定外源基因转录效率的关键因素, 选择
合适的启动子对于增强外源基因的表达量至关重要。
目前广泛应用的组成型启动子CaMV35S启动子, 它在
单子叶植物和双子叶植物中都有较高效率的表达。但
Chen 等(1998)将水稻CHITINASE基因转入小麦后发
现, 使用CaMV35S作为启动子时, 转入的植株到第2代
时CHITINASE全部表现出基因沉默, 而使用玉米泛素
Ubi-1启动子时, 在第 4代时, 该基因的表达量仍然较
大。泛素(ubiquitin, Ub)是一种由76个氨基酸构成的多
肽, 是泛素蛋白酶体途径的重要组成部分, 植物生长发育
的很多方面受泛素蛋白酶体介导的蛋白降解途径的调控
(宋素胜和谢道昕, 2006)。利用泛素启动子在细胞体内
持久而高水平的转录调节作用, 将其整合至附加型的载
体中, 可获得高水平的表达系统。因而在转基因植物中,
泛素启动子有很大的应用潜力。目前, 已经从很多泛素
基因中分离得到启动子序列, 包括玉米基因组中的Ubi-
1启动子(Christensen and Quail, 1996)、水稻泛素
RUBQ2启动子(Wang et al., 2000)、拟南芥泛素启动
子(Norris et al., 1993)、向日葵泛素 UbB1启动子
(B ine t e t a l . , 1991)、烟草泛素 Ubi .U4 启动子
(Genschik et al., 1994)、马铃薯泛素 Ubi7启动子
(Garbarino and Belknap, 1994)、番茄泛素Ubi1-1启
动子(Hoffman et al., 1991)和大麦泛素Mub1启动子
(Causing and Jensen, 1990)。玉米泛素Ubi-1启动子
已经广泛地应用于玉米、小麦和水稻等单子叶植物中
(Chen and Rubenstein, 1991; Christensen et al., 1992;
Chen et al., 2001; 侯文胜等, 2002; 范媛媛等, 2004)。
烟草泛素启动子也有应用于双子叶植物中的报道
(Genschik et al., 1994; Kang et al., 2003)。另外, 根
据Kozak (1986)提出的真核生物偏好的转移起始密码子
周边序列, 许多研究报道起始密码子的周边序列做相应
修改, 可提高外源基因的表达量。例如, 张琦等 (2006)
将Kozak序列导入油菜中进行表达分析, 叶片中的脂肪
酸分析结果表明目的脂肪酸g-亚麻酸和十八碳四烯酸的
含量均获得相应提高。
本研究用烟草泛素启动子 Ubi.U4、CaMV35S启
动子以及Kozak序列构建了4个GUS基因表达载体并
转化烟草叶片, 比较不同调控序列对GUS基因瞬时表达
的调控作用, 为建立更高效、稳定的烟草表达系统打下
基础。
453谢伟等: 不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性
1 材料和方法
1.1 材料、菌种、试剂及设备
烟草(Nicotiana toabcum cv. ‘NC89’)由本实验室保存并
繁殖。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 DH5a、根癌
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105及出发质
粒 pBI121等均由本实验室保存。限制性内切酶、T4
DNA连接酶等购自 Promega公司。PCR反应相关试
剂和胶回收试剂盒购自上海生物工程公司, PCR反应中
所用引物的合成与克隆的基因序列的测定亦委托该公司
进行。电激仪采用 Bio-Rad公司生产的GenePulser
Xcell电穿孔仪。
1.2 实验方法
1.2.1 Ubi.U4 启动子片段的克隆　
根据GenBank (X77456)烟草泛素启动子核苷酸序列设
计合成 2对 PCR引物。一对引物两端均为 HindIII, 另
一对引物含 HindIII和 BamHI酶切位点如下。
Ubi.U4-1: 5引物5GCGCAAGCTTACTACGTTA-
G A G C G C T A A C G A G A A T 3 ( H i n d I I I )
Ubi .U4-1: 3 引物 5CGAAGCTTTGGTCGGG-
T G G G A T T C C C T C T T T A T C C T G G A 3
Ubi.U4-2: 5引物 5CGCAAGCTTACTACGTTAG-
AGCGCTAACGAGAATACT3. Ubi.U4-2: 3引物
5CGCGGATCCTGGTCGGGTGGGATTCCCTCTTTAT3
(BamHI)。
采用以上引物, 以烟草(NC89)基因组DNA为模板,
通过PCR 扩增得到Ubi.U4启动子片段, 与pMD18-T连
接, 然后对扩增片段进行测序。
1.2.2 Kozak序列的构建
根据Kozak原则, 设计一段富含AT的序列, 以GUS基
因为模板设计引物 , 在上游引物前附加一段
“TAAACCATGGCT”序列, 并设计BamHI酶切位点, 下
游引物引入Sac I酶切位点: (BamHI)
gusk 5引物 5CGGGATCCTAAACCATGGCT-
ATGTTACGTCCTGTAGAAAGGAAG
gusk3引物 5CGCAGTACTTCATTGTTTG-
CCTCCCTGCTGC (Sca I)
PCR扩增得到附加 Kozak序列的 GUS基因, 与
pMD18-T连接, 然后对扩增片段进行测序。将得到的
片段通过BamHI/ ScaI位点置换出发质粒pBI121中的
GU S 基因, 即可得到插入 K ozak 序列的表达载体
pSKG。
1.2.3 表达载体的构建
将以上克隆得到的 U b i . U 4 启动子片段, 分别通过
HindIII/ BamHI位点以及HindIII位点插入含有Kozak序
列的 pSKG中, 构建含Ubi.U4启动子附加Kozak序列
的表达载体pUKG, 以及含Ubi.U4-CaMV35S串联启动
子附加Kozak序列的表达载体pUSKG; 通过HindIII位
点, 在pSKG上的CaMV35S启动子之前再插入一个340
bp左右的CaMV35S启动子, 即可得到双CaMV35S启
动子附加 Kozak序列的表达载体 pSSKG。
1.2.4 烟草的遗传转化
将植物表达载体 pBI121、pUKG、pUSKG、pSKG
及pSSKG分别通过电激法(杨明等, 2000)导入根癌农杆
菌EHA105中。分别挑取含表达载体pBI121、pUKG、
p U S K G、p S K G 和 p S S K G 的根癌农杆菌菌落及
EHA105菌株(不含任何表达载体的空菌株)菌落, 28°C
培养过夜。离心收集菌体, 用 1/2MS液体培养基稀释
至OD600值为 0.5作为浸染液(张娅等, 2005)。将 4-5
叶期的无菌培养烟草叶片剪成0.5 cm2的小块, 分别在
4种菌液中浸染5-10分钟后, 吸干叶片表面的菌液, 重
置于共培养培养基(MS+0.05 mg.L-1 NAA+0.5 mg.L-1
6-BA)上暗培养24小时后, 取出各组叶片进行瞬时表达
检测。
1.2.5 GUS基因瞬时表达活性检测
取上述6种菌液浸染的烟草叶片各5组, 每组随机选取
10片进行组织染色。选取组织染色阳性率较高组的叶
片各 0.1 g, 加入 200 mL GUS提取 buffer (50 mmol.
L-1磷酸(pH7.0), 10 mmol.L-1 EDTA, 10 mmol.L-1
454 植物学通报 24(4) 2007
b-巯基乙醇, 0.1% Triton X-100, 0.1%十二烷基肌氨酸
钠)提取叶片总蛋白(王关林和方宏筠, 1998)。采用荧光
分析法(Jefferson et al., 1987)测定GUS活性, 以单位
时间内单位蛋白产生4-methlumbelliferone(MU)的量比
较各启动子对GUS基因表达的影响。取 5组数据的平
均值作为本次实验的结果。实验设 3次重复, 取 3次实
验数据的平均值进行比较。
2 结果与分析
2.1 烟草泛素启动子的克隆
以烟草基因组DNA为模板, 在特异引物的作用下扩增得
到一条约 1 200 bp的特异扩增条带(图 1)。将 PCR产
物回收后, 与 pMD18-T 载体连接, 转化DH5a, 提取质
粒并酶切鉴定后进行测序, 结果表明该序列与文献报道
序列(Genschik et al. 1994)的同源性达 100%。
2.2 Kozak序列的构建
以 pBI121为模板, 在含有Kozak序列的特异引物的作
用下进行PCR扩增, 得到一条 1 800 bp的条带(图 2)。
回收PCR产物, 与pMD18-T 载体连接, 将连接物转化
DH5a, 提取质粒并酶切鉴定后进行测序, 结果表明该片
段含有与设计一致的Kozak序列以及序列正确的GUS
基因。
2.3 表达载体的构建
将Ubi.U4启动子片段, 分别通过HindIII/ BamHI位点以
及HindIII位点插入pSKG中, 得到表达载体pUKG和表
达载体 pUSKG; 通过 HindII I 位点, 在 pSKG 上的
CaMV35S启动子之前再插入一个 CaMV35S启动子,
即可得到 pSSKG。其结构见图 3。
2.4 瞬时表达检测结果
分别培养5个表达载体转化的农杆菌菌株以及EHA105
菌株作为对照, 浸染烟草叶片, 转入共培养培养基上暗培
图 1 PCR扩增烟草泛素启动子
M: D2000分子量标准;1-4: Ubi.U4-1引物的扩增产物; 5-8: Ubi.
U4-2引物扩增产物; 9: 阴性对照
Figure 1 PCR amplified Ubi.U4 promoter
M: D2000 marker; 1-4: PCR products amplified by promoter Ubi.
U4-1; 5-8: PCR products amplified by promoter Ubi.U4-2; 9:
negative control
图 2 PCR扩增含 Kozak序列的GUS基因
M: D2000分子量标准; 1: gusk引物的扩增产物; 2: 阴性对照
Figure 2 PCR amplified GUS gene with Kozak sequence
M: D2000 marker; 1: PCR products amplified by gusk; 2: nega-
tive control
455谢伟等: 不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性
养24小时。组织染色结果显示, 5个表达载体转化的农
杆菌浸染率均达到100%(图4)。提取各组叶片总蛋白,
采用荧光分析法测定 GUS活性。比较 5种组合驱动
GUS表达的活性, 结果(表1)显示, 5个表达载体转化的
烟草叶片中均检测到GUS荧光活性, 对照组未检测到荧
光活性。GUS表达量由高到低依次是pUSKG>pUKG>
pSSKG>pSKG>pBI121。
从表 1和图5可以看出: (1)CaMV35S启动子附加
Kozak序列后使GUS活性比独立使用CaMV35S提高
了近2倍; (2)双CaMV35S启动子附加Kozak序列驱动
GUS基因的表达活性与单CaMV35S附加Kozak序列
相当; (3)烟草泛素启动子附加Kozak序列的表达活性为
CaMV35S启动子附加Kozak序列的1.5倍; (4)由烟草
泛素启动子Ubi.U4与CaMV35S启动子串联使用附加
Kozak序列驱动下的GUS基因的表达效率最高, 其表
达效率是双 CaMV35S启动子附加 Kozak序列调控下
GUS表达效率的 3倍, 为 CaMV35S独立作用时的 10
倍。由此可见, 烟草泛素启动子与CaMV35S启动子串
联使用时对烟草外源基因的表达有明显的增强作用。
3 讨论
虽然起始密码子在生物界是通用的, 但是从不同生物来
源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。K oza k
(1986)曾详细研究起始密码子ATG周边碱基定点突变后
对转录和翻译所造成的影响, 并总结出在真核生物中, 起
始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最
表 1 不同启动子调控下GUS基因在烟草叶片中瞬时表达活性
Table 1 GUS activity under the control of different regulatory
sequences in tobacco leaves
GUS plasimid GUS activity (nmol.4-MU.mg-1 protein.min-1)
Leaf(none) 0 e
Leaf(pBI121) 10.12±0.92 a
Leaf(pSKG) 32.34±1.27 b
Leaf(pUKG) 52.82±1.30 c
Leaf(pUSKG) 99.93±3.06 d
Leaf(pSSKG) 35.46±1.12 b
数据为 3组平行实验得出的平均值。根据新复极差法, 在 P=0.05
水平, 具有相同字母的平均值没有显著差别
All data were means of 3 replications each. Means with the
same letters are not significantly different at P=0.05 level ac-
cording to Duncan’s new multiple range test
图 3 利用不同调控元件构建的 5种GUS基因表达载体
35S: CaMV35S启动子; nos: 胭脂碱合成酶基因; Ubi.U4: 烟草泛素启动子; H: HindIII酶切位点; B: BamHI酶切位点
Figure 3 Structure of the vector used for transient expression of GUS gene
35S: CaMV35S promoter; nos: polyadenylation site of nopaline synthase gene; Ubi.U4: ubiquitin promoter; H: HindIII restriction
sites; B: BamHI restriction sites
456 植物学通报 24(4) 2007
图 5 不同启动子调控下 GUS基因在烟草叶片中瞬时表达活性
(NC为阴性对照)
Figure 5 GUS activities under the control of different regu-
latory sequences in tobacco leaves (NC is negative control)
图 4 瞬时表达的组织染色结果
(A) 转化 pBI121的烟草叶片;
(B) 转化 pSKG的烟草叶片;
(C) 转化 pUKG的烟草叶片;
(D) 转化 pUSKG的烟草叶片;
(E) 空菌浸染的烟草叶片.
蓝色斑点表示GUS表达的位点(bar=2 mm)
Figure 4 Histochemical assay with staining buffer containing
0.5 mg.mL-1 X-Gluc
(A) the tobacco leaf containing pBI121;
(B) the tobacco leaf containing pSKG;
(C) the tobacco leaf containing pUKG;
(D) the tobacco leaf containing pUSKG;
(E) the tobacco leaf without expression vector.
The blue colored leaf tissues indicate the GUS expression sites
(bar=2mm)
高, 特别是-3位的 A对翻译效率非常重要。本研究在
G U S 基因之前插入了一段 K o z a k 序列
(TAAACCATGGCT), 结果表明, GUS在烟草中的表达水
平提高约2倍。可见利用非植物来源的基因构建表达载
体时, 根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改
造, 可增强外源基因的表达。
关于转基因烟草启动子的研究已有很多报道, 但是
关于烟草泛素启动子在双子叶植物中的应用报道不多。
Genschik等 (1994)分析了烟草泛素启动子Ubi.U4的结
构, 得出启动子上游的TATA框、转录起始区的一段内
含子序列和泛素第一个单体序列是该启动子的关键元件,
含这些元件的启动子驱动GUS基因在烟草中的瞬时表
达的效率是CaMV35S的7倍。而Kang等 (2003)在研
究利用烟草稳定表达CAT基因时发现烟草泛素启动子
启动 CAT的表达量是 CaMV35S的 2倍。本研究将烟
草泛素启动子 Ubi.U4与 CaMV35S串联使用, 并附加
Kozak序列, 得到较好的表达效果, 其瞬时表达效率是
双CaMV35S启动子附加Kozak序列调控下GUS表达
效率的3倍, 是单独使用CaMV35S启动子的10倍。其
原因可能是来源于双子叶植物烟草的泛素启动子Ubi.U4
对CaMV35S启动子的表达活性有增强作用。同时, 我
们研究了烟草泛素启动子加Kozak序列调控下GUS的
表达, 其效率比CaMV35S启动子附加Kozak序列高约
1.5倍。可见来源于烟草的泛素启动子与Kozak序列在
烟草中具有一定的协同增效表达的作用。
457谢伟等: 不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性
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458 植物学通报 24(4) 2007
Transient Expression of GUS Gene Controlled by Different Regulator
Sequences of Tobacco
Wei Xie, Chaoyin Yue*, Zhenghong Guo, Zhipeng Dai, Min Liu, Wei Yao
Biotechnology Research Center of China Three Gorges University, Yichang 443002, China
Abstract GUS gene controlled by different regulator sequences (CaMV35S promoter, Ubi.U4 promoter and Kozak sequence)
were introduced into the leaves of tobacco. Transient expression assay revealed a 2-fold increase in GUS activity in leaves with
GUS expression driven by the CaMV35S promoter fused to the Kozak sequence (pSKG) as compared with the pBI121. The
expression of GUS driven by a double CaMV35S promoter with the Kozak sequence was not significantly different from that driven
by the single CaMV35S promoter with the Kozak sequence. Expression with the Ubi.U4 promoter with the Kozak sequence of pUKG
yielded about a 1.5-fold higher level of GUS activity than expression with the CaMV35S promoter with the Kozak sequence. The
tandem Ubi.U4-CaMV35S promoter with the Kozak sequence was the most effective among the regulator sequences and gave a
3-fold higher expression level than that driven by the double CaMV35S promoter with the Kozak sequence and a 10-fold higher
expression level than that driven by the single CaMV35S promoter.
Key words GUS assay, Kozak sequence, transgenic tobacco, transient expression, ubiquitin promoter
Xie W, Yue CY, Guo ZH, Dai ZP, Liu M, Yao W (2007). Transient expression of GUS gene controlled by different regulator sequences
of tobacco. Chin Bull Bot 24, 452-458.
(责任编辑: 白羽红)
* Author for correspondence. E-mail: yuechaoyin@163.com