全 文 ：植物学通报 2005, 22 (增刊): 68~74
Chinese Bulletin of Botany
①国家 863计划项目(2002AA211061)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: dxp2001@sina.com
收稿日期: 2004-02-17 接受日期: 2004-08-03 责任编辑: 孙冬花, 白羽红
专 题 介 绍
碱性 7S球蛋白和豆类胰岛素研究进展①
顿新鹏② 陈正望
(华中科技大学生物物理与生物化学研究所 武汉 430074)
摘要 碱性7S球蛋白和豆类胰岛素在豆科植物中广泛存在, 对生长发育起着胰岛素信号通路样调控
作用。碱性7S球蛋白是一个富含半胱氨酸的糖蛋白, 具有酪氨酸激酶活性, 结构上与胰岛素受体有相
似点, 能和胰岛素及胰岛素生长因子Ⅰ和Ⅱ结合。豆类胰岛素含37个氨基酸, 3对二硫桥键, 结构上属
于抑制型胱氨酸结构模体, 某些疏水残基在拓扑结构上和胰岛素存在相似之处, 能调节植物生长。豌
豆胰岛素在象鼻虫(Sitophilus oryzae)、豌豆蚜虫(Acyrthospiphon pisum)和果蝇(Drosophila albomicans)
中发现单一的膜结合位点, 可用作昆虫毒素。文章总结了碱性7S球蛋白和豆类胰岛素在结构和功能上
的研究进展。
关键词 碱性7S球蛋白, 豆类胰岛素, 结构特点, 生理功能
The Progress in the Basic 7S Globulin and Leginsulin
DUN Xin-Peng② CHEN Zheng-Wang
(Institute of Biophysics and Biochemistry, Huazhong University of Science and Technology,
Wuhan 430074)
Abstract Basic 7S globulin and leginsulin are widely distributed in legume species and play a
role in growth and development of legumes by a mechanism similar to the insulin regulatory
pathway in animals. Basic 7S globulin is a cysteine-rich glycoprotein and has tyrosine kinase
activity. It has some structural similarities with human insulin receptor and can bind with insulin
and insulin-like growth factor Ⅰ and Ⅱ. Leginsulin and PA1b are polypeptides consisting of 37
amino acid residues with 6 cysteines in 3 disulfide bridges, both belonging to the cysteine-knot
family. PA1b was the first entomotoxic cysteine-knot peptide identified and found to have a
single binding site in weevil, pea aphid and fruit fly. Magnetic resonance imaging studies showed
topological similarity of critical residues between leginsulin and insulin. Research progress on
the structure and physiological function of basic 7S globulin and leginsulin is reviewed.
Key words Basic 7S globulin, Leginsulin, Structural trait, Physiological function
从1922年胰岛素被发现以来, 人们对多肽
激素作为一种胞外信号分子对动物和酵母各
种生理活动的调节机制已有了深入的了解。
然而, 直到Pearce等(1991)报道系统素(syste-
692005 顿新鹏等: 碱性7S球蛋白和豆类胰岛素研究进展
min)之后, 人们才确信植物中也存在多肽激
素。近 10年对系统素、迅速碱化因子(rapid
alkalinization factor)、植物硫素(phytosul-
fokines)、早期结瘤素(ENOD40)和豆类胰岛
素(leginsulin)等多肽激素及其相关受体的研究
显示, 植物多肽激素同样作为一种重要的信号
分子对植物的生长、发育和防御起着重要的
调节作用(Ryan et al., 2002)。
在这些已发现的植物激素中, 豆类胰岛素
信号通路中首先发现的是碱性7S球蛋白。当
对碱性7S球蛋白的结构和理化特性有了较清
楚的认识之后, 发现它能够结合动物胰岛素, 这
引起了日本研究者极大的兴趣, 并由此发现了
豆类胰岛素。本文主要介绍多年来对碱性7S
球蛋白和豆类胰岛素研究的进展。
1 碱性7S球蛋白
Yamauchi等 (1984) 在大豆(Glycine max)
种子贮藏蛋白中分离出一种新的沉降系数球
蛋白, 含量约占提取总蛋白的3%, 富含半胱氨
酸和甲硫氨酸, 蛋白质分子由4个中间亚基组
成, 每个中间亚基含α和β两种亚基, α和β
亚基之间以二硫键结合。它不与其他大豆球
蛋白产生免疫沉淀反应 , 等电点聚焦后在
pH9.05和pH9.26处出现明显条带(Sato et al.,
1987a), 故被命名为碱性 7S球蛋白(basic 7S
globulin, 7S Bg)。cDNA克隆证实α亚基含
251个氨基酸残基, 分子量为27 kD, β亚基含
152个氨基酸残基, 分子量为 16 kD, 则Bg蛋
白的分子量约为175 kD (Kagawa and Hirano,
1989)。α亚基糖基化, 位于细胞膜的外侧, 含
有一个ATP结合序列、一个富含半胱氨酸的
结构域和一个胰岛素生长因子类结合序列。
β亚基横贯细胞膜两侧, 其COOH端含一个酪
氨酸激酶活性区域。除大豆外 , 豌豆
(Phaseolus sativum)、四季豆(Phaseolus
vulgaris)、绿豆(Phaseolus radiatus)、赤豆
(Phaseolus angularis)、四棱豆(Psophocar-
pus tetragonolobus)、洋刀豆(Canavalia
ensiformis)、豇豆(Vigan sinensis)及羽扇豆
(Lupins angustifolus)等多种豆科作物中都发
现有 Bg类蛋白质的存在(Sato et al., 1987b;
Kagawa et al., 1987)。胡萝卜(Daucus carota)
中与生长素调控相关的表皮糖蛋白(EDPG)也
属于碱性7S 球蛋白一类(Satoh and Fujii, 1988;
Satoh et al., 1992)。因此可以认为Bg类蛋白
质可能是一个蛋白质家族, 广泛存在于豆科植
物和胡萝卜中。Nishizawa等 (1994) 用胶体
金标记的Bg蛋白抗体与细胞内的Bg蛋白反
应后, 在电镜下观察到Bg蛋白位于细胞壁的
中层或原生质膜附近, 这里是传导胞内外信息
比较合适的位置。
研究发现, 所有Bg类蛋白质都与动物胰
岛素或胰岛素样生长因子IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ具
有较高的结合活性(Komatsu and Hirano,
1991)。当用N糖苷酶处理除去Bg蛋白的糖
链后 , α亚基便失去与胰岛素结合的能力
(Komatsu et al., 1994), 表明Bg蛋白可能与胰
岛素受体或 IGF受体有某些相似的功能。序
列比较显示, Bg蛋白与胰岛素受体、IGF-Ⅰ
和IGF-Ⅱ受体氨基酸序列的同源性很低, 分子
量差异较大, 但它们在结构上仍存在着若干相
似点: α亚基位于胞外, 糖基化并有一个识别
和结合胰岛素或IGF的半胱氨酸富含区; β亚
基贯穿质膜, COOH端位于胞内, 存在起传递
激素信息作用的酪氨酸激酶活性域; 都以前体
的形式合成, 合成后切除信号肽, 然后α和β
亚基之间形成分子内二硫键, 再在N段的丝氨
酸残基处将α和β亚基切断, 形成成熟的受体
分子; 都以二聚体的形式与配体结合, 提取的
溶液中则以四聚体的形式存在, 二者的配体豆
类胰岛素和胰岛素都含有3对二硫桥键; 另外,
Bg蛋白α亚基的第41到53的13个氨基酸和
人体中的低分子量胰岛素结合蛋白同源
(Watanabe and Hirano, 1994)。
研究表明, 大豆Bg蛋白酪氨酸激酶活性
70 22(增刊)
大致相当于大鼠胰岛素受体的2/3, 胡萝卜Bg
类蛋白的酪氨酸激酶活性则接近大鼠胰岛素
受体的活性(Komatsu et al., 1994; Watanabe
et al., 1994)。在 57.5～62.5 ℃的范围内, 豆
类种子能迅速释放 Bg类蛋白(Hirano et al.,
1992), 并且实验表明在这个温度范围内有Bg
蛋白的 m R N A 产生和新的 B g 蛋白合成
(Duranti et al., 1994), 因而认为Bg可能和热
休克蛋白一样行使着相同的生理功能。但结
构比较表明Bg蛋白与热休克蛋白的同源性很
低, 而且57.5～62.5 ℃也远远超过热休克蛋白
行使功能的条件, 多数豆类种子在57.5～62.5
℃已不能发芽, 对于Bg蛋白是否在高温时对
豆类植物起保护作用也一直未得到证实。Bg
蛋白的结构特点显示, 它不可能简单的作为贮
藏蛋白为豆子的生长发育提供营养, 那么它究
竟在植物体内起着何种生理功能呢?豆类胰岛
素的发现揭示, Bg蛋白和豆类胰岛素在植物体
内发挥着类似胰岛素信号通路样的生理功能,
对植物的生长发育起调控作用。
2 豆类胰岛素
W a t a n a b e 等 ( 1 9 9 4 )将 B g 蛋白与
Sepharose CL-4B偶联制备成亲和层析柱, 从
大豆种子胚根的提取液中分离出Bg蛋白的配
体, 一个含 37个氨基酸残基、分子量约为 4
kD的多肽, 因动物胰岛素或IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ
能和这个多肽竞争性地与Bg蛋白结合而将其
命名为大豆胰岛素。分子生物学实验表明,
在豌豆、四季豆、绿豆、赤豆、四棱豆、
洋刀豆和羽扇豆等多种豆科作物中都检测到
豆类胰岛素的存在。免疫电镜观察证实, 大
豆胰岛素存在于细胞壁中, 位于Bg蛋白的附
近(Nishizawa et al., 1995)。
根据豆类胰岛素氨基酸序列克隆了豆类
胰岛素的 cDNA, 结果表明这段 cDNA由4部
分组成: 信号肽、豆类胰岛素肽、接头肽以
及一个分子量为 6 kD的多肽(Higgins et al.,
1986; Watanabe et al., 1994)。在豌豆中同时
分离出分子量为 3.7 kD的PA1b(pea albumin
1b, 又称豌豆胰岛素)和分子量为6 kD的多肽
PA1a(pea albumin 1a), 并证明 PA1a和 PA1b
是由同一个前体多肽PA1在翻译后加工形成
的(Higgins et al., 1986)。豌豆、羽扇豆、绿
豆和小豆等种子中豆类胰岛素 cDNA的克隆
表明, 这些豆类胰岛素之间氨基酸序列同源性
都在60%以上(表1) (Yamazaki et al., 2003)。
所有豆类胰岛素分子内都含 6个半胱氨
酸, 位置高度保守, 它们在分子内形成3个二硫
桥键, 对维持豆类胰岛素的结构和功能起重要
作用。NMR对大豆胰岛素的三级结构研究显
示, 它含有3个b折叠: bA, Ala6-Ser8; bB, Cys20-
Pro24; bC, Gly30-His34。bA、顺势的 Pro13与
Ser8-Glu11和Ser17-Cys20两处的b转角形成N
端的环状结构, Gly26-Val29处的b转角, 使得bB
和bC反向平行形成一个b发夹结构并与N端
的环状结构堆积, 3个二硫桥键(C3-C20、C7-
C22和C15-C32)的连接使得这一堆积的三级结
构更加稳定(Yamazaki et al., 2003)。NMR研
究表明PA1b和大豆胰岛素具有相同的空间结
构(Jouvensal et al., 2003), 并且PA1b抗胰酶
消化, 在牛的胃液中能够保持完整的结构, 水
煮后仍能够保持生物活性(Spencer et al., 1988;
Hancock et al., 1994), 正是这种胱氨酸结构模
体使得PA1b的生理活性显得如此稳定。1989
年首次发现这种 6 个半胱氨酸的连接模式
(Heitz et al., 1989), 1993年正式提出“半胱
氨酸结构模体”一词 ( M c d o n a l d a n d
Hendrickson, 1993)。后来的研究发现这种结
构模体在真菌、植物、海洋软体动物、螃
蟹和蜘蛛中广泛存在, 并且肽链氨基酸数目都
在26～48之间。根据其二硫桥键的连接方式
及N端和C端是否连接可分为3种类型: 生长
因子胱氨酸结构模型(growth factor cystine
knot, GFCK)、抑制胱氨酸结构模型(inhibitor
cystine knot, ICK)和环状胱氨酸结构模型
712005 顿新鹏等: 碱性7S球蛋白和豆类胰岛素研究进展
(cyclic cystine cnot, CCK)(Craik et al., 2001)。
豆类胰岛素的3个二硫桥键中C3-C20和C7-C22
形成骨架结构, C15-C32穿透于骨架之中, 属于
ICK结构模型(图1), 具有这一结构模型的多肽
往往具有多种生理功能(Yamazaki et al., 2003;
Jouvensal et al., 2003)。
试验表明, Bg蛋白以二聚体的形式与大豆
胰岛素结合, Kd值为 1.86× 10－ 8m。丙氨酸
扫描发现, 大豆胰岛素中有 13个氨基酸对与
Bg蛋白结合起重要作用, 其中11个氨基酸集
中分布在2个片段: 片段1(Asp2-Ser8)位于N端,
构成 N端的环状结构和 b折叠, 片段 2(Ile25-
Thr36)位于 C端, 构成C端的 b发夹结构。Kd
值测定表明, 片段2对大豆胰岛素与Bg蛋白的
结合更重要。13个氨基酸中的另外 2个氨基
酸Val12和Arg18同样对大豆胰岛素与Bg蛋白
结合起重要作用, 但这2个氨基酸在链中所处
的位置及定位的方向与片段 1和 2完全不同,
二者对与Bg蛋白的结合所起的作用可能完全
不同于片段 1和 2(Hanada et al., 2003)。
大豆胰岛素能和牛胰岛素竞争性地与Bg
蛋白结合, 表明二者在空间结构上可能有某些
相似之处。NMR研究显示, 水溶状态下, 大
豆胰岛素的疏水残基 I le25、Val29、Phe31、
I l e 3 3 和活性状态下胰岛素的 T y r A 1 9、
TyrB16、ValB12和ValA3 4个残基具有相同的
空间结构, 4个疏水残基对与受体的结合起着
重要的作用。同时还发现 , 大豆胰岛素的
L e u 2 7 和 P h e 2 8 也与活性状态下胰岛素的
PheB25和TyrB26具有相同的空间结构, Leu27
和 Phe28可能像胰岛素的 PheB25和 TyrB26一
样, 对与受体结合起方位调节作用(Hanada et
al., 2003)。可以肯定, 豆类胰岛素这些疏水残
基的空间结构对与Bg蛋白的结合并促进磷酸
化有重要作用, 但具体的调节过程还有待进一
步研究。
3 生理功能
3.1 植物激素
体外实验表明, 在含[γ32P]ATP和血管紧
张肽的反应体系中, 1~5 nmol.L-1的大豆胰岛
表1 豆类胰岛素氨基酸同源性
Table 1 Amino acid homology of leginsulin
名称 氨基酸序列
大豆胰岛素 ADCNGACSPFEVPPCRSRDCRCVPIGLFVGFCIHPTG
碗豆胰岛素 ASCNGVCSPFEMPPCGSSACRCIPVGLVVGYCRHPSG
羽扇豆胰岛素 XXXXXXXXXXXIPPCRSSDCRCVPITLIVGFCIHPTG
绿豆胰岛素 ADCNGACSPFQMPPCGSTDCLCIPAGLLFGYCTYPSG
小豆胰岛素 ADCNGACSPFEMPPCGSTDCRCVPIALVGGFCIHPTG
X为未确定的氨基酸 X: Show uncertain amino acid
图 1 豆类胰岛素三级结构示意图
箭头表示β折叠, C-1～6表示从氨基端到羧基端
的半胱氨酸顺序。直线表示二硫键, C3＝C6贯穿
于骨架之中
Fig.1 Tertiary structure of leginsulin
The b-strands are draw as arrows, the cysteine resi-
dues are labeled C-1-6 in order from the N- to C-
terminus and the disulfide bonds are represented as
lines. The penetrating disulfide bond is C3＝ C6,
show in shaded thick line (Craik et al., 2001)
72 22(增刊)
素可使 Bg蛋白的蛋白激酶磷酸化活性提高
50%, 而同样浓度的氧化态大豆胰岛素则没有
激活功能, 与豆类胰岛素分子量相近的人心房
性钠利尿肽(atrialnatriureticpeptide, ANP)也无
促进Bg蛋白激酶磷酸化的效果(Watanabe et
al., 1994), 这暗示豆类胰岛素与动物胰岛素有
相似的功能特征。可能的作用机制为: 豆类
胰岛素与 Bg蛋白位于质膜外的α亚基结合,
并促进质膜内 b亚基的酪氨酸激酶的磷酸化
后, 向细胞内传递调控信号。
外源大豆胰岛素可显著影响胡萝卜愈伤
组织的形态建成, 在含2,4-D的培养基中, 添加
50 mmol.L-1大豆胰岛素后, 愈伤组织分化出大
量的不定芽, 当浓度增加到5 mmol.L-1时, 有
胚状体形成。对照只观察到愈伤组织的增殖,
未见任何器官的分化, 说明大豆胰岛素与植物
生长和分化的调控因子有关。将大豆胰岛素
基因转入胡萝卜愈伤组织中, 也发现愈伤组织
在分化的早期生长迅速。胡萝卜中含 Bg蛋
白, 但不含豆类胰岛素, 外源的豆类胰岛素能
显著影响胡萝卜愈伤组织的形态建成, 表明外
源的豆类胰岛素可以和胡萝卜中的Bg蛋白结
合, 并引发了相应的生理功能。将大豆胰岛
素基因转入鸟脚上的三叶形细胞, 也观察到了
大豆胰岛素对愈伤组织生长的明显促进作用
(Yamazaki et al., 2003)。
3.2 昆虫毒素
在分离纯化豌豆胰岛素PA1b的过程中发
现, 豌豆种子中存在多种PA1b的异体形式, 推
测豌豆基因组中至少有4种不同的PA1b基因
存在 , 都在种子发育过程中特异性表达
(Gressent et al., 2003)。并发现其中分子量为
3.7 kD的多肽能杀死粮食储藏中的害虫——象
鼻虫(Sitophilus oryzae), 表明它可以作为昆虫
毒素使用, 这一研究结果已申请法国专利。
PA1b也属于 ICK结构模型的多肽(Jouvensal
et al., 2003), 具有这种空间结构的多肽都为生
物毒素, 有阻断离子通道、抗病毒和细菌、
杀虫等多方面的生理功能(Craik et al., 2001),
PA1b是这个结构家族中发现的第一个昆虫毒
素。在 5个象鼻虫敏感系、豌豆蚜虫(Acyr-
t h o s p i p h o n p i s u m )和果蝇( D r o s o p h i l a
albomicans)中, 都发现PA1b单一的膜结合位
点, 结合具有高亲和性、饱和性和可逆性。
在有大豆胰岛素存在的情况下, 牛胰岛素还能
竞争性地与Bg蛋白结合, 而牛胰岛素却不能
和这个昆虫体内发现的新受体结合。另一个
与 PA1b具有同源性的大豆胰酶抑制剂 BBI
(bowman-birk inhibitor)也不能与之结合(Kay,
1976), 表明PA1b和这个受体结合的机制不同
于大豆胰岛素和Bg蛋白的结合机制, 这一结
合位点与 PA1b的杀虫作用有着明显的关系,
它对PA1b的识别位点与Bg蛋白对大豆胰岛
素的识别位点在空间结构上可能存在着某些
差异(Gressent et al., 2003)。豌豆粉对仓库谷
物害虫具有排斥作用多有报道(Fields et al.,
2001), PA1b是不同于豌豆中其他蛋白酶抑制
剂的新型杀虫多肽, PA1b的分离获得和杀虫
作用的发现, 为开发无毒副作用的粮食储藏杀
虫剂提供了新途径。
以前发现的属于 ICK结构模型的多肽都
为蛋白酶抑制剂, 大豆胰岛素和豌豆胰岛素在
空间结构上也属于ICK结构模型, 却不具有蛋
白酶抑制功能。大豆胰岛素可调节植物生长,
PA1b可杀虫, 这使 ICK家族又增添了新的生
理功能。同时也表明, 植物多肽激素不仅仅
在植物生长、发育和防御上起重要的调节作
用, 它还可以在其他领域发挥重要的作用, 使
植物多肽激素这一全新的研究领域变得更加
引人注目。
732005 顿新鹏等: 碱性7S球蛋白和豆类胰岛素研究进展
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