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Recent Advances in Conifer Somatic Embryogenesis

松柏类植物体细胞胚胎发生的研究进展



全 文 :植物学通报 2004, 21 (4): 495~505
Chinese Bulletin of Botany
①国家高技术研究发展计划(863)资助项目(No. 2001AA244021)。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: job801218@163.com
收稿日期:2003-09-18 接受日期:2003-11-03 责任编辑:白羽红
松柏类植物体细胞胚胎发生的研究进展①
1,2江 波 1杨映根② 1郭奕明 1郭仲琛 2陈永吉吉
1(中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室 北京 100093)
2(山东大学生命科学学院 济南 250100)
摘要 松柏类植物的体细胞胚胎发生既是繁育的一种手段,又是研究胚胎发育过程中结构、生理和分
子事件的一种重要的模式系统。整个体细胞胚胎发生过程主要包括3个步骤:胚性组织的诱导和增殖、
体细胞胚的成熟以及体细胞胚的萌发和转换。过去为了提高胚胎发育过程所做的努力主要都集中在胚的
成熟阶段,这是因为一直认为能否成功再生的关键在于胚发育成熟阶段的处理。然而,在过去几年里,
结合生理生化以及分子生物学的研究发现,胚胎发生的早期阶段对于完成整个发育过程也是至关重要
的,早期阶段培养条件的优化可以显著提高培养过程中体细胞胚的数量和质量。此外,萌发过程培养条
件的调节对于提高成熟体细胞胚的萌发率和转换率也很重要。因此,这些新的研究成果对于改善松柏类
植物体细胞胚胎发生中的胚的诱导率和转换率低的现象具有重要的意义。
关键词 松柏类植物,胚性组织,体细胞胚,体细胞胚胎发生
Recent Advances in Conifer Somatic Embryogenesis
1,2JIANG Bo 1YANG Ying-Gen② 1 GUO Yi-Ming 1GUO Zhong-Chen 2CHEN Yong-Zhe
1(Key Laboratory of Photosynthesis and Environmental Molecular Physiology, Institute of Botany,
the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093)
2(School of Life Science , Shandong University, Jinan 250100)
Abstract Somatic embryogenesis of coniferous species is used both as a means of propagation and
as a valuable model system for investigating the structural, physiological, and molecular events
occurring during embryo development. The whole embryogenesis is composed of three steps: induc-
tion and proliferation of embryogenic tissue, somatic embryo maturation, and somatic embryo germi-
nation and conversion. In past, attempts for improving the whole embryogenesis procedure were
made almost during the maturation stage, because of the assumption that successful regeneration
would be related to treatments provided during the development of the embryos. However, in the last
several years, studies demonstrated that the early events in embryogenesis were also crucial for the
completion of the overall embryogenic program, implemented by physiological, biochemical, and
molecular studies. Manipulation of the culture conditions early in the process can increase both
number and quality of the embryos. Furthermore, adjusting the medium can also enhance germination
专 题 介 绍
496 21(4)
and conversion frequencies of somatic embryos matured. These new findings are important for
improving induction and conversion frequencies in conifer somatic embryogenesis.
Key words Conifer,Embryogenic tissue,Somatic embryo,Somatic embryogenesis
Durzan和 Chalupa(1976)第一次报道了班克松(Pinus banksiana)离体培养下的类
胚结构,但没有观察到胚的进一步发育。直到 1985年,从挪威云杉(Picea abies)的未
成熟胚中诱导产生了体细胞胚并且获得了再生植株(Chalupa, 1985)。以后,松柏类植物的
体外胚胎发生研究迅速兴起,并取得了很大进展。已有很多物种成功诱导产生了体细胞胚
(Stasolla et al.,2002a; 2002b)。体外胚胎发生是一种很重要的无性繁殖技术,特别对于那
些很难用传统扦插方式来繁育的物种。同时它又可以作为研究胚胎发育过程中不同生物事件的
模式系统(Stasolla et al.,2002a)。然而,松柏类植物的体细胞胚胎发生比其他物种要困
难得多,比如,胚性组织的诱导大多来自于幼嫩的组织(如未成熟的胚); 体细胞胚的成熟及萌
发严格依赖于外植体的基因型;体细胞胚的诱导率和转换率低。因此仍需要进一步的研究。
本文综合最近几年松柏类体细胞胚胎发生的研究进展,按照体细胞胚胎发生的一般程序,
论述了影响体细胞胚胎发生的因素以及提高体细胞胚的质量和转换率的方法。此外,还介绍
了体细胞胚胎发生过程中一些生理生化及分子生物学方面的研究。
1 胚性组织的诱导和增殖
松柏类植物体细胞胚胎发生过程主要包括3个明确的步骤:胚性组织的诱导和增殖;胚的
成熟;胚的萌发和转换成再生植株。但是长期以来大多数研究主要集中在体细胞胚的成熟阶
段。在过去几年里,通过对几个属进行的研究,发现体细胞胚胎发生的早期阶段的调节对于整
个发育过程也起着很重要的作用(Filonova et al.,2000a; 2002b;Bozhkov et al.,2002;
Dyachok et al.,2002)。
1.1 外植体的选择
松柏类胚性组织的诱导严格依赖于外植体的选择。同一植株的不同组织或同一组织的不同
发育阶段对于离体培养条件会有不同的反应。一般来说幼嫩组织的诱导效果较好。目前已经
从未成熟胚、成熟胚、雌配子体和子叶切段中成功地诱导了胚性组织。也有关于从成熟外植
体成功诱导胚性组织的报道。Attree等(1990)从白云杉(Picea glauca)和黑云杉(Picea
mariana)的种子萌发的幼苗中诱导了胚性组织;此外在挪威云杉一年龄的针叶中也实现了成
功诱导(Ruaud et al.,1992),但是诱导效果不如幼嫩组织的好。此外,不同品种间以及
同一品种的不同基因型之间,在诱导胚性组织以及后期的胚胎发育方面也有很大的差异。因
此,选择合适的外植体是松柏类体细胞胚胎发生成功与否的第一步,也是很关键的一步。
1.2 培养基及激素的影响
根据不同的品种在诱导过程中应该选用不同的基本培养基,常用的基本培养基主要有LP、
DCR、LM以及各种改良的MS培养基。松柏类植物的体细胞胚的诱导和增殖一般在同时含较
高浓度生长素和较低浓度细胞分裂素的培养基上进行,常用的生长素是2,4-D和NAA, 细胞分裂
素是 BA和KT。一般来说,2,4-D对于胚性组织的诱导是不可缺少的,但在胚性组织的增殖
阶段,应该及时的去掉或降低 2,4-D浓度,这样既有利于胚性组织的增殖,而且对后期的胚
胎发生也有好处。
4972004 江 波等:松柏类植物体细胞胚胎发生的研究进展
在胚成熟之前一般会有顶端分生组织的发育,早期阶段应该优化培养条件从而发生适合的
组织分化。Fischer-Iglesias和Nauhaus(2001)提出了生长素在合子胚的发育过程中的重要性。当
在甘蓝型油菜(Brassica napus)的合子胚发育的球形胚阶段加入生长素转运抑制剂TIBA时,会
阻止对称性的形成,进而抑制苗顶端分生组织的形成。这个研究表明生长素在胚的组织分化
中是一个重要的决定因子。如果在松柏类的体细胞胚胎发生过程中也有相同现象的话,那么
在进行 ABA处理之前,对于生长调节剂的调节会影响体细胞胚的质量。
此外,培养基中涉及到的其他因子,如 pH值、糖以及含氮量等,也会影响胚性组织的
产生。胚性组织的继代可以采用固体或液体的方式,但不管采用哪一种方式,定时继代对于
整个胚胎发育过程都很重要。一般地,固体培养继代周期为 2~3个星期,液体培养则每隔 7
天换液一次。
1.3 成熟时期的选择
一般在增殖培养基培养一段时间后,就要转入成熟培养基上进行体细胞胚的诱导和发育。
但是具体选择什么时间对胚性组织进行成熟诱导,会在很大程度上影响体细胞胚的数量和质
量 。
Filonova等(2000a)在挪威云杉体细胞胚胎发生的研究中发现,增殖中的胚性组织经过3个
连续的发育阶段,分别称作原胚团Ⅰ(proembryogenic massⅠ,简称 PEMⅠ)、原胚团Ⅱ
(PEMⅡ)和原胚团 Ⅲ(PEM Ⅲ)。原胚团Ⅰ是由小液泡化的细胞聚合体和一个大液泡化细胞
的胚柄共同组成;原胚团Ⅱ以相似的方式聚合,有2 ~3个大液泡化细胞的胚柄;原胚团Ⅲ阶
段细胞聚合体进一步扩大,形成多个大液泡化细胞的胚柄。不同时期的原胚团对ABA的反应
不同,原胚团Ⅰ和原胚团Ⅱ在加入ABA后不能够发育,只有原胚团 Ⅲ在ABA的诱导下可以
进一步发育成体细胞胚(Filonova et al.,2000a; 2000b)。因此,很多品种不能够产生大量的发
育良好的体细胞胚,一个可能的原因就是原胚团 Ⅲ的数量太少或者是其结构畸形造成的。
Filonova等(2000b)研究发现原胚团 Ⅲ的数量可以在继代培养过程中增加,在继代第
3天时为 32%,而在第 6天时增加到 47%。Bozhkov等(2002)在挪威云杉的研究中发现胚性组
织在进行ABA处理之前,先在无激素的培养基中培养几天,可以使成熟体细胞胚的数量增加
5~10倍。去除液体培养基中的生长素和细胞分裂素可以显著提高未成熟胚的数量,约占悬浮
培养总数的 75%。从以上的研究中不难发现,从原胚团到体细胞胚的过渡是一个很关键的发
育步骤,在很大程度上会影响成熟胚的数量。因此,在转入成熟培养基之前,选择合适的
时期,以及了解影响和调节这个过渡时期的因子,都具有重要的意义。
在原胚团向体细胞胚的转化过程中一个很重要的生物事件是细胞的程序性死亡。Filonova
等(2000b)在挪威云杉体细胞胚胎发生的不同阶段,用DNA片段原位探测的方法研究发现了
原胚团细胞进行了大量的程序性死亡。而且还观察到产生的体细胞胚的数量和原胚团进行程序
性死亡的细胞数量成正比。另外,Bozhkov等(2002)也发现抑制细胞程序性死亡的处理会导致
体细胞胚数量的降低。
1.4 其他因子
另外一些影响因子, 如阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)和几丁质酶, 也会影响胚发育的早期
阶段。Egertsdotter和Arnold(1995)观察到挪威云杉的胚性组织可以分为两类:一类具有大的胚
性头部,在加入ABA后可以产生体细胞胚;另一类胚性头部小且结构紊乱,在加入ABA后
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不能够发育。当将前一类中提取的阿拉伯半乳聚糖蛋白加入到后者中后,发现后一类的胚性
头部的形态发生改变并转化成可以继续发育的胚性组织。除AGPs外,几丁质酶在胚的发育中
也具有重要的作用。从灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(Dyachok et al.,2002)以及
从高胚性培养物的预培养基中(Mo et al.,1996)提取的外源几丁质酶对体细胞胚的早期阶
段有刺激作用。但其作用机理仍不清楚。
2 体细胞胚的成熟
离体培养下的松柏类体细胞胚的成熟过程起始于体细胞胚的发育,终止于萌发前的干化处
理。成熟诱导时一般需要改变培养基中的激素成分,用ABA代替增殖培养基中的生长素和细
胞分裂素,从而实现胚的发育。这种生长调节剂的改变是发育转折期的一项重要措施,对于
成功完成胚的发育具有重要的意义(Bozhkov et al.,2002)。完整的成熟过程,胚必须实
现“形态”和“生理”两方面的成熟。如果达不到一定的生理指标,则形态上完整的体
细胞胚并不能够保证后期正常的胚胎发育。体细胞胚的成熟一般在固体培养基中实现,但也
有报道用液体培养基的(Gorbatenko and Hakman,2001)。
体细胞胚与合子胚的胚胎发生环境有很大的不同,需要在离体培养条件下重塑与体内相似
的环境,以提高成熟阶段胚的数量和质量。主要通过ABA和AgNO3的调节、乙烯合成的控
制、渗透压的改变以及干化处理来实现。
2.1 ABA对体细胞胚成熟的影响
Kong等(1997)报道了裸子植物的种子发育过程中有内源ABA水平的变化,并发现发
育中的种子的内源 ABA水平高于体细胞胚。因此,要在离体条件下实现体细胞胚的正常生
长,必须加入外源 ABA以弥补其自身含量的不足。不同品种以及同一品种的不同基因型之
间,在诱导体细胞胚成熟时所需的ABA浓度有很大的不同。例如,在红云杉(Picea rubens)
中需要相对高的外源ABA(40 mmol.L-1)来维持正常的发育,抑制早熟萌发(Harry and
Thorpe,1991),而在白云杉和黑云杉中,胚的生长则需要较低的 ABA(12 mmol.L-1)
(Attree et al.,1990)。
A B A 处理后的几个小时内就会诱导快速的生理变化,但其作用机理一直不很清楚。
Ashihara等(2001)通过研究胚发生过程中核苷酸合成的变化提出了加入外源ABA后抑制了
细胞的增殖,但刺激了胚的生长。Ashihara等(2000)通过标记嘌呤代谢中间物肌苷、腺
嘌呤和腺苷进行跟踪实验,阐述了白云杉的胚性组织可以通过补偿机理来合成嘌呤核苷酸,当
将组织转入含 ABA的成熟培养基中后,这种补偿作用就会显著下降。
ABA处理会引起氮源代谢的普遍变化,进而发生贮藏物的积累和多胺的合成。加入ABA
后,谷氨酸、谷氨酰胺以及精氨酸的浓度都有增加。ABA诱导这些氨基酸的积累对于发育
中胚的贮藏蛋白的合成具有重要意义,组织化学研究发现胚胎发生中贮藏物的积累是一个很重
要的事件。
ABA处理引起的另一个生理变化便是多胺的合成。多胺是一类低分子脂肪含氮物,细胞
中主要有腐胺、精胺、亚精胺和尸胺等,与体细胞胚胎发生密切相关。将辐射松(Pinus
radia ta)胚性组织转至含 ABA的成熟培养基几天后,就可以测出亚精胺合成急剧增加
(Minocha et al.,1999)。多胺在被子植物胚胎发生中的作用一直很受关注。例如,在胡
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萝卜中,精氨酸脱羧酶抑制剂降低了多胺的水平,进而阻碍了胚的进一步发育,加入外源多胺
就可以恢复胚的生长(Feirer,1995)。松柏类体细胞胚胎发生中可能也存在相似的调节。例
如,白云杉的胚性品系的内源亚精胺的含量比非胚性的要高得多(Santanen and Simola,
1 9 9 2)。
ABA处理还会引起抗坏血酸(Vc)代谢的变化。在白云杉的体细胞胚胎发生中,当将
胚性组织转入成熟培养基后, 观察到抗坏血酸(还原态)/脱氢抗坏血酸(氧化态)的比值
急剧增加(Stasolla and Yeung,2001)。抗坏血酸的作用机理仍不清楚,可能影响发育中
胚的有序生长。Meinhard等(2002)提出了ABA效应与氧化还原态之间的可能联系,但仍
需要进一步的研究。
2.2 AgNO3对体细胞胚成熟的影响
在许多植物的组织培养中都有关于Ag+影响体细胞胚胎发生的报道。Ag+对体细胞胚胎发
生的作用在被子植物和裸子植物中可能具有相似的效果。 杄在白 (Picea meyeri)体细胞胚
成熟中,附加 5 mg.L-1 AgNO3可使体细胞胚的数量显著增加(杨金玲等,1997)。但作用的
机理一直存在争议。大体上有以下两种观点:①认为AgNO3是作为乙烯合成的抑制剂而起作
用的(Purnhauser et al.,1987);②认为 Ag+并非直接抑制乙烯合成,而是由于 Ag+的存在,
乙烯不能干扰多胺的合成,Ag+可以通过促进多胺的合成而提高体细胞胚胎发生的频率(崔凯
荣等,1993)。当然其确切的作用机制仍需进一步研究。
然而,A g + 提高体细胞胚胎发生的频率并非绝对的。J a i n 等(1 9 9 5)在北美云杉
(Pesudotsuga sitchensis)体细胞胚胎发生的研究中发现,若在诱导胚性愈伤组织的培养基中
附加AgNO3,不但使胚性愈伤组织诱导频率明显降低,而且会影响其中的胚性胚柄团进一步
发育为成熟胚。Cho和 Kasha(1989)认为,植物组织中内源乙烯的含量会影响体细胞胚胎
发生,当植物组织中内源乙烯生成速率过高时,AgNO3可以通过抑制乙烯合成而促进体细胞
胚胎发生;若内源乙烯生成速率过低,AgNO3对体细胞胚胎发生则起明显的抑制作用。因此
AgNO3浓度应该根据具体的材料作相应的选择。
2.3 乙烯对体细胞胚成熟的影响
合子胚中存在较高浓度的 ABA,与其相反,乙烯在合子胚中的含量则要低得多。在离
体培养条件下则观察到较高浓度的乙烯存在。通常认为乙烯是一种气体生长调节剂,对体细
胞胚胎发生具有负面效应,影响了胚的数量和质量。
在胚的发育过程中的一个很重要的事件就是苗的顶端分生组织的分化(Yeung and
Stasolla,2000)。在体细胞胚中也存在苗的顶端分生组织区,但没有合子胚中的明显,
且较小(Y e u n g e t a l .,1 9 9 8)。已经在很多属中,如云杉属(P i c e a)和落叶松属
(L a t r i x),报道了发育不好的苗顶端分生组织是由于大的胞间气隙空间造成的(v o n
Aderkas et al.,1995;Wilson and Thorpe,1995)。这种胞间气隙空间的形成是乙烯积
累的结果。Kong和 Yeung(1995)发现这种发育不良的胚不能够形成再生植株,但是当
加入乙烯合成抑制剂氨基乙基乙烯基甘氨酸(AVG)时,则可以提高苗顶端分生组织结构
的有序化,进而促进后期胚胎发育。其他研究结果也证实了这个结论(El Meskaoui et al.,
2000)。因此,寻找有效降低离体培养条件下乙烯的合成对于提高发育过程中胚的数量和
质量具有重要的意义。
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2.4 渗透剂对体细胞胚成熟的影响
发育中的种子一个很重要的特征就是具有较低的渗透值。要想在离体培养的条件下模拟与
合子胚相似的环境,就必须加入一些外源的物质从而改变其渗透压。最早用来提高离体培养
条件下水分胁迫的方法是加入高浓度的糖和盐。然而,象蔗糖、盐以及甘露醇这些低分子量
的物质可以透过细胞质膜被共质体吸收,使得细胞的渗透值得到恢复,达不到水分胁迫的目
的。因此就选用了高分子量的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖作为代替物,可以产生长时间的水
分胁迫,效果较好。
很多研究还证实了在成熟培养基中同时使用ABA和PEG有利于体细胞胚的数量和质量的提
高。例如,Attree等(1995)研究发现 PEG可以抑制白云杉胚的早熟萌发,使子叶期体细
胞胚的数量提高了3倍,同时还提高了对干化处理的耐受力。PEG还有利于一些细胞内含物的
积累。Attree等(1992)首次报道了 PEG对脂质的刺激作用,他发现 PEG可以使胚的三酰
甘油含量提高 9倍,脂肪酸的含量达到了合子胚的水平。PEG也可以刺激蛋白质的合成。与
单独使用ABA相比,ABA和PEG结合使用可以使蛋白质的含量提高3倍 (Misra et al.,1993)
虽然很多情况下PEG比蔗糖更有利于体细胞胚胎发生,但是也有相反的情况存在。例如,
Klimaszewska等(1997)在研究北美落叶松(Larix laricina)时发现单独使用 PEG不能促
进体细胞胚的生长和发育,相反出现了早熟萌发。只有在单独使用蔗糖以及蔗糖和 PEG同时
使用时才能够观察到一些胚的正常发育。同时,最近 Iraqi和 Tremblay(2001)也阐述了蔗
糖可以刺激云杉胚的发育。这些研究结果表明蔗糖除了作为碳源之外,可能还具有一些其他
的重要作用,有待于进一步的研究。
2.5 干化处理对体细胞胚成熟的影响
体细胞胚在成熟培养基上培养一段时间后,已经达到了“形态”上的成熟,但是这样
的胚如果没有经过一段干化处理,是不能够转换成植株的。这种干化处理可以使胚达到“生
理”上的成熟。Hay和 Charest(1999)在综述中将体细胞胚干化的方法分为部分干化和完
全干化。选择哪一种方法是严格依赖于成熟过程中的渗透条件。一般地说,部分干化是有限
的、逐渐的使水分丧失,它在低渗透的条件下有利于提高体细胞胚的转换率,而完全干化则
是快速的且剧烈的使水分丧失,它只有在高渗透压的环境下才能够发挥作用。
Roberts等(1990)第一次报道了部分干化的方法。他们发现将云杉胚进行一段干化处理
后可以提高后期的胚胎发育,大大的缩短了萌发的时间,在处理第 7天达到了最大的水分丧
失,处理第 16天可以达到最大的转换率(90%以上)。不同的品种所需要的处理时间不同,
应该仔细的试验从而确定最好的干化时间,获得最大的转换率。
部分干化处理会引起一些重要的生理生化变化。Kong和Yeung(1995)在研究白云杉时
发现,与成熟胚相比,部分干化处理后的体细胞胚具有较低的内源ABA水平,同时ABA的
敏感度也有所下降。此外,在挪威云杉和落叶松体细胞胚胎发生过程中也观察到干化处理时
内源 ABA水平降低的现象(Find,1997;Dronne et al.,1997)。干化期间除了 ABA下
降之外,乙烯的合成也有所降低。干化处理时 ABA和乙烯合成的下降,可能对于胚的萌发
有促进作用。
部分干化处理还引起了核苷酸和核酸代谢的变化。Stasolla等(2001a)报道了部分干化
处理的白云杉的体细胞胚可以产生大量的嘌呤和嘧啶核苷酸,同时承担腺嘌呤向AMP转化的
5012004 江 波等:松柏类植物体细胞胚胎发生的研究进展
腺嘌呤磷酸核糖基转移酶,以及承担尿嘧啶向UMP转化的尿嘧啶激酶都有提高。这些高活性
的酶对合成萌发期间所需的大量的核苷酸起作用(Stasolla et al.,2001b)。
以上所列举的部分干化处理都是在低渗透条件下,有利于提高胚的转换率。但是在高渗
透条件下,如 PEG存在时,则不利于胚胎的发育。例如,PEG处理过的白云杉(Kong and
Yeung,1995)和挪威云杉(Find,1997)的体细胞胚,在部分干化后的转换率较低。
完全干化是与部分干化不同的一种干化处理的方法。它造成的水分丧失比较强烈。一般
是将胚放在饱和的盐溶液中进行处理(Hay and Charest,1999)。Attree等(1991)报道
了完全干化处理使得体细胞胚的水分含量低于合子胚。发育过程中加入PEG-4000可以使胚的水
分含量降低至 45%,再进行完全干化后使水分进一步下降至 32%以下。这种完全干化的体细
胞胚的转换率很高。
完全干化需要胚在成熟期间进行高渗透处理。Attree和 Fowke(1993)认为成熟期间的
高渗透处理可能会引起胚的贮藏物的积累,使得胚在完全干化所造成的严重水分丧失的情况
下,仍然能够继续发育。此外,Roberts等(1990)研究发现没有进行 PEG处理的云杉体
细胞胚在进行完全干化处理后不能够存活。
3 胚的萌发和植株再生
松柏类体细胞胚的萌发和转换是一种相互依赖的关系。萌发一般指根的产生及延长,但
却不一定会有苗的生长。而转换则是指根系和苗系的同时生长,以及通过这种过程实现植株
的再生。因此植株再生的成功不仅仅依赖于萌发过程。成熟体细胞胚的萌发及转换成再生植
株一般在无激素的培养基中实现。待萌发苗长到一定大小后进行移栽实验,观察其成活率。
关于调节萌发过程中的培养条件来提高转换率的研究不多。萌发期间根的生长要求的条件
不是很严格,相同的条件下有根的生长却不一定有苗的生长(Yeung and Stasolla,2000)。
但是要想提高转换率,就必须促进萌发期间的苗的有序生长。研究发现云杉成熟胚在萌发期
间苗极的顶端分生组织存在大的胞间气隙,阻碍了苗的生长。但是当加入外源抗坏血酸时,
可以促进新的叶原基的形成和苗的生长(Stasolla and Yeung,1999)。抗坏血酸的作用机理
仍然不是很清楚。Stasolla等(2001b)在抗坏血酸处理过的萌发胚中,发现嘌呤核苷酸的
合成能力大大的加强,特别是ATP的含量丰富。这可能对于保证萌发时苗的顶端分生组织的
生长和细胞分裂是必需的。
4 松柏类体细胞胚胎发生的分子生物学研究
4.1 体细胞胚胎发生过程中相关基因的克隆
在被子植物,开展了大量的关于体细胞胚胎发生的分子机理的研究,而松柏类植物的体
细胞胚胎发生的许多研究主要集中在结构以及生理和生化方面。分子生物学方面的研究报道较
少。从目前已经克隆和鉴定的 cDNA文库中,主要存在两种与胚发育密切相关的基因:一种
是类病程相关蛋白基因,表达的产物主要为几丁质酶和葡聚糖酶,它们在发育的起始阶段表
达较低,在发育的丝状胚阶段和子叶胚阶段中表达上升(Dong and Dunstan,2000);另
一种是胚胎发生晚期丰富蛋白和热激蛋白基因(Dong and Dunstan,1997)。
Stasolla等(2003)在研究白云杉的体细胞胚胎发生过程中 2 000多个基因的转录水平时
发现,在胚的早期阶段有将近200个基因差异性表达,而随着进一步发育这种差异性表达逐渐
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减少。这个研究表明了在胚性过程的早期阶段存在很大的调控空间,也进一步证实了前期培
养条件调控的重要性。
前面已经论述了苗极分生组织的形成和结构对于体细胞胚发育的重要性。在拟南芥
(Arabidopsis thaliana)中已经克隆了好几个对苗顶端分生组织形成和保持的基因(Lenhard
and Laux,1999)。在松柏类中可能也存在相似的调控基因。在白云杉中克隆的 ZWILLE和
SCARECROW基因,发现与拟南芥中决定苗极形成的基因同源。且发现提高体细胞胚质量的
处理会提高这些基因在胚胎发生早期的表达水平(Stasolla et al.,2003)。
从以上的研究发现克隆胚胎发生中特定时期表达的基因具有重要的意义,既可以进一步阐
述体细胞胚胎发生的不同生物事件的分子机理,而且这些基因又可以作为一种“分子标记”
来筛选细胞系的胚性潜力以及转基因产物(Stasolla and Yeung,2003)。
4.2 松柏类植物的转基因技术
转基因技术作为一项新兴的现代生物技术,发展十分迅速。通过转基因技术可以将特定
外源基因导入植物细胞基因组中,使该基因在植物细胞中获得有效表达和稳定遗传,从而达
到作物或林木的定向改良,创造新品种。目前许多松柏类植物,如云杉属、松属和落叶松
属等的体细胞胚性培养物都已成功地进行了基因转化。迄今,被考虑进行林业树种遗传改良
的性状有:除草剂抗性、开花或育性的降低、抗虫性、抗旱性以及木材质量等(Yanchuk,
2 0 0 1)。
常用的转基因方法主要有基因枪法(即将包裹在微小的金属颗粒上的DNA利用高速轰击
技术导入细胞核)和利用带有特定目的基因的微生物载体法(主要是利用发根农杆菌和根癌
农杆菌)。
目前,人们多采用标记基因,如 GUS、NPTII和 HPT等来研究松柏类的基因转化,以
期望找到合适的转化程序,优化基因转化的各种条件和参数。真正能在生产上应用的目的基
因的成功转化很少有报道。Shin等(1994)曾用发根农杆菌介导法,将抗虫基因 Bt和抗除
草剂基因 AROA转入欧洲落叶松(Larix decidua),获得了转基因植株,外源基因得到稳定
的表达。但由于松柏类的生长周期长,营养生长期也相对较长,使得对外源基因表达的监测
较为困难,因此基因转化方面的研究进展比较缓慢。
5 结束语
在过去十几年里,松柏类植物的体细胞胚胎发生的研究进展较快,其体细胞胚的发育过
程已经比较清楚,各个培养阶段培养条件的优化对于整个胚胎发育非常重要。但长期以来所
做的努力主要集中在胚的成熟阶段。主要探讨了ABA、渗透剂以及干化处理对于胚成熟的影
响,不同的干化方法所要求的渗透条件不同。此外还探讨了胚的结构,如苗顶端分生组织,
与所做的处理密切相关,并会影响产生的体细胞胚的质量和数量。过去几年的研究提出了早
期阶段的调控对于胚胎发生也很重要,另外萌发条件的调节可以大大降低畸形胚的数量,对
于提高体细胞胚的产量具有重要意义。总的来说,由于松柏类植物体细胞胚胎发生研究起步
较晚,所以仍然有很多问题亟待解决。如一直对于早期阶段和萌发期培养条件的忽视,使得
这方面的研究信息较少;生理生化以及分子生物学方面的研究不多,从而很多机理仍然模糊
不清。因此今后还需要在这些方面进行深入的研究,以期进一步提高松柏类体细胞胚胎发生
5032004 江 波等:松柏类植物体细胞胚胎发生的研究进展
过程中体细胞胚的数量和质量。
参 考 文 献
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