全 文 ：植物学通报 2006, 23 (4): 356~362
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2006-02-06; 接受日期: 2006-04-06
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: whitewater7006@163.com
.实验简报.
一品红苞片花色素的分离及初步鉴定
王长泉1* 魏小兵2
(1 山东理工大学生命科学学院 淄博 255049) (2 山东理工大学分析测试中心 淄博 255049)
摘要 用紫外-可见光分光光度计、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)技术对一品红(Euphorbia
pulcherrima)红色苞片中的花色素提取液进行了初步鉴定。一品红花色素的甲醇溶液分别在270、340 和
520 nm 处有 3 个吸收峰; 在 440 nm 吸光度与可见光最大吸收波长 520 nm 吸光度的比值 为0.29; 花色素
的甲醇溶液中加入AlCl3后发生红移, 再加入HCl后发生蓝移; 色素溶液在紫外光下无荧光; 色素样品经液
相色谱分离后在 270 nm检测有 5 个比较明显的吸收峰; 质谱中得到 595、611、381、571 和 589 等对应
的分子离子峰; 花色素酸解液高效液相色谱图谱和鼠李糖、葡萄糖的出峰时间一致。由这些结果可推断
一品红花色素样品中主要含有 5 种组分: 矢车菊花色素芸香苷、飞燕草花色素芸香苷、飞燕草花色素苯
甲酰基葡糖苷、矢车菊花色素苯甲酰基葡糖苷和一种未知成分。
关键词 一品红, 花色素, 紫外-可见光分光光度计, 液相色谱, 质谱
The Extraction and Primary Identification of Anthocyanidin in
Euphorbia pulcherrima
Changquan Wang1, Xiaobing Wei2
(1 College of Life Science, Shandong University of Technology, Zibo 255049)
(2 Test and Analysis Center, Shandong University of Technology, Zibo 255049)
Abstract Anthocyanidins in Euphorbia pulcherrima were extracted and identified by use of UV-vis
spectrophotometry, high performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS).
Anthocyanidin extract in methanol showed 3 absorption peaks, at 270, 340 and 520 nm, in the UV-vis
spectrum, with bathochromic and hypsochromic shift with methanol+AlCl3 and methanol+AlCl3+HCl,
respectively; the ratio of the absorbance at 440 nm to that at 520 nm was 0.29. No fluorescence
occurred under UV irradiance, and 5 absorption peaks occurred at 270 nm after HPLC. Five molecular
ion peaks (m/z) occurred on MS: 595, 381, 611, 587 and 571, respectively, and monosaccharides in the
extract were identified as rhamuose and glucose on HPLC. These results suggest that anthocyanidin
in E. pulcherrima mainly include cyanidin 3-rutinoside, delphinidin 3-rutinoside, cyanidin 3-
benzoylglucoside, delphinidin 3-benzoylglucoside and an unknown component.
Key words Euphorbia pulcherrima, anthocyanidins, UV-vis spectrophotometer, HPLC, MS
一品红(Euphorbia pulcherrima)属大戟科,
大戟属, 又名象牙红、圣诞红、猩猩木, 原产
中美洲及墨西哥地区。一品红的花虽有完整
的生殖器官——雌蕊和雄蕊, 但却没有绚丽的花
冠(即无花被)。虽然花本身并无多大观赏价
值, 但在花序形成之前, 枝梢顶部先后长出10多
3572006 王长泉 等: 一品红苞片花色素的分离及初步鉴定
枚鲜红似火的苞片, 分外醒目, 为北方地区圣诞
节、元旦和春节的优良观赏花卉。在我国南
方一品红还可以作为草坪点缀和庭园栽植, 具有
较高的经济价值。另外, 一品红属典型的短日
照植物, 花色素含量的变化与光周期有关, 可以
通过人为控制光周期, 使一品红根据需要提前或
延迟“开花”, 因而一品红是研究光调控花色
素合成的良好材料。
花色素(anthocyanidin)是一类广泛存在于
植物体中类黄酮类天然色素, 一般以糖苷的形式
积累于细胞的液泡内。近年来的研究表明: 花
色素不仅在植物受粉、种子散布和保护植物
免受紫外线损伤、抗病、抗虫、进化等方面
具有重要的生物功能, 而且还可以体外清除自由
基, 具有很强的抗氧化能力, 在医学上已证明对
血液循环失调、肝机能障碍、心血管、癌症
和艾滋病等疾病具有一定的疗效(Harborne and
Williams, 2000; 方忠祥和倪元颖, 2001; Kong et
al., 2003; Stingtzing and Carle, 2004)。花色素在
同一种植物的不同发育时期、不同器官、甚
至同一器官的不同部位的表达不同, 具有明显的
时间和空间特异性, 而且花色素合成基因表达的
改变还可以在花色或者叶色上直观反映出来。
因此, 植物花色素的合成系统是研究基因表达调
控的最佳系统之一。
国内外对一品红的研究主要集中在栽培管
理、工厂化生产和组织培养技术方面, 对其花
色素的研究鲜有报道(Ruiz-Sifre et al., 1997;
Snipen et al., 1999; Hwang et al., 2002; 焦海华和
周吉源, 2002; 张黎等, 2005)。金波和东惠茹
(1994)的初步研究认为一品红花色素为天竺葵
花色素(pelargonidin)及其衍生物。我们在对五
色草花色素和盐地碱蓬甜菜红素深入研究的基
础上(Wang et al., 2005, 2006), 利用高效液相色
谱-质谱(HPLC-MS)技术对一品红花色素进行
了分离和鉴定, 认为一品红中存在的花色素主
要为矢车菊花色素苷(cyanidin)和飞燕草花色素
苷(delphinidin)及其酰基化衍生物, 这为进一步
研究一品红花色素的合成调控、生物功能及
医学疗效等奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料及实验条件
实验材料为市售一品红(Euphorbia pulch-
errima)一年生成品苗, 放在智能温室中培养并
诱导开花, 光照时间为 10小时 /天, 温度为(25
±2)℃, 光照强度为 200 µmol.m-2.s-1, 相对湿
度为 60%。
1.2 方法
1.2.1 一品红花色素的提取及纯化 按照
Wang 等(2005)的方法, 取一品红的红色苞片
2 g, 剪碎后于液氮下研磨, 以 80% 的丙酮于4℃
浸提过夜, 浸提液以 10 000 g (Heraeus Biofuge
Stratos 高速冷冻离心机, 德国)于 4℃离心 15分
钟, 弃去沉淀, 上清液中加入 2 倍体积的氯仿于
分液漏斗中混合振荡, 去除脂类物质, 水相部分
用真空旋转蒸发仪(R201 型旋转蒸发仪, 上海申
科仪器厂)于 40℃浓缩, 直到丙酮完全蒸发。
浓缩的一品红花色素水溶液用预先经甲醇
激活和 0.01%(体积分数) 的 HCl 溶液平衡过的
ODS C-18 固相萃取小柱进行分离纯化。加入
一定量的色素浓缩液后, 色素吸附在柱上, 然后
用 2 倍体积的 0.01 % HCl 水溶液将糖、酸等
水溶性物质洗下, 再用 2 倍体积含 0. 01 % HCl 的
甲醇溶液将色素洗脱, 收集洗脱液, 用真空旋转
蒸发仪于 40℃真空浓缩, 得到一品红花色素浓缩
纯化液或者红色膏状物, -70 ℃保存备用。.
1.2.2 一品红花色素的分离与结构鉴定 用
紫外-可见光分光光度计(UV756PC, 上海光谱仪
器厂)对花色素的甲醇、甲醇+ AlCl3和甲醇+
AlCl3+HCl溶液在 220～700 nm 进行扫描, 分析
一品红花色素的光谱特征, 并确定液相色谱检测
波长。
液相色谱条件 采用 Agilent HP1100 液相
色谱仪, Agilent Eclipse XDB-C18 色谱柱(250 mm
× 4.6 mm i.d., 5 µm), 可变波长紫外检测器
358 23(4)
(VWD)。流动相为 35% 的乙腈水溶液等梯度
洗脱; 进样量 10 mL; 流速 1.0 mL.min-1 ; 柱温 30
℃; 检测波长为 270 nm。
质谱条件 采用 Esquire2000TM (美国布鲁
克道尔顿公司), ESI 喷雾源, 喷雾电压 41.5 KV;
正离子化模式; 毛细管电压 45 V; 鞘气(N2 )柱前
压 6 MPa, 辅助气柱前压 0.55 MPa; 干燥气流量
7 L.min-1, 干燥气温度 350℃; 设置每秒 300 个
质谱扫描单位, 扫描范围 50～1 000(m/z); 液相
色谱分离后的组分通过 1∶10 分流进入紫外和
质谱检测器。
1.2.3 糖基鉴定 取一品红红色膏状提取物
0.1 g, 加入 0.1 mol.L-1 盐酸溶液 10 mL, 或者收
集 HPLC 后的单一组分 0.2 mL, 加入 0.1 mol.L-1
盐酸溶液 2 mL, 加热至 70℃水解 4小时, 抽真空
除酸, 制成进样液, 上柱进行高效液相色谱。流
动相为乙腈:水 =77∶23, 流速 1 mL.min-1。由
RID-6A 示差折光仪检测, 以标准单糖为标样, 采
用外标法。
2 结果分析
2.1 一品红花色素的提取和初步纯化
植物花色素一般用含有少量酸的甲醇提取,
但有些花色素遇酸会分解而影响鉴定, 因此我们
采用 80% 丙酮提取。组织中可能存在的叶绿
素等脂溶性物质会同时被提取, 用氯仿萃取可以
去除大部分脂溶性物质。另外, 以含有水的丙
酮浸提色素, 往往将其他多酚物质同时溶出, 得
到含多酚、黄酮类化合物、糖类、酸类等水
溶性物质的混合体系。因此, 在进行色谱分离
前, 需要对提取混合液进行初步纯化。固相萃
取是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合
物吸附, 与干扰物分离, 再用洗脱液洗脱或加热
脱附, 达到分离和富集目标化合物的目的。质
谱与液相色谱相同, 只是所用的吸附剂在粒度上
有所差别。我们用 ODS C-18 小柱进行反相固
相萃取, 用不同溶剂分步洗脱, 有效地将提取混
合组分进行初步纯化, 效果在下面的 HPLC-MS
中可以体现, 色谱和质谱分离清晰, 信噪较小。
2.2 一品红花色素光谱特性
一品红花色素甲醇溶液, 经过适当倍数稀
释后, 用紫外-可见光分光光度计在 220~700 nm
扫描, 得到吸收曲线(图 1)。由图 1可见: (1)一
品红花色素甲醇溶液在 270、340和520 nm 附
近有3个吸收峰(图1A), 在300～360 nm 附近有
吸收峰说明色素中有酰基基团存在(Harborne,
1958a, 1958b; Francis, 1984); ⑵ 在 440 nm 吸光度
(A440=0.121)与可见光最大吸收波长 520 nm 吸
光度(A520=0.418)的比值为0.29, 说明该色素糖基
化位置在 3-位(Andersen, 1987; Fossenhe and
Andersen, 1998); ⑶ 花色素的甲醇溶液加入
AlCl3 后, B 环存在游离羟基时可以和 AlCl3 形
成络合物, 引起吸收峰发生红移(向长波长方向
移动, 图1B), 邻羟基和 AlCl3 形成不稳定络合物,
加入 HCl 后由于络合物分解又引起吸收峰蓝移
(向短波长方向移动, 图1C), 而单羟基和 AlCl3
形成的稳定络合物不会发生分解, 也不会再发
生蓝移(中国科学院上海药物研究所, 1981); ⑷
色素溶液在紫外光下无荧光, 也说明糖取代基不
在 5-位上(卢钰等, 2004)。根据这些特性初步
推断一品红花色素为具有邻羟基的矢车菊、
飞药草或者牵牛花色素在3-位被糖基取代的色
素苷及其酰化物。
2.3 一品红花色素分离与结构鉴定
由图 2A 可知经液相色谱分离后, 一品红花
色素样品总离子流在 270 nm 检测中有 5 个比
较明显的吸收峰, 因此推测一品红苞片中可能含
有 5 种花色素。每种组分在质谱正离子扫描
方式下, 有不同的离子峰(图2B1~B5)。通过与
植物中 6 种基本花色素的标准分子量比较, 可
以对每个色谱峰进行初步推断和指认。
组分 1 质谱图中有 3 种比较明显的离子峰
(m/z)287、449和595, 为矢车菊花色素苷的典
型离子峰, 和文献报道(da Costa et al., 2000;
Mullen et al., 2002; Tian et al., 2005)花色素糖苷
的质谱图比较, 判断该色素苷可能为矢车菊花
3592006 王长泉 等: 一品红苞片花色素的分离及初步鉴定
图 1 一品红花色素在甲醇(A)、甲醇 +AlCl3(B)和甲醇 +AlCl3+HCl(C)中的紫外 -可见光扫描光谱
Fig. 1 The UV-vis spectrum of anthocyanidin extract in MeOH(A)、MeOH +AlCl3(B) and MeOH +
AlCl3+HCl(C)
图 2 一品红花色各组分的液相色谱图(A)和质谱图(B1~B5)
Fig. 2 The HPLC (A) and MS (B1-B5) spectrum of anthocyanidin extract in Euphorbia pulcherrim
360 23(4)
色素芸香苷(287+180+164-36)。组分 2 质谱图
中有 287 和 381 两个较强的离子峰, 不符合一般
色素苷的离子峰, 可能是未知花色素, 也可能是
矢车菊花色素与其分子碎片的复合物
(287+94)。组分 3 质谱图中有 303 和 611 离子
峰, 和文献报道(da Costa et al., 2000; Mullen et
al., 2002; Tian et al., 2005)相比较判断为飞药草
花色素芸香苷(303+180+164-36)。组分 4 有
303 和 587 两个离子峰, 应该是飞药草花色素单
糖苷酰基化产物(303+180+122-18-1或者
303+164+138-18-1)。组分 5 产生 287 和 571 两
个离子峰, 可能是矢车菊花色素单糖苷酰基化产
物(287+180+122-18-1 或者 287+164+138-18-1)。
2.4 糖基的鉴定
为了确切判断一品红花色素中所含糖基种
类, 将花色素提取物酸解为单糖后进行了 HPLC
分析。图 3 是标准单糖(图 3A)与一品红花色
素酸解液的 HPLC图谱(图3B)。通过与标准单
糖的出峰时间相比较, 可以推知一品红花色素提
取液中主要含有鼠李糖和葡萄糖2种单糖。这
和2.3节判断组分中含有花色素芸香糖苷的结
论基本一致, 1 分子鼠李糖和 1 分子葡萄糖缩合
脱水形成芸香糖(164+180-18)。
为了进一步确定组分4和组分5的糖基的
种类, 分别收集经 HPLC 分离后的组分4和组分
5, 酸解后重新进行HPLC 分析, 示差折光仪检测,
并和标准单糖的 HPLC 图谱比较(图3C, D), 由
图 3的C和 D 可知, 组分 4 和组分 5的糖基都
是葡糖基, 所以组分 4 是飞燕草花色素苯甲酰
基葡糖苷, 组分 5 是矢车菊花色素苯甲酰基葡
糖苷。综上所述, 一品红花色素的主要成分及
色谱和质谱性质可以概括为表 1。
图 3 鼠李糖和葡萄糖(A)、一品红花色素提取物酸解液(B)、组分 4(C)和组分 5(D)的酸解液的HPLC
图谱
Fig. 3 HPLC spectrum of standard monosaccharides (A)and acid hydrolytic fluid of anthocyanidin extract(B),
compnent 4 (C) and compnent 5 (D) in Euphorbia pulcherrim
表 1 一品红花色素的主要成分
Table 1 The composition of anthocyanidin in Euphorbia pulcherrim
No. Anthocyanidin Rtention time Area Molecular Molecular Fragment
(min) (%) weight ion ion
1 Cyanidin 3-rutinoside 4.36 54.3 595 595 287, 449
2 Unknown 5.28 34.2 381 381 287
3 Delphinidin 3-rutinoside 5.49 8.7 611 611 303
4 Delphinidin 3-benzoylglucoside 6.41 1.3 587 587 303
5 Cyanidin 3-benzoylglucoside 7.72 1.5 571 571 287
3612006 王长泉 等: 一品红苞片花色素的分离及初步鉴定
3 讨论
紫外-可见光谱很早就被人们应用于花色
苷的结构鉴定(Harborne, 1958a, 1958b; 中国科
学院上海药物研究所, 1981; Francis, 1984; 卢钰
等, 2004)。该方法的鉴定要点如下。(1)花色苷
最大吸收波长一个在可见光区的 500～540 nm
附近, 另一个在紫外光 270 nm 附近, 通过测定
色素的最大吸收波长即可初步判断是否为花色
苷类色素。(2)如果向花色苷的甲醇溶液中滴加
3～5 滴 AlCl3, 出现红移, 即最大吸收波长增加,
再加入盐酸后发生蓝移, 说明B-环有邻位酚羟
基, 即可区分开B-环无邻位酚羟基的天竺葵色
素、芍药色素、锦葵色素和B-环有邻位酚羟
基的矢车菊花色素、牵牛花色素、飞燕草花
色素。(3)根据花色苷 440 nm 处的吸光度与可
见光最大吸收波长处吸光度的比值 A440/Amax,
可以判断糖苷的位置。(4)根据花色苷在 300～
330 nm 间有无吸收峰可判断该色素分子是否有
酰基。如果有吸收峰, 表明该色素有酰基存
在。(5)根据花色苷在 440 nm 处是否有肩峰, 可
以判断该色素 5 号位的羟基是否被取代。如
果 5 号位的羟基没有被取代, 则该色素在 440 nm
处有肩峰。(6)根据花色苷在紫外光下是否有荧
光, 可判断该色素是否在 5 号位有取代基。如
果有荧光, 则表明该色素在 5 号位有取代基。
我们对一品红花色素的分析推断过程如
下。(1)通过紫外-可见光谱特性和 AlCl3/HCl 引
起的红移/蓝移反应, 初步确定样品中含有在3-
位糖基化的具有邻羟基或者酰基集团结构的花
色素, 具有邻羟基结构的花色素有矢车菊花色
素、飞燕草(花翠素)花色素和牵牛花色素 3
种。(2)进一步通过 HPLC-MS 分析, 得知样品中
可能含有 5 种成分, 质谱图中得到和花色素标
准分子量 287 和 303 相吻合的离子峰, 基本可以
确认样品中含有矢车菊花色素苷、飞燕草(花
翠素)花色素苷及其衍生物。(3)通过和文献报道
的花色素的标准质谱图比较, 初步判断组分 1 是
矢车菊花色素芸香苷(287+180+164-36), 组分 3
是飞燕草花色素芸香苷(303+180+164-36), 组分
2 可能是一种未知成分。(4)通过花色素酸解液
HPLC 图谱和标准单糖比较, 得知一品红花色素
中含有鼠李糖和葡萄糖, 支持了上述的判断。
由组分 4 和 组分5 中的糖基为葡萄糖进一步推
知组分4是飞燕草花色素苯甲酰基葡糖苷, 组分
5是矢车菊花色素苯甲酰基葡糖苷。最后确认
一品红花色素中含 5 种组分, 即矢车菊花色素
芸香苷(54.3%)、飞燕草花色素芸香苷(8.7%)、
飞燕草花色素苯甲酰基葡糖苷(1.3%)、矢车菊
花色素苯甲酰基葡糖苷(1.5%)和一种含有矢车
菊花色素基团的未知成分(34.2%)。但是花色
素苷的糖基构像、酰基的具体取代位置等细
节问题还有待于用核磁共振(nuclear magnetic
resonance, NMR)技术进行进一步分析, 另一种
未知成分也需进一步鉴定。
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