全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第3期
利用高保真酶扩增特性调整基因读码框的方法
张国广 陈亮 吴亦亮 曾雅明
(厦门大学生命科学学院 细胞生物学和肿瘤细胞工程教育部重点实验室,厦门 361005)
摘 要: 在基因工程研究中,经常要涉及到对目的基因读码框进行调整的研究。本文报道了利用高保真DNA聚合
酶扩增DNA后产生平末端的特性,及限制性内切酶对一重组的原核表达载体pET28a-HA进行读码框调整的研究,测序
结果显示读码框按照预期设计正确调整,表明高保真DNA聚合酶可以用于DNA3凹陷端的补平,在DNA3凹陷端平
滑化时多了一个有效的选择。
关键词: 高保真DNA聚合酶 DNA粘端补平 基因读码框调整
AConvenientMethodforCondonAdjustmentbyUsing
High-fidelityDNAPolymeraseAmplificationProperty
ZhangGuoguang ChenLiang WuYiliang ZengYaming
(ThekeyLaboratoryofMinistryofEducationforCelBiologyandTumorCelEngineering,SchoolofLifeSciences,
XiamenUniversity,Xiamen361005,China)
Abstract: Thereadingframeadjustmentoftargetgeneswasoftenoccuredinthestudyofgeneengineering.The
resultsofpET28-HAgenereadingframeexactlyadjustmentshowedhigh-fidelityDNApolymerasecanbeusedgenerate
bluntendfromaDNA5-protrudingend.TheconvenientmethodcanbeselectedinthebluntofDNA5-protrudingend.
Keywords: High-fidelityDNApolymerase BluntofDNA5-protrudingend Codeadjustment
在基因工程研究中,经常要把目的基因克隆入原核表达载体中以诱导表达目的蛋白,而目前所使用的
原核表达载体(如 Novagen公司的 pET系列)大多设计有自己的翻译起始位点,外源基因插入原核表达载体
时通常要考虑读码框与载体的一致性,以避免插入的外源基因出现移码突变。但有时测序后发现重组后的
表达载体中插入的外源基因读码框与载体不一致,仍然出现了移码突变。应用酶切、补平后连接是读码框调
整常用的方法之一。限制性内切酶切割 DNA后产生的粘性末端的补平通常采用 KlenowFragment酶或 T4
DNA聚合酶 [1]或者一些公司推出的 DNABluntingKit来完成。本文报道了利用高保真 DNA聚合酶扩增
DNA的产物在 3端是平末端的特点,对双酶切后产生的 3凹陷末端进行平滑化,然后平末端连接,从而实
现了读码框正确调整的研究,为 DNA3凹陷末端平滑化提供了一个有效的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
菌株及载体:大肠杆菌 DH5α,装有 H5N1亚型禽流感病毒 HA基因但有移码突变的 pET28a-HA为本实
验室保存。
工具酶及主要试剂:高保真 DNA聚合酶(选用 Takara公司 PyrobestDNA聚合酶),限制性内切酶、连接
酶等工具酶(购于 Takara公司),DNA凝胶回收试剂盒(购于上海华舜生物工程有限公司),其它所用试剂均
为分析纯试剂,LB培养基及卡那霉素抗性培养基等均按常规方法配制。
收稿日期:2005-12-19
作者简介:张国广(1973-),男,在读博士,E-mail:zhanggg709@126.com
通讯作者:陈亮,教授,研究方向:细胞分子生物学,电话:0592-21866050,Email:chen1304@263.net
2006年第3期 张国广等:利用高保真酶扩增特性调整基因读码框的方法
1.2 方法
本研究室保存的 pET28a-HA经上海英骏生物技术有限公司测序后,发现 HA基因读码框与载体
pET28a不匹配,出现移码突变。对序列分析后,发现用 NdeⅠ、HindⅢ双酶切后,补平粘性末端,平端连接后
的将会使 HA基因读码框正确调整(图 1)。
步骤:a双酶切 在为质粒 30μl、NdeⅠ和 HindⅢ酶各 0.8μl、10*Kbufer5μl、灭菌 ddH2O26.8μl,总体
积为 50μl的体系内,对 pET28a-HA质粒进行双酶切,37℃孵育 4h,酶切后的产物加入等体积 Tris饱和苯
酚-氯仿(1:1)抽提一次,上层水相转入新离心管中,加入 1/10上层水相体积的 3M(pH5.8)醋酸钠,然后再
加入 2体积的无水乙醇,-20℃放置 30min,12000r/min离心沉淀 DNA,70%乙醇洗沉淀 2次,晾干备用。
b用高保真 DNA聚合酶对双酶切产生的 3凹陷末端 DNA补平 在含有晾干的双酶切产物的离心管
中加入灭菌 ddH2O17.6μl,10×PCRbufer2μl,dNTP0.5μl,PyrobestDNA聚合酶 0.2μl,总体积为 20μl。
72℃ 水浴 10min补平。
c连接与转化 补平后的产物经琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下切出含目的片断的凝胶块,用试剂盒回
收,回收产物用 T4DNA连接酶在 16℃的条件下连接 8h,然后热激转化大肠杆菌 DN5α感受态细胞,转化
细胞涂布卡那霉素抗性 LB固体平板。
d阳性克隆菌落 PCR及酶切鉴定 对抗性平板上长出的经菌落 PCR鉴定为阳性的白色克隆抽提质粒
进行酶切鉴定。鉴于 NdeⅠ和 HindⅢ双酶切后,两个位点之间的酶切位点已被去除,因此选用 BamHⅠ,Hind
Ⅲ和 XhoⅠ三个内切酶进行组合酶切鉴定。根据预期设计,BamHⅠ位点已被去除,HindⅢ和 XhoⅠ各有一个
位点,其中 HindⅢ是平端连接后被修复的。所以采用三个酶各自单酶切和 BamHⅠ、HindⅢ分别和 XhoⅠ组
合双酶切,符合预期酶切要求的重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。
2 结果与分析
密码子调整后的重组 pET28a-HA工程菌株菌落 PCR及酶切鉴定结果如下:
利用扩增 H5N1亚型 HA基因的一对特异引物,Forwardprimer:5GCGAAGCTTCTGGAGAAAATAGTGCTTC3
;Reverseprimer:5GCGCTCGAGTTAAATGCAAATTCTGCATTG3。对从卡那霉素抗性平板上随机挑出的 5
个白色克隆进行菌落 PCR鉴定,结果五个克隆均扩增出目的大小的片段(图 2(a))。从 5个阳性克隆中随机
图1 原pET28a-HA测序图(HA基因读码框与载体不符合)
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
挑出三个,扩大培养后碱裂解法抽提质粒,以读码框未调整的原质粒作对照,进行酶切鉴定(图 2(b)),样 1
具有 XhoⅠ位点,BamHⅠ和 HindⅢ位点同时缺失,说明 NdeⅠ和 HindⅢ位点中间的序列被切除,但连接时
HindⅢ位点没有得到修复,读码框可能不对。样 2具有 XhoⅠ位点,BamHⅠ位点缺失,说明 NdeⅠ和 HindⅢ
位点中间的序列被成功切除,HindⅢ和 XhoⅠ双酶切切出与目的片断大小相符合的片段,说明平端连接时
HindⅢ位点得到修复,读码框得以按预期设计进行了调整。样 3具有 BamHⅠ位点,说明 NdeⅠ和 HindⅢ双
酶切时没有将中间位点切除掉,与预期设计不符合。将重组样 2菌株送上海英骏生物公司测序,测序结果见
图 3,可见重组 pET28a-HA表达载体的读码框得到成功调整,HA读码框已与载体匹配,HA蛋白可以被正
确翻译。
图 2 重组 pET28a-HA基因的菌落 PCR鉴定(a)和 PCR阳性克隆质粒及对照酶切图(b)
图 2(a)1阳性对照的 PCR产物;2阴性对照;3～75个阳性菌落的 PCR产物;M宝生物公司 DL2000DNAMarker;
图 2(b)b-1原质粒酶切图,b-2样 1酶切图,b-3样 2酶切图,b-4样 3酶切图
(1)未酶切质粒;(2)BamHⅠ单酶切质粒;(3)BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切质粒;(4)XhoⅠ单酶切质粒;(5)HindⅢ和 XhoⅠ双酶
切质粒;(6)HindⅢ单酶切质粒;M宝生物公司 DL2000DNAMarker
图 3密码子调整后 pET28a-HA重组质粒的测序图
3 讨论
在基因工程研究中,尤其是在一些原核表达的研究中,有时重组表达质粒经过测序后发现插入表达载
体的外源基因读码框与载体不一致,出现了移码突变,这时要么将目的基因切下插入与其读码框匹配的载
体(如 Novagen公司开发的pET28系列中包含有 pET28a、pET28b和 pET28c三个载体,它们的区别是在多克
隆位点 BamHⅠ前依次减少 1个和 2个核苷酸,研究者可以根据所研究目的基因的读码框选用不同的表达
载体);要么重新设计带合适酶切位点的引物,重新扩增后连接;要么利用原载体,找到合适的酶切位点,通
过酶切、补平、连接来调整读码框。前者很方便快捷,但商业开发的载体较昂贵,并不是每个实验室都能购买
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所有配套的载体,而重新合成引物则需要等待引物合成的时间,以及随后的扩增和连接过程。而对载体进行
序列分析后,运用实验室常备的工具酶进行酶切、补平操作来调整读码框的方法则非常方便快捷。对经过限
制性内切酶切割 DNA后产生的粘性末端的补平,通常采用 KlenowFragment酶或 T4DNA聚合酶[1]或者一
些公司推出的 DNABluntingKit,但从未见过有使用此外高保真 DNA聚合酶补平 3凹陷端的报道。高保真
DNA聚合酶(如 PfuDNA聚合酶;PyrobestDNA聚合酶等)具有 3-5的外切活性,其 PCR扩增产物的 3端
是平滑末端,与普通 Taq酶的 PCR扩增产物 3末端通常附有一个碱基 A不同。限制性内酶切切割 DNA后
在 3端产生带有-OH末尾,高保真 DNA聚合酶在正常反应体系中会将与另一条 DNA链互补的碱基聚合上
去,直至 DNA粘性末端被补平。但由于高保真酶发生聚合反应的方向为 5-3,因此不能应用于 3突出末端
的 DNA补平。
本研究利用高保真 DNA聚合酶成功地将 NdeⅠ和 HindⅢ双酶切后产生的 3凹陷端平滑化,通过平端
连接得到了读码框正确的重组表达质粒 pET28a-HA,该重组质粒正被转入 BL21(DE3)中,用于原核表达及
禽流感病毒基因工程疫苗制备的研究。本文报道的研究结果将会使研究人员在对 DNA 3凹陷端平滑化、
然后进行读码框调整时多了一个选择。
参 考 文 献
1 萨姆布鲁克丁 J,弗里奇 EF,曼尼阿蒂斯 T.分子克隆试验指南[M](第二版).金冬雁,黎孟枫,等译.北京:科学出版社,1999,267~271.
张国广等:利用高保真酶扩增特性调整基因读码框的方法
中国地方猪ESR基因PvuⅡ多态性及其与产仔数的关系
四川农业大学李明洲等4位研究人员试验采用 PCR-RFLPs方法,研究了中国成华猪、内江猪和太湖猪 3个
地方品种ESR基因的多态性及其与产仔数间的关系。结果表明:成华猪、内江猪、太湖猪的B等位基因频率分别
为0.6389、0.6613、0.6855。在这3个猪品种中,除成华猪检测时只有AB、BB两种基因外,在内江和太湖猪中都检
测到了AA、AB、BB3种基因型。对3个品种不同基因型个体间产仔数的比较研究表明:不同ESR基因型的个体其
产仔数存在一定差异,各品种无论头胎还是经产,总体表现为BB基因型的产仔数高于AB型和AA型个体,而
AB型又高于AA型个体。其中太湖猪BB型个体头胎产活仔数(NBA)11.13头,显著高于产9.42头的AB型个体
(P<0.05)。这证明了基因是对提高产仔数有利的基因,同时还分析了ESR基因PvuⅡ-RFLP的应用前景及其存在
问题。
据报道:中国地方猪二花脸猪,香猪B等位基因频率为0.7321,外来品种则大约克猪、长白猪、“双臀肌”约克
夏B等位基因频率为0.3455,大白猪B等位基因频率分别为0.55~0.75、0.4706。本次试验中B等位基因频率以太
湖猪最高为68.55%,内江猪次之为66.13%,成华猪最低为63.89%。这证明中国地方猪B等位基因频率普遍高于
国外商业品种猪,验证我国地方猪种产仔数高的优良遗传性。
所测ESR基因的PvuⅡ酶切片段长度多态性与成华猪、内江猪和太湖猪的产仔数间存在一定的相关性。总
体表现为BB基因个体的产仔数>AB型个体的产仔数>AA型个体的产仔数。这说明B基因有助于提高产仔性能。
据报导ESR-B基因控制的0.44~1.15头产活仔数/胎。这对育种有一定参考价值。虽然ESR基因为控制猪高产仔
数的主效基因或与主效基因紧密连锁,但与不同的商业猪种对产仔数的影响存在显著品种间和场间差异。另外,
ESR基因型对产仔数的影响在胎次间有差异,通常是对头胎产仔数的影响高于经产。
(下转第72页)
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