全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第3期
土壤盐渍化是全球农业最严重的问题之一,因为全世界大约有 3.4亿公顷的耕地受到盐胁迫危害,占
总耕地面积的四分之一[1]。一般植物不能在高度盐渍化土壤上正常生长的主要原因是高浓度的 Na+对植物
的毒害作用[2]。离子毒害主要是由于植物摄取了过量的 Na+,K+,Cl-等离子,使植物细胞内离子浓度增高,而细
胞内许多酶却只能在很狭窄的离子浓度范围才具有活性[3]。液泡膜中的一种 Na+/H+反向运输体可促进离子
在液泡中的分室效应,跨液泡膜的 pH为其提供能量。Na+/H+运输体存在于植物体最早是在多种植物液泡及
囊膜的反向活性的生物化学研究中推断出来的[4]。Na+/H+运输体属于 NHX家族成员,迄今为止在植物中克
隆得到六个[5]。其中 NHX1及NHX2在植物中研究得较多。NHX基因功能现今有三大分支:(1)调节植物体内
新疆盐生植物耐盐基因NHX转化甘蓝型油菜及其
耐盐性的初步研究
郝东风 兰海燕 陈邦党 张富春
(新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐 830046)
摘 要: 以甘蓝型油菜带柄子叶为转化受体,通过根癌农杆菌 EHA105(Agrobacteriumtumefaciens)介导将盐角草
(Salicornia)的Na+/H+反向运输体基因NHX导入新疆主栽油菜1khp11品系,获得了抗卡那霉素的再生植株,并对影响遗
传转化的一些关键因素进行了研究。实验结果表明:带柄子叶在含有2,4-D的培养基上经过2d短时间的预培养后在菌
液浓度OD600为0.3时在28℃摇床浸染15min时卡那抗性绿苗率可达10%~12%;经过抗性植株的PCR及RT-PCR检测
证明外源基因已整合到油菜基因组中,并通过表型实验证实由于外源基因的导入提高了植株的耐盐能力。
关键词: 耐盐基因NHX 新疆盐生植物盐角草 油菜带柄子叶 耐盐能力
IntroductionofNa+/H+TransporterGeneNHXFrom Native
HalophyteSalicorniasppinXinjiangintoBrassicaNapusand
ItssaltTolerance
HaoDongfeng LanHaiyan ChengBangdang ZhangFuchun
(ColegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,KeyLaboratoryofXinjiangBiologicalResourcesand
GeneticEngineering,Urumqi830046)
Abstract: CotyledonswithpetioleofXinjiangBrassicanapusvariety1khp11varietyweretransformedwith
Agrobacterium tumefaciensEHA105,inwhichisharboringNa+/H+ transportgeneNHX ofSalicornia,andthekan-
resistantwereregeneratedanativehalophyteinxinjiang,andandysedthekeyfactorsafectingthegenetictransformation.
Theresultsshowedthatkan-resistantplantletscanbeobtainedandNHXgenehasalreadyinsertedintogenomeofoilseed
byPCR andRT-PCR.ThesalttoleranceabilityoftransgenicoilseedwassignificantimprovedbyintroductionofNHX
geneofSalicornia.
Keywords: SalttolerantgeneNHX Halophytesalicorniainxinjiang Cotyledonswithpetioleofbrassicanapus
Salttolerance
收稿日期:2006-02-14
基金项目:新疆高校创新研究群体基金项目(XJEDU2004G02)和教育部科学技术研究重点项目(205178)
作者简介:郝东风(1978-),男,汉,河南贡义市,硕士生
通讯作者:张富春,电话:0991-8583259,E-mail:zfcxju@xju.edu.cn
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
盐分吸收,提高植物耐盐能力。(2)调节细胞内酸碱度,控制胞内运输。(3)促进植株生物产量[6]。在植物中,
盐离子从细胞质以及液泡的分隔区排出是其调节渗透压和消除钠离子毒害的主要过程[1]。首先由质子(泵)
提供钠离子反电化学梯度穿过液泡膜和质膜时所要动力[2,7]。通过在功能上恢复 Na+/H+反向运输体(ScNHX1)
缺陷型酵母突变体,从拟南芥中分离出了 AtNHX1基因,并且与哺乳动物 NHE反向运输体具有序列相似性
[11~13]。在转基因拟南芥和转基因西红柿中过量表达 AtNHX1,可在液泡膜中积累大量的运输体,并且极大地
提高了它们的耐盐性[11,13,14]。这些结果显示出 AtNHX家族在钠离子的液泡分室效应中起着关键的作用。本文
在前人研究的基础上,将新疆本土盐生植物的 NHX基因导入甘蓝型油菜中,并对其转化后植株的耐盐性进
行了初步研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转化受体菌由本实验室保存,植物表
达载体 pBI121由本实验提供,盐角草 NHX基因克隆及植物表达载体的构建由本实验完成。
1.1.2 植物材料 甘蓝型油菜 1khp11品系种子由新疆农业科学院经济作物研究所提供。
1.1.3 培养基 基本培养基 MS。预培培养基 MS(A):MS+1.0mg/L2,4-D;共培培养基 MS(B):MS+5.0mg/
L6-BA+0.02mg/LNAA+5.0mg/LAgNO3(+AS200!mol/L);筛选培养基 MS(C):共培养培养基+500mg/LCb+
7.0mg/LKana;壮苗继代培养基 MS(D):共培养培养基+500mg/LCb+10mg/LKana;生根筛选培养基 MS
(D):MS(B)+0.5mg/LIBA+500mg/LCef+10mg/LKana,以上培养基均附含 30g/L蔗糖,8g/L琼脂 pH5.8~
6.0。摇菌培养基 YEP:酵母浸粉 10g/L,蛋白胨 10g/L,NaCl5g/L(pH7.0);以上各培养基中所用的 AgNO3,Cb,
kan,Cef均采用过滤灭菌,其它则在 121℃下进行高温高压灭菌。
1.2 方法
1.2.1 油菜的遗传转化 A.选取籽粒饱满、大小均一的油菜种子,用 70%的酒精浸泡 30s,再用 0.1%升汞处
理 7min,无菌水反复冲洗 8~10遍,播种于 1/2MS培养基上,置 25℃、16h光照/8h黑暗的光照周期下培养 5d,
光强为 1600~2000lux。
B.切取 5d苗龄的带柄子叶,接种于含 1.0mg/L2,4-D的 MS0预培养基中,预培养 3d。
C.鉴定正确带有外源目的的农杆菌浸染前的二次活化浓度最好控制在OD600=0.6~0.8,6000rpm离心7min,
无菌条件下MS液体培养基洗涤两遍,每次都需用枪头使菌体均匀悬起,用MS稀释最终浓度至OD600=0.3~0.4。
D.将预培养的带柄子叶转至一无菌的锥形瓶中,加入稀释好的菌液,放入28℃摇床计时15min,在超净工作
台取出浸染好的外植体用无菌滤纸吸干多余菌液并在超净工作台中充分吹干,再转入共培培养基MB5A中。
E.共培养 48~72h,避光暗培。此过程可明显的看到带柄子叶的长大与伸长,而且以其基部褐化轻(肉眼
观察基部呈白色)为最佳。
F.共培结束后,转至初筛培养基中。设两组对照:a.预培养前转至初筛培养基中;b.预培养后转至初筛
培养基中。
G.初筛后加大筛选力度并进行生根培养。
1.2.2 分子生物学检测 A.PCR检测 取对照未转基因及转基因卡那抗性绿苗叶片,提取未浸染植物基因
组 DNA为对照组模板,以 P1:TCAGGATCCATGTGGTCACAGTTAAGC和 P2:AGTGTCGACTGTTCTCTGTGAC
AAATTAGTGG为引物,以浸染植物基因组为实验组模板,PCR程序为:(1)95℃ 预变性 2min;(2)95℃ 变
性 30s,58.5℃ 退火 30s,72℃延伸 2min,35个循环后;(3)于 72℃延伸 7min扩增 NHX目的基因 1700bp
片段来检测目的基因的整合情况。
B.RT-PCR检测 取对照未转基因及转基因卡那抗性绿苗叶片,提取植株总 RNA,引物与上相同,PCR
程序与上相同;RT-PCR程序为:42℃30min,99℃10min,5℃5min。
1.2.3 转基因苗的耐盐实验 当油菜苗长至一周龄以后分别以 50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、
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图1 再生油菜植株的PCR检测
1.MarkDL15000+2000
2.非转基因植株基因组DNA
3.转化再生植株基因组DNA
4.转化再生植株PCR结果
5.非转基因植株PCR结果
1 2 3 4 5
图2 转基因植株RT-PCR 结果
1.DL2000
2.转基因植株PCR结果
3.转基因植株RT-PCR结果
4.非转基因植株RT-PCR结果
1 2 3 4
500mM的 NaCl溶液以未转化 NHX基因植株为对照对幼苗进行盐胁迫,两周后恢复正常的培养条件观察植
株生长条件。
2 结果与分析
2.1 转化体系的条件
外植体为 5日龄带柄子叶,脓杆菌浸染条件 600nmOD为 0.3摇床摇 15min,kana浓度为 7mg。在农杆
菌的转化系统中,菌液的活力及浸染时间对于农杆菌的遗传转化尤为重要。我们在实验中发现,当菌液浓度
为 0.3浸染 7min时,卡那抗生素绿苗的得率约为 10%~12%。随着菌液浓度的升高,OD600大于 0.5时,在后期
的筛选分化中抑菌困难,即使采用含高浓度羧苄的 MS液体培养基进行洗菌处理仍很难得到分化的绿苗。
何业华[7]等人在对甘蓝型油菜进行 TA-29-Barnase基因转化的研究中使用 OD600.5浸染 5min时得到了较高
的转化率,这可能是所用受体材料的基因型不同造成的。
2.2 PCR及 RT-PCR检测
以 NHX基因的特异性引物对筛选所得的卡那抗性绿苗进行 PCR扩增,有 6株得到了大小约 1700bp
的目标片段(图 1),进一步选取其中 4株进行了 RT-PCR检测,出现了特异的条带(图 2),初步表明目的基
因 NHX已整合到油菜的基因组中。
2.3转基因苗的耐盐实验
当油菜苗长至一周龄以后分别以 50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM的 NaCl溶液以未转化
NHX基因植株为对照转化了 NHX基因植株为实验组对幼苗进行盐胁迫,两周后发现对照组油菜在 200mM-
NaCl以上浓度均发生叶片枯黄现象,而实验组最高能够耐受 300mM NaCl浓度。并且在恢复正常的培养条
件后对照组出现了严重的生长抑制现象,试验组很快就恢复了正常的生长状况,只有小部分植株无法恢复
正常状态。(图 3)
3 讨论
3.1 农杆菌介导的油菜遗传转化条件
在农杆菌介导的转基因工作中首先遇到的比较难解决的问题就是农杆菌浸染植株后农杆菌污染问
题会比较严重,提高抗生素浓度会抑制转基因植株的生长。因此在本实验中对浸染后如何用简单有效的方
法来抑制农杆菌的生长进行了摸索。在不增加抗生素浓度的情况下,降低浸染菌液的浓度,延长浸染时间,
并且要保持培养基的干燥,浸染完成后充分吸干外植体上残留的菌液,然后在超净工作台中吹干。这样就简
单有效的解决了农杆菌污染问题。
郝东风等:新疆盐生植物耐盐基因NHX转化甘蓝型油菜及其耐盐性的初步研究 83
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
图3 转基因植株不同盐浓度胁迫下的实验结果
a.为野生型油菜在经过200mMNacl胁迫后又恢复正常培养条件后两周的生长情况
b.为实验组油菜在经过300mMNacl胁迫后又恢复正常培养条件后两周的生长情况
a b
2,4-D对芽器官具有很强的诱导作用[11,12],本实验中带柄子叶通过短时间 1mg/L2,4-D的预培养,一方面
极大的提高了外植体的再生频率,同时据 V.Cardoza[13]。等研究,外植体在含有 2,4-D的培养基中合成了一种
含酚的化合物它可以激活农杆菌的 vir区,利于外源基因的转移和整合,从而可大大提高转化效率。本文也
是国内外首次报道将带柄子叶在 1mg/L2,4-D中预培 3d后使遗传转化效率大大提高。
3.2 转 NHX基因的油菜植株的耐盐性
盐害抑制生长是植物的一种自我保护机制,有些植物在盐害很严重时,细胞仍大量分裂和增殖,便会因
能量供应不足而枯萎死亡[8].筛选过程中发现潜在的突变体多是一些相对较小的植株,可能是植物的根首先
接受高盐信号,非抗盐植株由于不能及时控制有害离子的吸收,导致体内盐浓度过高而受到损害;而潜在突
变体能积极地响应盐胁迫,及时地阻止有害离子向上部运输,从而使叶片免受离子的毒害,仍保持绿色.此外,
在筛选过程中还发现许多假阳性植株在高盐基质上真叶保持绿色,但是移至正常基质时真叶却变褐,而真正
的抗盐突变体却始终保持绿色,可能是突变体能通过主动运输而将盐离子从根部排出,而假阳性植株仅仅是
暂时将盐离子积累在根部,并非真正的抗盐,移至正常基质后,根部高盐信号消失,代谢过程恢复正常,积累在
根部的有害离子随着水分运输到叶片,使叶片受害变褐。
实验分析结果表明:带柄子叶在含有 2,4-D的培养基上经过 3d短时间的预培养,在最佳菌液浓度
OD600为 0.3中浸染 7min时卡那抗性绿苗率可达 10%~129%,通过抗性植株的 PCR检测及 PCR-Southern杂
交证明外源基因已整合到油菜基因组中,并通过表型实验证实由于外源基因的导入提高了植株的耐盐能
力,为新疆土壤的改良和油菜产量的提高奠定了基础。
参 考 文 献
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