全 文 ：脂肪组织 RNA提取方法的改进
吴江维
杨公社
孙超*
(西北农林科技大学 动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,杨凌
712100 )
摘
要:
本试验以猪脂肪组织为材料, 应用 T RIzo l、V
gene、H . Q . & . Q 三种总 RNA 提取试剂盒分别提取脂
肪组织 RNA,发现直接按照试剂盒说明书操作提取的 RNA 效果不理想。通过反复试验, 分别改进了提取过程中
的部分操作步骤,结果表明: 三种试剂盒操作方法改进后与改进前相比, 提取 RNA 的纯度和得率表现为差异极显
著( P< 0. 01) ;三种试剂盒操作方法改进后提取 RNA 的纯度差异不显著( P> 0. 05) , 但在得率方面, T rizol 比其它
两种高,表现为差异极显著( P< 0. 01)。三种试剂盒操作方法改进后提取的 RNA 经 RT
PCR 扩增猪

act in 基因,
电泳结果显示,扩增条带清晰、特异,说明提取的 RNA 完全符合后续的分子生物学实验要求。
关键词:
脂肪组织
RNA 提取
T RIzol方法
V
gene 方法
H. Q . & . Q 方法
Improvement of Methods for Extracting Total RNA from Adipose
Wu Jiangw ei
Yang Gongshe
Sun Chao*
( L abor atory of animal f at d ep osi t ion and muscl e dev e lop ment , Northw est A & F
Univ er sit y , YangL ing
712100)
Abstract:
Three commercial to tal RNA ex tr act ion kits TR Izo l, V
gene and H . Q . & . Q were applied to isolate
high pure and integr al RNA fr om adipose. It w as found that it was hard to obtain high quality RNA w hen rest ric

tively following their prot ocols. But w ith some modificat ion, satisfied r esults wer e achieved. The purities of resulted
RNA w ere not differ ent among three modified methods. While the yield of modified TRIzol w as higher when com

pared w ith other tw o. RT
PCR was used to detect the qualit y of RNA ext racted by modif ied methods. Agar ose gel
electrophor esis showed clear, specific

actin g ene bands. It was proved that with these modifications, t he pure and
integr al RNA could be obta ined, w hich was suitable for common molecular bio log ical researches.
Key words:
Adipose
RNA ex traction
T RIzol method
V
gene method
H. Q . & . Q method
尽管 RNA 的提取已经成为现代分子生物学一项很成熟的技术,但由于 RNase 广泛存在且不易灭活,在
实际研究中经常很难做到顺利获得高质量的 RNA [ 1, 2]。目前, 很多公司都推出了总 RNA 提取试剂盒, 如:
Life T echno logies的 Tr izol和 Promega公司的 RNA gents等, 但不同组织由于组织特异性 [ 3, 4] ,在 RNA提
取过程中会产生一些特别的要求, 按照常规步骤操作, 往往不能取得理想的结果。因此, 在实际操作中, 我们
应根据试验的需要选择或改进相应的方法[ 5] , 以期达到试验目的。
近年来的研究表明脂肪组织是一个重要的内分泌器官[ 6] ,它参与机体的多种生理生化代谢,同时也涉及
了多种心脑血管疾病和肥胖相关疾病的发生和发展[ 7]。这主要发生在成熟脂肪细胞中。成熟脂肪细胞内含
有各种细胞器、细胞核以及与其他类型细胞不同的一个大的中央脂滴。脂肪组织单位体积细胞数较少, 且单
位细胞 RNA 含量也相对较少[ 8] , 这增加了从脂肪组织提取 RNA 的难度。作者以脂肪组织为材料, 经反复
试验,比较了几种商品化的总 RNA 提取试剂盒,优化和改进某些提取步骤,从而得到了符合试验要求的总
RNA,为从分子水平研究脂肪细胞提供一定的理论依据和技术保障。
收稿日期: 2005
04
13
基金项目:国家自然科学基金项目( 30471267)和中国博士后科学基金项目
作者简介:吴江维( 1980
) ,女,在读硕士研究生,研究方向:动物遗传育种与繁殖

* 通讯作者:孙超( 1968
) ,男,陕西人,博士,副教授, E
mail: sun chao2775@yahoo. com. cn

生物技术通报

研究报告
          BIOTECHNOLOGY
BULLETIN







2005年第 5期
1
材料与方法
1. 1
材料来源
脂肪组织采自西北农林科技大学种猪场大白猪,取后立即放入液氮保存。
1. 2
试剂及所需溶液
H. Q. & . Q 总 RNA提取试剂盒Ⅱ(安徽优晶生物工程有限公司)、V
gene 总 RNA提取试剂盒(杭州维
特洁生化技术有限公司)、TRIzol(北京天为时代科技有限公司)、氯仿、异丙醇、0. 1% DEPC 水配制的 75%
的乙醇、无 Rnase 水、0. 1% DEPC 水配制的 70% 的乙醇、DEPC 原液 ( Sigma 分装)、RevertAidTM Fir st
Strand cDNA Synthesis Kit # K1621( Fermentas)、Taq DNA Polymerase # EPO402( Fermentas)、
X174

H ae Ⅲ digest DNA M ar ker ( TaKaRa)、

act in ( Sense: 5ACTGCCGCAT CCT CTT CCT C3, Ant isense: 5
CT CCTGCTT GCT GA TCCACA TC3,产物长度为 399bp)引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合
成。
1. 3
操作程序
按照试剂盒说明书进行, 由于脂肪组织含大量脂类,部分操作做了相应的改进。
1. 3. 1
V
gene试剂盒改进的步骤: ( 1)样品量加大到 150~ 170mg ,成熟脂肪细胞富含脂类, 单位细胞 RNA
含量与其它类型细胞相比极少,样品量小时, 提取到最后几乎看不到 RNA; ( 2)先将 0. 5m l Buf fer R
A 加入
1. 5m l离心管,放入 4
预冷, 样品研磨充分后直接加到此管中,边加样边上下混匀, 这样既可多加样品又可
使样品和试剂充分作用, 以完全裂解细胞释放 RNA。将 Buf fer R
A 直接加到研钵中的缺点在于液氮不断挥
发,样品始终是干燥的粉末状, Buf fer R
A 随液氮一同挥发, 不能发挥作用, 提取效果较差。( 3)将步骤 4(用
4~ 6号针头的 1ml注射器反复吸注 10次)改为盖好管盖,上下剧烈振荡 3min,使其充分作用。脂肪组织脂
类含量高,针头吸注很容易堵塞, 不利于操作。另外,振荡后最好在室温静置 5min,细胞可完全裂解, 提高
RNA 产率。( 4)将 T E改为 DEPC 水溶解 RNA,可以延长 RNA 的保存时间。
1. 3. 2
T RIzo l改进的操作步骤: ( 1)样品量加大到 150mg。( 2)因为加大了样品量,溶液与样品的接触不是
很充分。因此, 先要上下剧烈振荡 5min左右,待样品和溶液完全混匀后在室温下静置 10~ 25m in。由于样
品含大量的脂类,这时整个溶液呈浑浊状。( 3)第一次离心后上层含有约 1/ 2的脂类。因此,上层的脂类必
需先除去,再吸取下层溶液,在此过程中不可避免的有脂类污染,所以取得的下层溶液需做同样的二次离心,
以保证完全去除脂类污染。
1. 3. 3
H. Q. & . Q.总 RNA 提取试剂盒Ⅱ的操作步骤:此试剂盒在提取脂肪组织样品过程中最后 RNA 吸
附在硅胶上,需至少 50
l的 DEPC水洗脱,这样得到的 RNA浓度太低, 不符合下游的反转录要求。本试验
在 RNA 的分离富集过程中用 75%的异丙醇代替提取柱沉淀 RNA,保证最终 RNA 的浓度。
1. 4
RNA 质量检测
用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量。
2
结果与分析
2. 1
三种试剂盒操作方法改进前后所提 RNA 的完整性比较
分别取以上三种试剂盒提取的总 RNA 溶液 2. 5
l和少量溴酚蓝电泳缓冲液混合, 在 1%的琼脂糖凝胶
上进行电泳。电泳条件为 80V, 30m in。UV 凝胶成像仪下照像如图 1和图 2。
图 1
1, 2: T RIzo l方法; 3, 4: V
gene 总 RNA 提取试剂盒方法; 5, 6: H . Q. & . Q 总 RNA提取试剂盒Ⅱ
方法。
图 2
1, 2: V
gene 总 RNA 提取试剂盒方法; 3, 4: H . Q. & . Q 总 RNA 提取试剂盒Ⅱ方法; 5, 6: T RIzo l
方法。
由图 1可见, H . Q. & . Q总 RNA 提取试剂盒Ⅱ和 V
gene 总RNA提取试剂盒在未改进的条件下, 所提
76







生物技术通报 Biotechnology
Bullet in







2005年第 5期
RNA 只有 18S和 28S两条带, 5S 几乎看不到, T RIzo l所提 RNA 三条均可看到, 但 5S 带很淡。而三种试剂
盒操作方法作相应改进后提取的 RNA 三条带均清晰可见(图 2) ,说明三种试剂盒操作方法改进后提取的
RNA 完整性好。
图 1
三种试剂盒按说明书所提 RNA的完整性 图 2
三种试剂盒操作方法改进后所提RNA的完整性
2. 2
三种试剂盒操作方法改进前后所提 RNA 的纯度
用紫外分光光度计分别检测三种试剂盒提取的
RNA OD260和 OD280,用 DPS v3. 01专业版数据处理系统统计数据,提取 RNA 的纯度和得率如表 1:
表 1
改进前后三种试剂盒方法提取 RNA的纯度和得率
处理 纯度 得率= OD260* 40* 500(
g/ ml )
Modif ied
TRIzol 1. 893A 953. 333A
Modif ied
H. Q. & . Q 1. 845AB 753. 333 B
Modif ied
V
gene 1. 844AB 746. 667 B
T RIol 1. 787BC 560. 000C
V
gene 1. 739C 513. 333C
H . Q. & . Q 1. 726C 426. 667 D




注:同一列数据之间进行比较,不同大写字母表示 P< 0. 01
图 3
改进后 TRIzol 提取 RNA的扩增
条带
由表 1可知,在操作方法改进前后三种试剂盒提取 RNA 的纯度
和得率均表现为差异极显著; 改进后的三种试剂盒提取 RNA 的纯度
之间差异不显著,在得率方面, TRIzol与前两种相比差异极显著。
2. 3
三种试剂盒操作方法改进后所提 RNA 扩增猪

act in 基因的
效果
采用操作方法改进后的三种总 RNA 提取试剂盒所提 RNA,对


act in基因进行 RT
PCR扩增,结果如图 3~ 5所示:
图 3~ 5为分别为改进后 TRIzol、V
gene 和 H. Q. & . Q 试剂盒
提取 RNA所扩增的猪

actin 基因。图中 M 为 Marker:
X174
Hae
Ⅲ digest DNA, 1, 2, 3, 4均代表

act in 基因扩增结果。
由图 3~ 5比较发现,三种试剂盒操作方法改进后提取的 RNA 完整性和纯度无明显差异,且均符合分
子生物学实验要求, TRIzol法改进后所提 RNA得率与其它两种相比差异极显著。
3
讨论
完整和均一是评价 RNA 质量的两个关键标准。通常情况下, 完整的 RNA 取决于最大限度地避免纯化
(下转第 81页)
772005年第 5期









吴江维等:脂肪组织 RNA 提取方法的改进
好在迄今为止, 印度的直接有关方面,诸如环境
学家、农民机构、科学家、公司、政策分析者和政府之
间仍然存在着争论。印度的各大媒体在这场争论中
也保持着基本中立的态度。这使得在众多的风险投
资的博弈者之间,仍然有可能存在进行明智的和建
设性的对话的空间。
在这些风险投资的博弈者指导之下的印度植物
生物学会社和政策制定者似乎确信,转基因方法将
为最短时间内获得最大效益提供最佳途径。然而,
尽管印度 DBT 监测委员会认为,大田种植试验业已
证明,美国孟山都公司育成的 B t棉是安全的, 但印
度政府最近仍然拒绝批准将这种 B t棉引入印度并
进行商业种植。这显然是因为, ICAR的农业科学
家指出,在害虫负荷未达高峰时检出 Bt 棉的抗虫
性,因而坚持要在农业科学家的监督下重复进行大
田试验。目前,印度正在重复进行这样的种植试验,
预期今年将会根据试验结果作出决策。
不过,不论是否推广 GM ,印度的农业科学家在
印度政府的支持下,看来都胸有成竹地深信,通过推
行防止灾害损失和提高单产的相应的综合性策略,
将有可能满足今后几十年内印度的粮食需求。总
之,印度不仅已经给植物生物学和生物技术发展的
光辉前景, 奠定了坚实的基础, 而且决心要粉碎
Lester Brow n和 Hal Kane( 1994)关于 21世纪印度
社会发展的悲观论断。
(原载: Trends in Plant Science, 2002, 7( 2) : 92~ 94)
(上接第 77页)
图 4
改进后 V
gene提







图 5
改进后 H.Q. & . Q提
取 RNA的扩增条带







取 RNA的扩增条带
过程中内源和外源 RNase 对 RNA 的降解;
均一的 RNA 取决于有效地去除 RNA 提取
物中的 DNA、蛋白质和有机溶剂[ 9]。
经反复试验发现,脂肪组织由于富含脂
类物质,且单位细胞所含 RNA 量很少[ 8] , 直
接按照 H. Q. & . Q 总 RNA提取试剂盒Ⅱ、
V
gene 总 RNA 提取试剂盒、T RIzo l试剂
盒说明书提取脂肪组织 RNA 效果并不理想, 所以有效地去除脂类的污染和最大限度的提高产量是提取脂
肪组织 RNA 的关键。在脂肪组织 RNA 提取过程中,对三种试剂盒的操作作适当的改进:增加样品量、延长
样品在裂解液中的作用时间、改变 RNA 的分离方式和在操作各环节中注重有效的除脂, 是可以获得完整、
均一、符合试验要求的高质量 RNA。改进后的三种试剂盒不仅可以有效提取脂肪组织 RNA, 也可应用于其
它富含脂类的组织如:肝组织、大脑组织等的 RNA提取。
H. Q. & . Q 总 RNA 提取试剂盒Ⅱ的提取过程不需要超速冷冻离心机等昂贵仪器,其最大优点在于 RZ
裂解缓冲液Ⅱ可以将固体脂类溶解为液体, 便于离心后的分离, 减小脂类污染; V
gene 总 RNA 提取试剂盒
适合大批量提取 RNA,价格相对便宜,而 TRIzol适合于小量提取。因此,在实际应用中,可根据需要,选择
适合实验条件和实验要求的试剂盒。
参 考 文 献
1
林明, 张页, 等.中国生物化学与分子生物学报, 2002, 18 (6) : 786~ 787.
2
闫亚平, 刘世海, 等.西北植物学报, 2004, 24 ( 10) : 1936~ 1939.
3
张君诚, 威彦飞, 等.福建农林大学学报, 2004, 33 ( 1) : 1~ 4.
4
王 芳, 张斌, 等.花生学报, 2002, 31 ( 4) : 24~ 26.
5
房经贵, 高志红, 等.生物技术, 2003, 13 ( 2) : 24~ 25.
6
Ahima Rexford S, Fl ier Jeffery S. T rends in Endocrinology and Metabolism , 2000, 11( 8) : 327~ 332.
7
DB H ausman, M DiGirolamo, et al. Ob es Rev, 2001, 2 ( 4) : 239~ 254.
8
M ersmann , H arry J . S eminars in Plast ic Srugery, 2002, 16 ( 2) : 195~ 197.
9
付月君, 张志云, 等.生物技术通报, 2003, 5: 40~ 42.
812005年第 5期





汪开治译:迈入生物技术时代的印度植物生物学:现状和前景