全 文 ：玉米转录因子 zmCBF1的凝胶阻滞分析
杨红梅1, 2
王磊1
( 1中国农业科学院生物技术研究所,北京
100081; 2新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐
830000)
摘
要:
凝胶阻滞试验是分析核酸与蛋白质相互作用的有效方法, 在转录因子的功能分析中得到了广泛应
用。以玉米转录因子 zmCBF1 与顺式元件 CRT 的结合为例,建立了用于转录因子分析的 GRA/ EMSA 实验体系,
并对其在应用中可能出现的问题进行了分析。
关键词:
凝胶阻滞实验
电泳迁移率变动实验
转录因子
顺式元件
Analysis of Maize Transcription Factor zmCBF1 by
Gel Retardation Assay
Yang H ongmei1, 2
Wang Lei1
( 1 B iote chnolog y Re search I nsti tu te , Chinese A cad emy of A gr icu ltura l S cie nces , Bei j ing
100081;
2 X ol leg e of L i f e S ci ence and T ech nology , X inj iang Vniv ersi ty
830000)
Abstract:
Gel Retardation Assay ( GRA) is an effectiv e method to identify the inter action betw een proteins and
nucleic acids, w hich is applied to the function analy sis o f transcr iption factor s. In t he present study, w e established
the GRA system for analysis of M aize t ranscr iption facto r zmCBF1 interacting w ith the cis element CRT .
Key words:
Gel retardation assay
Electrophor etic mobility shift assay
T ranscription fact or
Cis element
凝胶阻滞实验( GRA, Gel Retardat ion Assay) , 又称电泳迁移率变动实验 ( EMSA, Elect rophoretic
Mobility Shift Assay ) ,这一技术最初是用来对纯化的原核调控蛋白与 DNA 的互作进行动力学分析[ 1] , 随
后人们发现它可以用于检测蛋白粗提取物中的 DNA 结合蛋白 [ 2]。并对其作用原理进行了大量研究,蛋白
质与 DNA 的相互作用可被低离子强度缓冲液及凝胶基质的
笼蔽效应
所稳定,结合了蛋白质的核酸探针
在非变性,低离子强度聚丙烯酰胺凝胶中电泳时, 泳动速度变慢,迁移率降低, 表现为相对滞后 [ 3, 4]。近些年
GRA已发展成为体外研究核酸,尤其是 DNA 与蛋白质相互作用的一种简单、迅速而灵敏的方法,不仅可用
于体外检测 DNA 结合蛋白、RNA 结合蛋白, 还可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质以及进行未
知蛋白的鉴定[ 5] 。在转录因子研究中, 运用 GRA/ EM SA 可在体外直接研究转录因子与 DNA 结合的特异
性及其结合的核心序列等,是阐明转录因子功能的重要依据, GRA/ EM SA已成为转录因子与核酸体外相互
作用的经典方法 [ 6]。
转录因子在细胞的生长发育中起着重要的调控作用, 一般具有两个结构域: DNA 结合结构域及与其它
转录辅助因子相互作用的调节结构域;或 DNA 结合结构域及转录激活结构域; 或转录激活结构域及调节结
构域(转录辅助因子)。因此转录因子通过直接或间接地与 DNA 相互作用, 或激活或抑制,从而调控一系列
相关基因表达。如抗逆相关转录因子 CBF1( CRT/ DRE binding factor )可结合 CRT / DRE 顺式元件,调控
COR6. 6、COR 15a、COR 47、COR 78等抗寒相关基因的表达 [ 7] ; DREB1A ( DREbinding factor )结合DRE顺
收稿日期: 2005
05
30
基金项目:本研究项目受国家自然科学基金资助( 30300028)和中国农科院科研基金资助
作者简介:杨红梅( 1979
) ,女,新疆大学生命科学与技术学院硕士研究生,研究方向:植物细胞生物学
王磊,男,中国农业科学院生物技术研究所,博士,副研究员

生物技术通报

研究报告
          BIOTECHNOLOGY
BULLETIN







2005年第 6期
式元件,调控 r d29A、r d17、er d10、kin1、cor6. 6、cor15a等抗逆相关基因的表达[ 8] ,转基因表明它们明显改善
了植物抗非生物逆境的性能, 在调节植物的抗逆反应中起着重要作用。
本文采用 GRA 方法对分离的玉米抗逆转录因子蛋白( zmCBF1)进行了分析, 表明它能够特异性与
DNA 顺式元件 CRT ( C
r epeat )结合。
1
材料与方法
1. 1
顺式元件 CRT 的合成
由奥科公司直接合成以下序列
CRT( + ) : 5

AT TT CATGGCCGACCTGCTT TT T
3

CRT(
) : 3

T AAAGTACCGGCT GGACGAAAAA
5

取 CRT( + ) 2
g ( 1
g/
l ) , CRT (
) 2
g ( 1
g/
l) , 加灭菌水 31
l, 1M Tr is
HCl ( ph7. 6 ) 28
l, 1M
MgCl2 5. 6
L, 100mM EDT A 5. 6
L。反应条件: 88
2分钟; 65
10分钟; 37
10分钟; 25
5分钟。加
入 220
l的乙醇,
70
沉淀 30分钟; 11 000rpm 4
离心 15分钟,弃上清;加 70%乙醇, 11 000rpm 4
离心
5分钟, 弃上清;抽干, 溶于 20
l水,获得 CRT 元件,
20
保存备用。
1. 2
CRT 探针的同位素标记
采用 Promega 公司的 DNA 5
End
Labeling System, 反应体系是: CRT (或 mCRT) 1
l, T 4 PNK 10

buf fer 5
l,

32P
AT P 3
l, T 4 PNK( 10U/
l) 2
l, H2O 39
l; 37
20分钟; 加 2
l 0. 5M EDTA 或 68
10
分钟终止反应; 4
或
20
保存备用。
1. 3
CRT 探针和 zmCBF1蛋白质的结合反应。
蛋白质和 DNA结合反应体系: 5
binding buf fer 4
l ( 125mM HEPES
KOH ph7. 6; 50%甘油; 250mM
KCl) ; zmCBF1纯化蛋白约 4
g ( 9
l) ; 1M DTT 1
l; 上述标记的 CRT 探针 1
l; H 2O 4
l;冰上结合 30分
钟,加 3
l上样缓冲液(含 0. 025%溴酚蓝的无菌水) , 进行聚丙烯酰胺电泳分析。
1. 4
非变性聚丙烯酰胺电泳
配制聚丙烯酰胺胶( 5. 4% ) : 30%丙烯酰胺 9m l; 10
电泳缓冲液 5ml(甘氨酸 142. 7g / L , EDT A 3. 92g/
L, Tris 30. 28g / L ) ; 50%甘油 2. 5ml;去离子水 33ml; 10% APS 400
l; T EMED 25
l。待胶凝后,用 1
电泳
缓冲液电泳,预电泳 20分钟( 200V) ;上样,电泳 1小时( 200V) ;用滤纸粘下胶,保鲜膜封好后,压 X光片 1~
2小时; 洗片,显影 2分钟,定影 5分钟。
2
结果与讨论
2. 1
探针的制备与标记
为了获得 CRT 顺式元件, 合成了含有 23个碱基的 2条单连 DNA 序列, 稀释成 1
g /
l,在退火缓冲液
里进行退火,生成含有 23个碱基对的 DNA 顺式元件 CRT ,将其经乙醇沉淀,重新溶解定量后用于同位素标
记。本文采用了T 4多聚核苷酸激酶和

32P
AT P 对顺式元件进行 5
末端标记,如果是 5
突出的限制性内切
酶酶切片断(如 E coR I)也可用 DNA聚合酶和

32 P
dAT P 或

32 P
dCTP 标记。反应完毕后可用 EDTA、
加热或乙醇沉淀等方法终止标记反应, 完成探针的标记,然后置于冰上或
20
备用。
2. 2
蛋白与探针的结合反应
标记好的探针可直接用于结合反应,将纯化的具有生物活性的蛋白 zmCBF 1 与标记的 CRT 探针加入到
结合缓冲液中, 置于冰上或 4
进行结合反应 30分钟,以保持 zmCBF1蛋白与 CRT 探针的结合活性。对于
不同的蛋白,由于其性质的不同,所需要的最佳温育温度和时间可能并不完全相同,因此要获得最佳的实验
效果,需要探索不同的实验条件。
2. 3
非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影
为了保持蛋白与 DNA 的结合活性,需要采用非变性的聚丙烯酰胺凝胶在温度较低(如 0
~ 室温)的条
82





生物技术通报 Biotechnology
Bullet in





2005年第 6期
件下进行电泳, 温度不宜过高,以免影响结合效果。电泳电压也不宜过高,电压降 5~ 10V/ cm 即可, 电泳时
间 1~ 3小时,以溴酚蓝电泳到胶的 1/ 2~ 2/ 3处即可。聚丙烯酰胺凝胶的浓度根据实验用的 DNA 和蛋白
的大小可以选用 4% ~ 8%。电泳完毕后, 取下胶后可以直接压 X- 光片, 自显影时间 2~ 5小时, 时间不宜
过长,否则会引起扩散,影响效果; 或者先进行干胶,再长时间压 X- 光片。
图 1
zmCBF1 与 CRT元件的体外
结合
A: GST 蛋白与CRT 结合反应
B: GST
zm CBF1蛋白与 CRT 结合
反应
2. 4
zmCBF1与 CRT 元件的体外结合
zmCBF1属于 A P2/ EREBP 类转录因子,在已有的研究中, 已证明 zm

CBF1在酵母细胞内具有结合 CRT 元件的功能, zmCBF1 在体外是否同样
具有同样的结合功能呢, 为此,合成了含有 23 个核苷酸的 CRT 元件, 纯化
了 zmCBF1蛋白,用32P 标记作为探针, 将其与 GST、GST
zmCBF1蛋白在
体外进行结合反应, 非变性 PA GE 胶电泳后放射自显影, 结果表明 GST

zmCBF1与 CRT 探针具有结合功能,有被阻滞的电泳条带,且 GST 不影响
zmCBF1结合 CRT 元件的功能;相反, GST 不具有 CRT 探针的结合功能,
因此没有被阻滞的电泳条带(图 1)。通过 GRA/ EM SA 实验, 体外验证了
zmCBF1与 CRT 顺式元件的结合。
通过 GRA/ EM SA实验, 可以确认转录因子所识别的顺式元件( DNA)
的序列,一旦明确了转录因子所识别的 DNA 序列,就为其功能的进一步阐
明奠定了基础, GRA/ EM SA 已成为研究转录因子功能的有效手段之一。
参 考 文 献
1
Fried MG, Crothers DM. J Mol Biol , 1984, 172( 3) : 263~ 282.
2
S ingh H, Sen R, Balt im or e D, et al. Natu re, 1986, 319: 154~ 158.
3
C eglarek JA, Revzin A. Elect rophoresis, 1989, 10( 5~ 6) : 360~ 365.
4
Cann JR. E lect rophores is, 1998, 19( 2) : 127~ 141.
5
Lingqiang M, Gu an, Jun Zhao, J oh n G. Scandalios. Th e Plant Journal, 2000, 22 ( 2) : 87~ 95.
6
H yung
in Choi, Jung
hee H on g, Jin
ok H a , et al . J Biol chem, 2000, 275 ( 3) : 1723~ 1730.
7
Kir sten R, Jaglo
Ottosen, S arah J, et al . Science, 1998, 280 ( 3) : 104~ 106.
8
Qiang Liu, Kasuga M, Sakuma Yoh, et al . T he Plant C ell, 1998, 10: 1391~ 1406.

国外动态

俄利用吡昔康提高茜草愈伤培养的蒽醌产量
Plant Science 2004年 166卷 4期 1069~ 1075页报道: 俄罗斯科学院远东分院生物科学和土壤科学研究
所的科学家 V. P. Bulgakor 及其同事最近发现, 与未处理对照比较,将非类固醇类抗炎镇痛药吡昔康(炎痛
喜康)加入用于培养茜草( Rubia cor dif olia, = R. akane)愈伤的培养基, 可使这些培养中的蒽醌产量提高 2.
6倍。
认为吡昔康的这种提高蒽醌产量的效果,甚至超过常用的诱导性次级代谢物茉莉酮酸甲酯。但将茉莉
酮酸甲酯和吡昔康两者同时加入培养基时,却不存在提高蒽醌产量的叠加效应。这提示,这两种化合物可竞
争同一激活部位。 汪开治
832005年第 6期






杨红梅等: 玉米转录因子 zmCBF1 的凝胶阻滞分析