全 文 ：百合转基因研究进展
尹丽蓉1, 2 谢丙炎1* 肖启明2 杨宇红1 葛红1
( 1中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京 100081; 2湖南农业大学,长沙 410128 )
摘 要: 从百合遗传转化受体的建立和百合转基因体系的建立两方面综述了建立百合的遗传转化体系的研
究情况,后者包括抗生素的选用、转化再生植株的筛选、共培养时间、农杆菌菌株的选择。同时对近 10 年来在百合
遗传转化方面所作的研究工作进行了综述, 包括转报告基因, 转抗病、抗虫和抗病毒基因, 以及转化技术的研究。
提出了转基因百合存在的问题,并就其前景进行了展望。
关键词: 百合 遗传 受体 目的基因 转化技术
Advances of the Research on Transgenic Lilium
Yin Lirong1 , 2 Xie Bingyan1* Xiao Qiming2 Yang Yuhong1 Ge Hong1
( 1 I nsti tute of vege table s and f low er s, Chine se Aca demy of A g ri cul tur al
S ci ence s, Bei j ing 100081; 2 H unan A gr icu ltura l Univ er sit y , Chang sha 410128)
Abstract: The autho r summarized how t o establish genetic transformation sy st ems of L ilium w ere com posed
of establishing genetic t ransformat ion acceptor systems and establishing tr ansgenic systems of some o f lilium cult-i
v ars, the latter included choice antibiot ics and regeneration plants, co- cultur ed time, opt imal A grobacter ium Str ain
and so on. In recent few decades, a w ide r ange o f new carefully studying and new repor ts have been developed fo r va-
r ious genetic t ransfo rmation objects, r epo rts gene, resistant diseases, insect and t ransfer red to v irus g ene , and tr ans-
fo rmation technolog y. F inally pr esented to exist questions and prospects about tr ansgenic lil ium .
Key words: L ilium Genetic Accepto r Ta rget g ene T ransformation techno log y
百合是多年生球茎类植物, 其花具有很高的观
赏价值。加强百合育种具有很高的经济效益和社会
效益。长期以来其品质的改良都是依赖于传统的遗
传育种方法。植物分子生物学的迅速发展, 为改良
植物品质和性状提供了全新的途径,利用转基因的
手段改良百合性状和品质变得切实可行。良好的受
体系统是百合基因转化的一个关键技术环节,高效、
稳定且再生能力强的植物受体系统的建立是实现基
因转化的先决条件。对于百合而言,利用抗病基因、
抗虫基因和抗逆基因等外源基因来改良其品质无疑
具有重要意义。现就近 10年来百合转基因研究现
状综述如下。
1 遗传转化体系的建立
建立良好的基因转化离体再生系统即基因转化
的受体系统是植物基因工程的重要前提条件,基因
转化受体系统的建立, 主要依赖于植物组织培养技
术。自 1957年 Robb离体培养百合鳞茎成功以来,
百合的组织培养技术已取得显著进展。百合的再生
能力强,再生方式多样, 可通过直接分化、愈伤组织
再分化、体细胞发生等途径再生,为百合基因转化受
体系统的建立提供了方便。
1. 1 再生植株途径
利用植物组织培养技术进行百合快速繁殖时,
繁殖中间体的诱导一般可通过三条途径: 一是器官
发生途径,即通过外植体腋芽发育和不定芽的产生,
形成丛生芽块的过程; 二是愈伤组织诱导及再分化
途径。即外植体首先经诱导形成愈伤组织,然后再
经分化形成不定芽的过程; 三是胚状体发生途径,即
收稿日期: 2005-07-06
作者简介:尹丽蓉( 1980- ) ,女,湖南怀化人,植物病理学硕士研究生,从事园艺作物抗病基因工程研究, Em ail: yin lirong104@ yahoo. com. cn
* 通信作者: Em ail: x ieby@ mail. caas. net . cn
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 5期
通过外植体直接诱导产生胚状体或先形成愈伤组
织,再经愈伤组织形成胚状体的过程。在百合组织
培育过程中, 这三条途径都存在。愈伤组织再生植
物有利于产生新的遗传变异, 从中选择抵抗力强的
突变体(体细胞的无性系变异) , 以改良百合品种,提
高百合的生活力和生存力。且胚性愈伤组织是基因
转化的良好受体材料, 有利于外源基因整合到植物
基因组中。诱导愈伤组织并较长时期维持其胚性状
态对其基因转化有重要意义[ 1] 。
百合鳞片、茎尖、叶片、花梗、花托等外植体可直
接诱导小鳞茎或不定芽再生植株[ 1] 。百合鳞片切块
接种在含不同激素配比的 MS 培养基上, 鳞片基部
近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎。外植体也可
通过愈伤组织再分化小鳞茎或不定芽再生植
株[ 2~ 3]。Goto 等[ 4] 将百合茎尖接种在含 Piclor am
( 1mg/ L )的 MS 培养基上, 建立了细胞悬浮培养体
系。继代 4年后, 细胞悬浮培养物仍有较高的不定
芽发生能力,再生的植株未发现遗传变异。鳞片、花
梗、花丝、雌蕊等外植体诱导的愈伤组织还可通过体
细胞胚胎发生途径再生植株 [ 5~ 6]。Tribulato 等 [ 6]培
养百合的雌蕊、花托切段获得两种愈伤组织: 一种是
紧实、易器官分化的; 另一种是疏松、器官分化较少
的。由后一种愈伤组织建立了细胞悬浮培养, 6个月
后产生类似胚胎的结构, 转移至无激素的固体培养
基上,萌发为完整植株。在百合鳞片的切块培养中
还发现了直接的体细胞胚胎发生, 鳞片经 2, 4-D预
培养后,转入无激素的 MS 培养基上,鳞片表面可直
接产生体细胞胚胎[ 7] 。
1. 2 外植体
用于百合快速繁殖的外植体取材十分广泛, 从
根尖、鳞片叶、鳞片芽、珠芽、叶鞘、花蕾、花梗、雌蕊、
花柱、花丝到胚、实生苗都有报道, 其中以鳞片居
多[ 3, 8]。鳞片切块培养可增加单位鳞片产生的小鳞
茎数量。鳞片沿纵轴横切, 基部的切块较顶部的切
块诱导的小鳞茎数量多, 且重量大。近年来花丝、花
托等花器官的离体培养也应用于百合的快速繁殖。
Arzate等[ 2] 以麝香百合 ( L . longi f lor um)的花丝为
外植体,通过诱导愈伤组织再分化再生植株, 未发现
遗传变异。Nhut等 [ 8]用百合的花梗、花托、花瓣、花
柱、子房、雌蕊等外植体进行离体培养, 结果花托最
易成活,芽诱导率最高,并成功应用于麝香百合和天
香百合( L . aurarum)的快速繁殖。Wick remesin-
he[ 3] , Ar zate Fernandez[ 9] 等分别从鳞片、花器等诱
导愈伤组织并获得再生植株。Sundeep等 [ 10] 报导:
完全的黑暗对于 L . long if lor um 愈伤组织的诱导
是至关重要的。
1. 3 培养基和激素
百合快速繁殖使用的基本培养基有 MS、LS、
SH、N6、B5、H yponex 等,其中最常用的是 MS培养
基。Joung等 [ 11]研究了基本培养基对百合小鳞茎形
成的影响, M S 培养基较 Hyponex 培养基诱导的小
鳞茎多,且再生植株叶绿素含量较高。Lim 等[ 12] 以
MS 为基本培养基,探讨光照、糖浓度、总盐浓度对百
合小鳞茎形成的影响。在 16h 光照、30g / L 蔗糖的
条件下, 1/ 2M S促进小鳞茎的数量增加;而在连续黑
暗、90g/ L 蔗糖的条件下, 1/ 4MS 则获得最大的鳞茎
生长。T animoto 等[ 13] 研究了多胺对麝香百合鳞片
培养的影响,多胺显著促进小鳞茎的诱导, 其中效果
最好的是精胺。在百合的快速繁殖中, 应用的激素
有: BA、KT、T DZ、IAA、NAA、IBA、BR、2, 4-D、D-i
camba、Picloram[ 5~ 6, 14] 等。Haensch 等 [ 14] 将不同基
因型的百合接种在含 2, 4-D或 Picloram 的 MS 培养
基上,在 23个百合杂种中, 仅 4 种获得了体细胞胚
胎, 2, 4-D诱导体细胞胚胎的效果要比 Picloram 好。
Han 等( 1999)认为, 高浓度的 BA 抑制小鳞茎形成,
BA 配合 IAA 比单独使用 BA 诱导小鳞茎的效果
好, BA( 2mg/ L )配 IAA ( 0. 1~ 1. 0mg / L )小鳞茎增
殖最多。Ohkaw a 等 [ 14]研究了 BR 和 NAA 对鳞片
培养的影响, BR( 0. 1mg/ L )诱导的不定芽最多, 而
BR( 0. 01mg/ L )配合 NAA ( 0. 1mg / L )不仅有利于
小鳞茎的诱导, 而且有利于小鳞茎的生根。
2 百合转基因体系的建立
2. 1 抗生素的选用
在外植体与农杆菌共培养后必须使用抗生素抑
制农杆菌, 否则由于农杆菌的过度繁殖造成外植体
切口处转化细胞的死亡和不定芽诱导困难。通常使
用的抗生素有羧苄青霉素,其浓度为 250~ 500mg/
L
[ 15~ 17]
; 头 孢 霉 素, 其 浓 度 为 250 ~ 500mg/
L
[ 15~ 16, 18]
;潮霉素,其浓度为 20~ 50 mg / L [ 18]。
172005年第 5期 尹丽蓉等:百合转基因研究进展
2. 2 转化再生植株的筛选
在百合基因转化中最常用的筛选标记基因为
NPT II, 卡 那霉素筛选浓度为 100 ~ 125 mg/
L
[ 15~ 16, 18] 。
2. 3 外植体侵染农杆菌菌液后共培养的时间
不同百合品种对农杆菌敏感性不一样。百合愈
伤组织与农杆菌侵染数分钟[ 15~ 18] ,然后再黑暗共培
养2d[ 16] , 3d[ 15] , 4d [ 17] ,甚至 7d[ 18] ,诱导频率得以提
高,说明适当时间的共培养有利于转化效率的提高。
2. 4 农杆菌菌株的选择
不同的百合品种对农杆菌侵染的敏感性不同,
而不同的农杆菌菌株对不同的百合品种的侵染能力
也不同(表 l)。
表 1 百合遗传转化最佳农杆菌菌株
品种 外植体 最佳农杆菌菌株 作者,年份
Nellie White 鳞茎 C58优于 EHA101, LBA4404, K12 Cohen等[ 17] 1992
H arm on y 节间 C58/ pT iC58优于 C58-C1/ pMP90 Langeveld等[ 19] 1995
Lilium spp. 鳞茎 LBA4404 刘菊华,等[ 16] 2003
Lilium lon gifl orum Thunb 花丝 EHA105 唐东芹,等[ 15] 2004
Acapulco 花丝 EHA101 H oshi等[ 18] 2004
3 百合遗传转化的目的基因
3. 1 报告基因
早期的百合遗传转化有 GUS 基因、NPT II 基
因、CAT 基因、GFP 基因、uidA 基因、PAT 基因。
其目的是建立高效稳定的遗传转化体系, 在培养基
的选择[ 4~ 14, 16]、筛选剂种类 [ 15]、筛选剂浓度[ 15~ 16] 、筛
选时间 [ 18]、农杆菌菌株的选择 [ 17, 1 9]、不同的载
体[ 17, 19]、共培养的条件[ 15~ 19] 等获得了许多成果。
3. 2 抗病基因
由于百合的病害十分严重, 抗病育种成为近年
来百合育种工作的一个新热点。将抗病的相关基因
转入栽培品种, 从中筛选出既具有优良的观赏价值,
又具较强抗性的植株。刘菊华等用携带有几丁质酶
基因和-1, 3葡聚糖酶基因的工程菌,通过农杆菌介
导法和基因枪转化法转化龙牙百合, Southern 点杂
交检测外源基因整合到染色体上[ 16] 。
3. 3 抗虫基因
在切花百合的栽培中, 虫害是影响百合生产的
一个重要问题, 其中危害较大的虫害主要有蚜虫、红
蜘蛛和几种鳞翅目害虫。蚜虫从两个方面危害百
合,一是吸取植物汁液造成直接危害,二是传染病毒
导致品种退化, 对百合生产和品质造成很大的影响。
目前在植物抗虫基因工程中, 已被广泛应用的抗虫
基因有苏云金芽孢杆菌基因,植物外源凝集基因,植
物蛋白酶抑制剂基因和淀粉酶抑制剂基因等四类。
其中植物外源凝集基因在自然界广泛存在,种类很
多, 它能特异识别可逆结合糖类复合物的糖基部分
而不改变被识别糖基的共价结构, 是一类非免疫蛋
白。唐东芹等将半夏凝集素基因 pBIXPTA 通过农
杆菌导入百合基因组中, 分子检测证明已整合到百
合基因组中[ 15]。
3. 4 抗病毒基因
病毒病也是百合的主要危害之一。早在 20世
纪初就发现病毒具有交叉保护现象, 利用这一原理
人们开展了大量的转基因研究工作, 为百合病毒病
的防治开辟了一条新途。Langeveld 等[ 20] 1997 年以
基因枪法将百合无症病毒 LSV 外壳蛋白基因导入
百合鳞茎部分组织, 经过 4个月的潮霉素抗性愈伤
筛选, 95%的愈伤表现 GU S+ 。
4 遗传转化技术
4. 1 农杆菌介导法
农杆菌介导的遗传转化是通过感染将农杆菌所
带的经过或未经过改造的 T-DNA 导入植物细胞,引
起相应的植物细胞的可遗传变异[ 1] 。百合是单子叶
植物, 传统观念认为单子叶植物不是农杆菌的有效
寄主。但近年的研究表明, 农杆菌系统也可成功应
用于单子叶植物的基因转化。1992 年 Cohen[ 17] 以
鳞片切段与致癌农杆菌菌株 C58共培养, 得到瘤状
突起,并在愈伤组织中检测到冠瘿碱基因的表达,首
次报道了利用农杆菌介导法对单子叶植物的百合进
行遗传转化, Cohen的试验表明能否转化取决于农
杆菌的株系。Langeveld等[ 19] 把几种农杆菌株接种
18 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
到百合植株上, 接种后百合的茎间产生肿瘤组织,
GU S 标记基因得以表达, 表明百合是农杆菌的寄
主。唐东芹等以百合花丝诱导胚性愈伤组织利用根
癌农杆菌介导半夏凝集素基 pBIXPTA [ 15] ; 刘菊华
等用携带有几丁质酶基因和 -1, 3葡聚糖酶基因的
工程菌,以鳞片叶通过农杆菌介导法和基因枪转化
法转化龙牙百合 [ 16]均得到转基因植株。日本新泻农
业研究机构以花丝诱导愈伤组织通过农杆菌介导获
得百合转基因植物的生产 [ 18]。
4. 2 电激法
又称电激穿孔法。它利用高压放电产生的脉冲
使细胞膜产可逆的微孔从而使外源 DNA 等大分
子通过这一通道进入细胞。电激法最早应于原生质
体的转化[ 1] 。M iyoshi等[ 21] 以百合花粉原生质体为
受体, 用电激法导入 GU S 基因, 得到了瞬时表达。
但原生质体再生植株困难,近年来不少学者避开原
生体再生途径, 利用电激法直接转化带壁的植物组
织或细胞。Wu 等[ 22] 将百合的鳞片组织质壁分离,
通过电激法将 GU S 和 GFP 基因直接导入, 在百合
鳞片组中得到 GUS 和 GFP 基因瞬时表达。
4. 3 基因枪法
又称微弹射击法,是一种将载有外源DNA 的金
属(钨或金)经驱动后通过真空小室进入靶组织的一
种遗传转化技术 [ 1]。荷兰植物育种和繁殖研究中心
( CPRO-DLO)应用基因枪法将报告基因 GUS、NPT
导入百合花粉, 授粉后得到了表达 GU S、N PT
的转基因植株 [ 23]。1993 年 Nishihara 等[ 40] 用基因
枪法轰击百合的花粉,获得 GUS 基因的瞬时表达。
Watad等[ 24] 应用 BilisticsPDS1000/ He系统,对百合
愈伤组织进行轰击转化, 选择标记基因是 PAT, 选
择剂是 bialaphos, PCR分析和 southern杂交证实得
到了 3株含 PA T 基因的百合转基因植株。日本广
岛大学以花粉为受体,用基因枪法导入了 GU S 报告
基因[ 25] ;荷兰的 Leiden 大学应用基因枪法, 导入病
毒的外壳蛋白基因, 获得抗病毒的百合[ 20] 。
5 展望
植物基因工程的发展, 促进了百合基因工程的
发展,在百合基因转化受体方面, 已有较多的报道。
通过基因枪法、花粉介导法等多种基因转化方法,获
得了转基因百合植株。由于百合基因工程仍处于起
步阶段,成功的报道较少, 稳定、高效表达的基因仅
限于报告基因, 多数基因仅获得瞬时表达。因此,如
何提高转化效率, 建立高效、重复性好、无基因型依
赖性的基因转化系统成为今后百合转基因技术研究
的趋势和重点。我们也正在开展百合的转基因研
究,将抗病、抗盐碱基因导入百合,旨在获得抗病、抗
盐碱的转基因百合。
参 考 文 献
1 张献龙, 植物生物技术. 北京:科学出版社, 2004, 35~ 69, 287~
300.
2 Arzate FAM, et al . J Plant Cel l Rep, 1997, 16( 12) : 836~ 840.
3 Wick remesinh e ERM, H olcom b EJ, ARTECA RN. J S ci H ort ,
1994, 60: 43~ 152.
4 Godo T, Kobayashi K, T agami T , et al. J Sci H ort, 1998, 72
( 324) : 193~ 202.
5 Haen sch KT. J Garten bauwissensch af t , 1996, 61( 5) : 214~ 218.
6 Tribu lato A, et al. J Acta H ort, 1997, 447: 205~ 220.
7 刘选明, 周朴华, 等. 园艺学报, 1997, 24( 4) : 353~ 358.
8 Nhut DT. J Sci H ort , 2001, 87: 131~ 138.
9 Arzate Fernan dez AM , Nakazaki T , Okumoto Y, et al . J Plant
C ell Rep, 1997, 16 ( 12) : 836~ 840.
10 Sundeep P, Sum it ra S , Priyadarshi S, et al. J Plan t Cell , Tis sue
and Organ Cultur e, 1992, 30 ( 3) : 193~ 197.
11 Joung HY, Sungm S, Leew W, et al. J RDAJourn al of Agri Sci
Hort , 1995, 37( 1) : 378~ 383.
12 Lim S, Seon JH, Son SH , et al. J J Korean Soc H or Sci , 1998,
39( 1) : 107~ 110.
13 T animoto M . J Plant Cell Rep, 1995, 15: 297~ 300.
14 Ohkaw a M, Ohshir o T, Ik ekaw a T. J Environment Cont rol in
Biology, 1996, 34( 1) : 15~ 19.
15 唐东芹, 钱虹妹, 等.上海交通大学学报, 2004, 22 ( 2) : 135~
137.
16 刘菊华, 金志强, 等. 分子植物育种, 2003 , 4( 2) : 465~ 474.
17 C oh en A, et al. J Acta H ort , 1992, 325: 611~ 618.
18 Y H oshi, et al. J Plan t Cell Rep, 2004, 22: 569~ 364.
19 Langeveld SA, et al . JE uphyt ica, 1995, 85( 1) : 97~ 100.
20 Langeveld SA, et al . J Acta H ort , 1997, 430: 290.
21 M iyoshi H, Usami T , T anak a I. J Sex Plan t Rep, 1995, 8( 4) :
205~ 209.
22 Wu FS, Feng TY. J Plant Cell Rep, 1999, 18( 5) : 381~ 386.
23 Van Tu yl JM , et al. J Acta H ort , 1996, 414: 35~ 45
24 Watad AA, J Plant Cell Rep, 1997, 17( 4) : 262~ 267.
25 T anak a T, et al. J Plant Mol Biol , 1995, 28( 2) : 337~ 341.
192005年第 5期 尹丽蓉等:百合转基因研究进展