全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第3期
聚 β-羟基丁酸(poly-β-hydroxybutyrate,简称 PHB)是细菌细胞内积累的一种高分子聚合物,是制造生物
降解塑料的重要原料。目前研究得较多的用于合成和提取 PHB的微生物有产碱杆菌属(Alcaligenes)、假单
胞菌属(Pseudonomas)、红螺菌属(Rhodospirillum)以及基因重组大肠杆菌(E.coli)。但 PHB作为高分子材料,
它在应用中具有热塑性所涉及的纯度和分子量要求,使得其提取难度大,成本高,尚难大规模工业生产。球
衣菌是活性污泥中的一类主要丝状细菌,对有机物和有毒物质有很强的降解作用,并且细胞内可积累较高
含量的 PHB,可利用酸化的污水进行培养获取大量的菌体用于提取 PHB,因此,近年来球衣菌作为合成
PHB的新的菌种资源,日益受到重视[1,2]。但是,球衣菌具有衣鞘,离心获得的菌泥很粘稠,水分多,使 PHB
提取难度更大,提取率低,关于球衣菌胞内 PHB的提取,目前尚未有较深入和全面的研究报道。采用摇瓶培
养的球衣菌 FQ40为材料,探索不同试剂、不同因素对提取效果的影响,以期建立一种简便、经济、有效的提
取工艺,为球衣菌的开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1菌种
球衣菌种(Sphaerotilus natans FQ40):从福州祥坂污水处理厂活性污泥中分离获得。
1.2培养基
球衣菌胞内聚β- 羟基丁酸提取方法的研究
许旭萍 1 陈接锋 1,2
(1福建师范大学生物工程学院,福州 350007;2福建省宁德市人民政府农业办公室,宁德 350000)
摘 要: 以球衣菌(Sphaerotilus natans FQ40)为材料,比较多种破壁方法对其胞内PHB提取率的影响。结果表明
SDS-NaClO混合破壁法最适宜于提取球衣菌胞内PHB。细胞悬液先用10g/LSDS,35℃处理10min,再用体积分数5%的
NaClO处理5min后,经离心、洗涤、烘干,用热氯仿抽提PHB,提取率可达56%,纯度与标准品相同。
关键词: 球衣菌 PHB提取
Study on Poly-β-hydroxybutyrate(PHB)Extraction of
Sphaerotilus Natans
Xu Xuping1 Chen Jiefeng1,2
(1Bioengineering College,Fujian Normal University,Fuzhou 350007;
2Fujian Ningde government agricultural office,Ningde 350000)
Abstract: The effect on extraction rate of several different methods for breaking up Sphaerotilus natans cell wall
was conducted. The results showed that the combined SDS-NaClO treatment method was the optimum for extraction
PHB from S.natans.The cells was treated by 10g/L SDS at 35℃ for 10 min first, and then by 5%(v/v) NaClO for
5min. After the treated suspention being centrifuged, washed and dryed, the PHB was extracted with hot chloroform. At
this conditions, the extraction rate could reach 56%,and the purity of PHB was coincident with the standard.
Key words: Sphaerotilus natans PHB Extraction
收稿日期:2005-07-25
基金项目:福建省教育厅资助项目(No. KA20097)
作者简介:许旭萍,女,副教授,硕士生导师,研究方向:微生物生物化学
通讯作者:陈接锋
2006年第3期 许旭萍等:球衣菌胞内聚β-羟基丁酸提取方法的研究
斜面培养基 CGY:同文献[2];种子培养基:蛋白胨 5.0g/L,酵母膏 1.0g/L,甘油 10.0g/L,pH7.0,分装到 250ml
三角瓶中,每瓶 50ml,121.3℃灭菌 20min,备用;最佳发酵培养基:蔗糖 10g/L,牛肉膏 5g/L,MgSO4·7H2O0.2g/
L,CaCl2 0.05g/L,FeCl3 0.01g/L,K2HPO4 0.04g/L,KH2PO4 0.03g/L,NaH2PO4·2H2O 0.05g/L,H3BO3 0.005g/L,蒸
馏水定容至 1L,pH7.0,分装到 250ml三角瓶中,每瓶 80ml,121.3℃灭菌 20min,备用。
1.3 球衣菌培养方法
从活化的 CGY斜面上挑取 2环菌种接种到种子培养基中,30℃,150r/min摇瓶振荡 18~24h,进行种子
培养。在 50ml发酵培养基中,以体积百分数为 5%的接种量接入液体种子,30℃,150r/min摇瓶振荡 40h,进
行发酵培养。
1.4 发酵培养湿菌体的破壁处理[3~6]
1.4.1 细胞制备 取 100ml发酵液,4000r/min离心 20min,菌体用蒸馏水洗涤、离心。
1.4.2 超声波破碎法 将离心获得的湿菌体 (干重 0.45g)悬浮于 50ml蒸馏水中,用超声波破碎机处理
5min,然后停机 1min,再处理 5min,如此反复 3次。
1.4.3 冻融法 将离心获得的湿菌体(干重 0.45g)在-20℃低温冰箱中冷冻 2h结块,然后立即在沸水中融
化,如此反复 3次。
1.4.4 氨法 在湿菌体(干重 0.45g)中加入氨水使其终浓度为 1mol/L,在 45℃水浴中搅拌一定时间。
1.4.5 SDS(十二烷基硫酸钠)或 NaClO处理法 将离心获得的湿菌体(干重 0.45g)悬浮于蒸馏水中,加入
一定量的 SDS或 NaClO溶液,使其总体积为 50ml,在一定温度的水浴中搅拌处理。
1.4.6 SDS-NaClO混合处理法 将离心获得的湿菌体(干重 0.45g)悬浮于 42.5ml蒸馏水中,加入 100g/L
SDS 5ml,在一定温度的水浴中搅拌处理 10min,然后再加入 2.5mlNaClO溶液,继续搅拌处理 5min。
1.4.7 PHB抽提 将以上破壁处理后的菌液以 4000r/min离心 20min,沉淀用蒸馏水和丙酮各洗涤一次,
于 60~70℃下烘干。干品用 15ml氯仿于 60℃抽提 60min后,过滤,滤液加热蒸发,除去氯仿,析出 PHB,再用
丙酮和乙醇各洗涤 1次,60℃烘干,得到白色粉末或薄膜状 PHB。用电子天平称重,计算 PHB的质量百分提
取率(Y/%)。
Y= WPHB
Wcel×CPHB
×100%
式中:WPHB——100ml发酵液中的菌体提取获得的 PHB质量,g;
Wcel——100ml发酵液中的菌体的细胞干重,g;
CPHB——胞内 PHB含量,%。
(经气相色谱分析表明,在相同培养条件下获得的菌体,其胞内 PHB含量为 48%。)
1.5 PHB的气相色谱分析
采用内标法进行气相色谱分析[1]。准确称取 1~10mg 提纯的 PHB样品或 1~10mg标准品,加入 1ml氯
仿和 1ml酸化甲醇(含体积分数为 3%的硫酸和 200mg/L的内标物苯甲酸),盖紧试管口,使其封闭,在 100℃
水浴中甲酯化 4h,冷却至室温,加 1ml蒸馏水充分震荡,3000r/min离心 5min,混合液分为两相:下层为溶
有 PHB的氯仿相;上层为含硫酸和亲水性成分的水相;两相界面有少许固形物。将溶解在氯仿层中甲酯化
的 PHB单体用气相色谱进行分析。气相色谱条件:3.5%PEGA,2m柱长,载体为 N2,流速为 40ml/min,进样
器温度为 200℃,检测器温度为 250℃,柱温 80℃维持 2min,然后以 20℃/min升高至 195℃,维持 3min,采用
FID检测。以样品与标准品峰面积的比值表示纯度。
1.6 PHB的核磁共振分析
在 VarianUnity-500核磁共振仪上进行分析。以 CDCl3为溶剂,PHB样品浓度为 5g/L,记录碳谱(13C-
NMR)和氢谱(1H-NMR)。
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
2.5 NaClO法破壁提取 PHB
NaClO能够有效破坏细胞壁,并降解细胞内非 PHB杂质。分别对 NaClO浓度、处理时间和处理温度进行
研究,结果(表 1)表明,当 NaClO体积分数为 5%时提取率达到最大(55.2%)。随着 CNaClO的增加,因 PHB被
氧化降解而使提取率逐渐下降。实验过程中还发现,如果菌体用 NaClO处理后不经烘干而在水相中直接利用
氯仿进行抽提,则提取率较低,仅为 17%左右,这主要是因为湿菌泥很粘稠,搅拌困难,不利于 PHB从水相转
移至氯仿相而造成损失。当处理时间为 5min时,其提取率最高。若延长处理时间,会引起部分 PHB降解,从
而降低提取率。当温度在 20~35℃之间时,随着处理温度的升高,提取率逐渐增加,至 35℃时,达到最大,为
54.7%,而当温度继续上升时,提取率开始下降。
表1 NaClO对PHB提取率的影响
图2 SDS对PHB提取率的影响图1 氨水对PHB提取率的影响
2 结果与讨论
2.1 超声波破壁法提取 PHB
经超声波处理后,粘稠菌悬液的流动性明显增强,长细胞链断裂成短链,细胞也部分破碎,具有一定的
破壁效果,再经热氯仿抽提,提取率约为 28%。
2.2 冻融法破壁提取 PHB
菌体经过 3次反复冻融破坏细胞结构后,再经热氯仿抽提,提取率为 25.9%。
2.3 氨法破壁提取 PHB
氨法破壁处理提取 PHB,是利用碱性条件下氢氧根离子的皂化作用溶解细胞壁中的脂类物质,使细胞
壁通透性增强,从而释放出 PHB,过程简单,成本低。球衣菌 FQ40菌体分别采用不同处理时间(C(NH4OH)=
1mol/L)和不同浓度氨水(t=10min)进行实验,结果见图 1。时间实验结果表明,处理时间对 PHB提取率的影
响不大,将提取时间从30min延长至 120min,其提取率仅从 35.2%提高到 37.1%。浓度实验结果表明,当 C
(NH4OH)为 2mol/L时,提取率最高,为 36.9%,随着 C(NH4OH)的升高,其提取率有所下降,这可能是由于
PHB在碱性条件下被部分降解所致。尹进在用十二烷基磺酸钠纯化重组大肠杆菌中的 PHB时发现,碱溶液
可摧化 PHB分子的酯键发生水解,碱性越强,水解反应越容易进行,十二烷基磺酸钠虽是弱碱,但也能使
PHB部分降解[6]。因此,采用 C(NH4OH)2mol/L,预处理 10min较适宜。
2.4 表面活性剂(SDS)破壁法提取 PHB
设置了不同处理时间和不同浓度来研究 SDS对球衣菌的破壁效果,实验结果(图 2)表明,当处理时间 t
为 10min(CSDS=10g/L)或 CSDS为 10g/L(t=10min)时,PHB提取率均达到最大,分别为 36.7%和 37.6%。随着
CSDS增加和 t的延长,提取率都呈下降的趋势。
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表2 不同方法对PHB提取率的影响
2.6 SDS-NaClO混合处理提取 PHB
实验结果表明,经过混合处理后,PHB的提取率可达 56%,而且纯度与标准品一致,符合工业化生产要
求。这是因为先加入 SDS,SDS首先作用于脂类和蛋白质,后加入的 NaClO可破坏细胞壁的网状结构使之成
为溶于水的物质,从而可以进一步增大非 PHB杂质的去除率,提高 PHB的纯度。
2.7 不同破壁方法对球衣菌 PHB提取率的影响
PHB是微生物的胞内产物,提取微生物胞内物质,通常需要先进行破壁处理,但人们在提取 PHB时认
识到:提取剂的种类、使用浓度、作用时间、作用温度等工艺条件对提取率、PHB的纯度、分子量均有显著影
响;微生物种类不同,其细胞组成和结构也不同,应选择不同的破壁方法;NaClO等多种试剂可导致 PHB聚
合物降解,降低其工业应用价值。因此,如何既有效的破坏细胞壁,又尽可能降低 PHB的降解程度,是提取
工艺的关键所在。对于球衣菌胞内 PHB的提取方法,有关报道较少,徐艳霞和张立新曾简略介绍了冻融法
[2,8]。由于球衣菌细胞外具有衣鞘,PHB提取难度更大,为了建立适用于球衣菌 PHB的提取工艺,我们对以上
6种破壁方法进行研究,结果表明,采用不同的方法,提取率有较大的差异。从表 2可以看出,采用 NaClO或
许旭萍等:球衣菌胞内聚β-羟基丁酸(PHB)提取方法的研究
SDS-NaClO混合处理提取 PHB,都能够得到较高的提取率,
但气相色谱分析结果显示后者提取获得的PHB纯度较高,
说明SDS-NaClO混合处理法最适用于球衣菌胞内 PHB的提
取。而采用超声波处理、冻融法、氨法或表面活性剂法等破
壁提取 PHB,都难以得到较高的提取率。
2.8 气相色谱分析
用气相色谱对提取获得的 PHB样品进行定性、定量和
纯度分析。采用 SDS-NaClO对球衣菌细胞进行破壁处理后,
再用氯仿法提取,获得白色粉末样品,经气相色谱对其纯度
分析表明(图 3),样品的主要组分和 PHB标准品的校正保
留时间(tr)分别为 2.204和 2.189,基本一致,表明此白色粉
末物为 PHB。而且样品与标准品 (美国 AldrichChemical
CompanyInc产品)的相对峰面积比值为 1.02∶1,可见其纯
度不低于标准品,符合工业化应用的要求。因此,SDS-Na-
ClO/氯仿法最适用于提取球衣菌胞内 PHB。而单独使用
NaClO提取,样品与标准品的相对峰面积比值仅为 0.89∶1。
2.9 核磁共振分析
用核磁共振仪分析所得样品的碳链骨架结构,在所得
13C-NMR谱图(图 4)中,在 δ77处的吸收峰由溶剂 CDCl3产
生;此外,有 4个吸收峰(分别位于 δ19.641;δ40.644;δ67.485;
δ169.036)与标准品 PHB谱图表征一致,并和 Seikwang
hahn等人所报道的从 Alcaligeneseutrophus和重组 E.coli中
提取的 PHB13C-NMR谱图表征一致,它们分别代表聚合物中
Time/min
图3 PHB样品的GC图谱
图4 PHB样品的 13C-NMR图谱
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
的 4组碳原子(即—CH3,—CH2,—CH和—COO—基团中的碳原子)。测得的1H-NMR谱图(图 5),在 δ7.256
处的吸收峰由溶剂 CDCl3产生;另外的几个吸收峰(分别位于 δ1.249,δ1.262;δ2.435,δ2.447,δ2.466,δ2.477,
δ2.566,δ2.581,δ2.597,δ2.612;δ5.233,δ5.246),与标准品 PHB的一致,也与徐艳霞报道的球衣菌精制
PHB1H-NMR谱图表征基本一致,分别代表—CH3,—CH2和—CH中的氢原子。
图 5 PHB样品的 1H-NMR图谱
参 考 文 献
1 TakedaM,MatsuokaH,HamanaH,etal.ApplMicrobiolBiotech,1995,43(1):31.
2 陈接锋,许旭萍,佘晨兴,等.工业微生物.2003,33(4):23,31.
3 WiliamJP,AnthonyC.ApplEnvironMicrobiol,1993,59(12):4236.
4 潘贵全,盛青,秦杰.化工冶金,1999,20(3):286.
5 陈银广,陈坚,堵国成.无锡轻工大学学报,1998,17(3):5.
6 尹进,于慧敏,李红旗.生物工程学报,1998,14(3):342.
7 DoiY,KawaguchiY,NakamuraY,etal.ApplEnvironMicrobiol,1989,55(11):2932.
8 徐艳霞,刘世旺.资源开发与市场,2000,16(5):274.
(上接第57页)
由于ESR基因全长在140kb以上,其中包含许多酶切位点,可能存在丰富的酶切位点多态性。要实现对ESR
基因的基因型选择,首先必须全面系统地研究ESR基因的酶切位点多态性及其与产仔性能的关系。不过目前猪
的基因定位已取得重大进展,特别对猪产仔数和早期生长基因的分子遗传学研究有了突破性进展。同时ESR基
因与其他繁殖性状(初生窝重、断奶窝重、有效乳头数等)及生产性状之间(背膘厚、生长速度、胴体重等)的关系仍
要深入研究。当然现已利用ESR基因进行标记辅助选择(MAS),可以提供高窝产仔数。结合标记辅助渗入(MAI)
技术有可能培育出产仔数多、生长快、背膘薄的新母本群体,从而提高经济效益。
秦春圃
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