全 文 ： 技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
蛋白质相互作用研究方法及其应用
王海波 安学丽 张艳贞 王爱丽 李巧云 晏月明
(首都师范大学生命科学学院,北京 100037)
摘 要: 过去 10年来, 蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重要内容,更是成
为国内外竞相研究的重点, 研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。着重就经典的噬菌
体展示、酵母双杂交以及新近发展起来的串联亲和纯化、荧光共振能量转移技术和表面等离子共振等蛋白质相互
作用研究方法的原理及应用作一综述并展望其发展前景。
关键词: PDT Y2H TAP FPET SPR
Approaches and Applications of ProteinProtein Interaction Studies
W ang Ha ibo An Xueli Zhang Yanzhen Wang A ili L iQ iaoyun Y an Yuem ing
(C ollege of L ife S cience, Cap italN orm al Un iver sity, B eijing 100037)
Abstrac:t W ith the fulfill ofHGP ( Human genom ic pro ject), the study topro te in is spring up. P rote in- pro tein in
teraction is one of im portant sub jects of P roteom ic, it is im plicated in every ce llu lar processes. Now m anym ethods have de
ve loped to iden tify and charac terize prote inpro te in in teractions. The ma in content of this paper is desc ribe both c lassical and
espec ia lly recentm ethods to study pro te inprote in interactions such asYeast twohybr id system ( Y2H ), Tandem a ffin ity pur
ification( TAP ), F luorescence resonance energy transfe r( FRET ) and Surface plasm on resonance( SPR ), from the princ ip le
to process of these techno log ies, som e new achievem en t obta ined by these me thods a lso introduced.
Key words: PDT Y2H TAP FPET SPR
作者简介:王海波,硕士研究生,首都师范大学生命科学学院 608实验室
通讯作者:晏月明, Te:l 01068902777; Em ai:l yanym 2004@ 163. com
随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息
转向研究基因功能, 一门新的学科 蛋白质组学
应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变
化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸
之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于
机体每个细胞的生命活动过程中, 相互交叉形成网
络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,
对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最
主要研究内容之一, 迄今已发展了包括经典的噬菌
体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛
应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表
面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互
作用的高通量分析方法, 为蛋白质组学的发展奠定
了坚实的基础。
1 噬菌体展示技术 ( PDT)
大肠杆菌丝状噬菌体包括 f1、fd和 M13, 它们只
感染含 F因子的大肠杆菌。 1985年, 美国 M issouri
大学 Sm ith博士等人 [ 1]将 R I核酸内切酶基因片段
连接到丝状噬菌体 fd编码次要外壳蛋白的基因
中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子
的噬菌体颗粒。后经验证,该噬菌体能被 E coR核
酸内切酶抗体有效中和, 说明展示在噬菌体外壳表
面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构
象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术
( Phage d isp lay techn iques, PDT )的诞生。
噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后
才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。 1990
年 Scott等人 [ 2 ]利用噬菌体展示技术构建了随机多
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
肽文库,该文库由特定长度的随机短肽组成,理论上
包含了某一固定长度短肽所有氨基酸的排列组合方
式。由于蛋白质间的识别与结合主要取决于局部肽
段中少数几个氨基酸, 所以用受体蛋白对随机肽库
进行亲和筛选,就能得到之结合的短肽序列,根据此
短肽的序列,就可以得到与目的蛋白相互作用所依
赖的氨基酸残基 [ 3] ,从而可以进一步研究蛋白质之
间的分子识别,酶与底物的结合等等,突破了传统研
究蛋白质相互作用时需对其结构详尽了解的限制。
噬菌体展示技术最大的特点在于被展示在噬菌
体表面的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构
和生物活性,建立起了基因型和表现型之间的一致
性。到现在已相继成功构建了 f1、M13、T4等噬菌
体表达载体,为蛋白质组学的发展提供了有利的工
具。 Jespers等 [ 4]利用噬菌体展示技术, 通过热变性
发展了一种选择抗凝集蛋白的方法, 这一方法的建
立对于抗凝集蛋白的选择、鉴定;防止或促进蛋白的
凝集反应以及诊断由凝集蛋白引起的疾病等方面都
意义重大。
2 酵母双杂交系统 ( Y2H )
酵母双杂交系统 ( Y east twohybrid system,
Y2H )是 1989年由 F ields等 [ 5]提出并初步建立的,
主要用于研究真核生物的蛋白质,到现在,双杂交系
统已经成为检测和鉴定蛋白质相互作用的标准方
法,并且在旨在建立一系列蛋白质相互作用关系的
蛋白质组研究中扮演着重要角色 [ 6]。
Y2H的建立是基于人们对酵母半乳糖苷酶基
因的转录激活因子 GAL4的详细了解。GAL4包括
两个可以独立的结构域: N末端的 DNA 结合域
( DNAb ind ing doma in, DNABD )和 C末端的转录激
活域 ( T ranscription act ivating doma in, DNAAD )。
DNABD可以与 DNA分子的上游激活序列结合,
DNAAD则可以激活下游基因的转录,只有当两者
在空间上充分接近时才会共同作用激活转录活性。
双杂交技术正是利用了 GAL4的这一特点,将欲研
究的两个目标蛋白的编码序列分别与 GAL4的结合
域和激活域的编码序列融合,构建成两个杂交系统;
再将这两个杂交系统共同转化至含有报告基因的酵
母细胞株; 若两个目标蛋白发生相互作用, 则会使
DNA - BD和 DNA - AD在空间上靠近进而激活报
告基因的表达。
酵母双杂交系统简单快速, 最常用于鉴定与已
知蛋白相互作用的未知蛋白, 同时也是发现新的蛋
白质相互作用以及确定相互作用结构域的重要研究
手段。TRPC通道是一组 Ca2+流量调节通道蛋白,
研究证明磷脂酶 C1 ( phospho lipase C1, PLC1 )
结合并控制该通道, 对降低 Ca2+流量是必要的, 但
一直没有鉴定出它们相互作用的结构域。Ros
sum
[ 7]等人应用 Y 2H系统, 构建了 pGBKT7BDTR
PC3和 pGADT7ADPLC1两个载体, 共同转化到
酵母当中,以 Lacz为报告基因,发现 PLC1只特异
的与 TRPC3相结合。实验人员又构建了载有不同
氨基酸长度 TRPC3与 PLC1的双杂交系统, 发现
TRPC3与 PLC1的相互作用只依赖于 TRPC3中对
应的 PH相似结构域中 40~ 46个氨基酸,从而建立
了一个广泛的信号转导模型。
3 串联亲和纯化 ( TAP)
近年来质谱技术发展迅速, 其功能强大且灵敏
度高,常用来鉴定相互作用的蛋白质复合体或复合
体亚基,但通常难以获得足够量纯化的蛋白质复合
体,成为质谱在这方面应用的一个限速步骤 [ 8]。
1999年 R igaut[ 9]等人共同提出了一套分离复合蛋
白的新方法 串联亲和纯化 (T andem affin ity puri
fication, TAP), 兼具标准亲和纯化和免疫共沉淀两
种生化方法的优点,为蛋白质复合体的分离鉴定提
供了一条新路径。
串联亲和纯化技术首先需通过基因工程给被分
离纯化蛋白的一端加一个 TAP标签, 该标签由 IgG
结合结构域 ( P ro tA )及一个钙调蛋白结合多肽
( CBP)组成,结构域与多肽之间由一个 TEV蛋白酶
切位点隔开。通过基因重组将细胞内源性的目标蛋
白基因置换为带有 TAP标签的基因, 温和裂解细
胞,获取细胞抽提物, 将抽提物加入 IgG亲和柱,
TAP标签的 Pro tA端会与 IgG形成强结合, 在用洗
脱液洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白后, 再
用含有 TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割
下来。在钙离子参与下,被切割下来带有 CBP的蛋
白质复合体与钙调蛋白紧密结合, 充分洗脱,就可以
进一步去除非特异作用的蛋白质杂质,最后纯化出
高纯度的目的蛋白复合体。
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2006年增刊 王海波等: 蛋白质相互作用研究方法及其应用
利用串联亲和纯化技术,通过对洗脱后的复合
体作质谱分析或电镜观察,可以快速的发现细胞中
新的蛋白质复合体或鉴定出复合体中的新组分。
Dziembow ski等人 [ 10 ]应用 TAP技术,纯化分析了酿
酒酵母 (Saccharomyces cerevisie)前体 mRNA拼接酶
复合体 U2微小核糖核蛋白颗粒 ( sma ll nuclear ribo
nuc leoprotein particle, snRNP)关联拼接因子 SF3a和
SF3b。在对 SF3b的纯化中分离出了一个新的重要
的蛋白亚基 Ysf3p。按照先前的观点, 认为在酵母
SF3b中存在一个 Snu17p亚基,是人类 SF3b因子中
p14亚基的直系同源物, 在此次试验中却发现
Snu17p不属于酵母 SF3b因子, 而是属于本实验中
新发现的另一个拼接酶复合体 RFS的一个组分。
4 荧光共振能量转移 ( FRET)
采用标签法检测和分离蛋白的方法虽然有效但
也存在缺点,比如说分离蛋白标签可以改变蛋白的
溶解性并且不能在活体细胞中进行等 [ 11]。荧光共
振能量转移 ( F luorescence resonance energy transfer,
FRET )是近年来迅速发展的一种新技术,其最大的
特点就是可以在活体细胞生理条件下对蛋白质间的
相互作用进行实时的动态研究, 已成为现代蛋白质
组学研究的有力工具。
一对合适的荧光物质构成一个能量供受体对
时,能量在它们之间可以发生转移, 1948年 Frster
提出的这一荧光共振能量转移理论奠定了 FRET技
术的理论基础。 1992年, P rasher等 [ 12]首次从维多
利亚水母中分离并克隆了一种荧光物质 绿色荧
光蛋白 ( g reen fluorescent pro tein, GFP)。随后, He im
等 [ 13]通过点突变等方式,得到了多种荧光光谱不同
的荧光蛋白,如蓝色荧光蛋白 ( blue f luorescence pro
tein, BFP) , 黄色荧光蛋白 ( yellow fluorescence pro
tein , YFP )和蓝绿色荧光蛋白 ( cyan fluorescence
pro tein, CFP )等, 提供了大量的能量供受体, 为
FRET技术提供了现实基础。目前 FRET技术中常
用的荧光蛋白对是 YFP和 CFP, 当与荧光基团融合
的被研究蛋白发相互作用时,荧光基团在空间上靠
近,发生能量转移,通过检测供受体分子发射程度比
率的变化就可得知蛋白质结合程度的强弱。
目前, FRET技术已在检测酶活性变化、膜蛋白
的研究、信号转导、细胞周期调控等研究中发挥了重
要作用。例如在细胞凋亡相关蛋白的研究中, 天冬
氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶在细胞凋亡的执行期发
挥关键的作用。Re iko等 [ 14]利用 FRET技术研究了
Caspase8与其底物 B id蛋白质间的相互作用,将 B id
蛋白两端分别与 CFP和 YEP融合,精心设计使其在
没有被酶裂解前刚好可以发生共振能量转移, 当
B id蛋白被裂解后,能量转移效应自然消失,从而很
好的检测了 Caspase8酶的活性。
5 表面等离子共振 ( SPR )
表面等离子共振是数理科学与生物学相互渗
透、结合而产生的一种全新的研究生物大分子之间
相互作用的方法,近几年在生物技术领域得到了广
泛的应用。表面等离子共振 ( Surface p lasmon reso
nance, SPR )是一种物理光学现象,当一束平面单色
偏振光以一定角度入射到镀在玻璃表面的薄层金属
膜上发生全反射时,若入射光的波向量与金属膜内
表面电子的振荡频率相一致, 光线即被耦合入金属
膜引发电子共振, 即表面等离子共振。由于共振的
产生,导致反射光的强度在某一特定的角度大大减
弱,反射光消失的角度称为共振角 ( SPR ang le) , 共
振角随金属表面折射率的变化而变化,而折射率的
变化又与金属表面结合物的分子质量成正比。由
此,在 20世纪 90年代发展了应用 SPR原理检测生
物传感芯片 ( b iosensor ch ip) 上的配位体与分析物
作用的一种新技术 表面等离子共振。在该技术
中,待测生物分子被固化在生物传感芯片上,使另一
种被测分子的溶液流过表面, 如二者发生相互作用,
就会引起芯片表面折射率的变化,从而导致共振角
的改变,通过检测该共振角的变化,就可实时监测分
子间的相互作用。 1992年, Fagerstam等 [ 15]首次将
此技术用于生物特异相互作用分析 ( b iospecific in
teraction analysis, B IA )之后, 由于该技术快速、安
全、无需标记以及高灵敏度等特点,已被广泛用于分
析生物分子如蛋白质间、蛋白质与核酸、核酸之间的
相互作用,涉及免疫识别、信号传导、药物筛选和蛋
白质构象变化等多个研究领域。
6 蛋白质相互作用研究方法展望
机体细胞内蛋白质之间相互交叉作用形成网
络,构成各项生理活动的基础。因此了解、阐明蛋白
质之间相互作用的机制意义重大。从近期国际上蛋
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
白质研究的发展动向可以看出, 揭示蛋白质之间的
相互作用关系,建立相互作用的网络图,已成为蛋白
质研究领域中的热点, 覆盖了从微生物到动植物的
各个领域。出于研究的需要,各种新的研究技术不
断涌现,尤其随着生物信息学的出现,多种方法技术
并存, 相互间交叉互补,已愈来愈成为研究蛋白质相
互作用研究方法的主要特点,对于准确理解蛋白质
功能、揭开各种细胞活动的奥秘具有重大的意义,势
必会引导蛋白质组学的发展进入一个全盛时期。
参 考 文 献
1 Sm ith G P. S cience, 1985, 228 ( 4705 ) : 1315~ 1317.
2 Scott JK, et a.l Science, 1990, 249( 4967) : 386~ 390.
3 H oessR H. Curr Pharm B iotechno,l 2002, 3 ( 1) : 23~ 28.
4 Jespers L, et a.l N at B iotechno,l 2004, 22( 9 ) : 1161~ 1165.
5 F ield s S, et a.l N ature, 1989, 340( 6320 ) : 245~ 246.
6 S erebriisk ii I G, et a.l M ol C ell P roteom ics, 2005, 4 ( 6 ) : 819~
826.
7 Rossum D B, et a.l Nature, 2005, 434( 7029 ): 99~ 104.
8 贺福初, 等. 蛋白质 蛋白质相互作用. 中国农业出版社, 傅玉
祥, 2004, 250~ 251.
9 Rigau tG, et a.l Nat B iotechno,l 1999, 17 ( 10) : 1030~ 1032.
10 D ziembow sk iA, et a.l EMBO J, 2004, 23( 24) : 4847~ 4856.
11 Cabantous A, et a.l N ature b iotechnology, 2005, 23: 102~ 107.
12 Prasher D C, et a.l G ene, 1992, 111 ( 2) : 229~ 233.
13 H eim R, et a.l N atl A cad S ci USA, 1994, 91 ( 26 ) : 12501~
12504.
14 Reiko O, et a.l Proc NatlAcad SciUSA, 2002, 99( 23 ) : 14716~
14721.
15 Fagerstam L G, et a.l J Chrom atogr, 1992, 597 ( 12 ) : 397~ 410.
(上接第 160页 )
成,使科技优势迅速转化为经济优势。
总之,从现在到 2010年, 正是生物制药技术产
业蓬勃发展时期。青岛市虽然面临着严峻的挑战,
但也确实存在着极好的发展机遇。因此, 必须牢牢
把握机遇,进一步解放思想, 加大改革力度, 提高对
内、对外开放水平,高瞻远瞩,统筹规划,采取行之有
效的政策措施,充分利用青岛的市场、人才和科技资
源,集中力量, 将有限的人力、财力投入到有发展前
途的项目中去,加快制药领域生物技术成果的商品
化和产业化的速度,推动青岛市现代生物制药产业
的发展,使其成为 21世纪青岛市高新技术产业的支
柱之一和新的经济增长点。
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