全 文 ：收稿日期:2006-08-15
基金项目:国家“863”高科技发展计划(2003AA207140),安徽省自然科研基金(050410104),安徽省农科院院长青年基金项目(061201)
作者简介:阮龙(1972-),男,安徽五河人,助理研究员,安徽农业大学博士研究生,主要从事作物遗传育种与生物技术研究
Tel:0551-5591382;E-mail:longruan72@126.com
通讯作者:王钰,Tel:0551-5591327;E-mail:yuwang800@hotmail.com
甘薯、胡萝卜发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂线虫的研究
阮龙 1,2 姜疆 1 吴飞 3 刘晓锋 4 马代夫 5 吴跃进 1 查向东 1 王钰 3
(1中国科学院离子束生物工程学重点实验室,合肥 230031;2安徽农业大学,合肥 230036;3安徽大学生命科学院,合肥 230039;4安
徽科技学院生命科学院,凤阳 233100;5江苏徐州甘薯研究中心,徐州 221121)
摘 要: 利用发根农杆菌A4转化甘薯品种徐薯18和胡萝卜品种天红2号的发根,建立甘薯茎线虫病病原线虫(马
铃薯腐烂线虫)的单寄主培养体系。通过该体系对马铃薯腐烂线虫的行为进行观察以及繁殖情况进行调查。结果表明:(1)马
铃薯腐烂线虫在甘薯和胡萝卜发根上都能正常发育和繁殖,完成其生活周期;(2)培养4周和8周后,在甘薯发根上线虫繁
殖倍数分别为2.6和50.6倍;在胡萝卜发根上线虫繁殖倍数分别为1.7和9.9倍;相同培养时间内,线虫在甘薯发根上的繁
殖数极显著高于在胡萝卜发根上的繁殖数。(3)利用发根系统繁殖马铃薯腐烂线虫,便于研究其行为,在显微镜下可以直接
观察到线虫在发根上活动情况,这对研究发根和线虫相互关系十分有利。基于上述结果,初步证实构建甘薯发根单寄主培养
体系繁殖马铃薯腐烂线虫是可行的,且优于胡萝卜发根繁殖马铃薯腐烂线虫体系。
关键词: 马铃薯腐烂线虫 甘薯发根 胡萝卜发根 单寄主培养
StudyofReproductionofDitylenchusDestructorUnder
MonoxenicConditionofSweetPotatoandCarrotHairyRoots
RuanLong1,2 JiangJiang1 WuFei3 LiuXiaofeng4 MaDaifu5 WuYuejin1 ChaXiangdong1 WangYu3
(1KeyLaboratoryofIonBeamBioengineering,ChineseAcademyofScience,Hefei230031;2AnhuiAgriculturalUniversity,
Hefei230036;3SchoolofLifeScience,AnhuiUniversity,Hefei230039;4SchoolofLifeScience,AnhuiAcademyofScience
&Technology,Fengyang233100;5XuzhouSweetpotatoresearchCentre,Xuzhou221121)
Abstract: The system ofDitylenchus destructor reproduced monoxenicaly on Agrobacterium rhizogenes
transformedrootculturesbetweensweetpotatoandcarotwereestablished.TheD.destructor’sbehaviorwereobserved
invitro,andreproductionwereinvestigated.Theresultsshowed:D.destructorcandevelopandreproduceinnormalon
hairyrootsbetweensweetpotatoandcarot,andthenematodewasabletocompleteitslifecycle;theproductionrateof
D.destructorwas2.64and50.6after4and8weeksonsweetpotatohairyroots,theproductionrateofD.destructor
was1.7and9.9after4and8weeksoncarothairyroots,theproductiononsweetpotatohairyrootswasclearlymore
thanoncarothairyrootsinthesametime;usingthesystem,thenematode’sbehaviorcouldbeclearobservedthrough
themicroscope,itwasveryusefultostudytheplant-parasiteinteraction.Basedontheresults,Thesystemofreproduction
ofD.destructoronsweetpotatohairyrootsisfeasible,anditwasbeterthanreproductionofD.destructoroncarot
hairyroots.
Keywords: Ditylenchusdestructor SweetpotatohairyrootsCarothairyrootsMonoxenicculture
甘薯(Iponoeabatatas(Lam))是一种重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源用块根作物,广泛种植于世界
上100多个国家,在世界粮食生产中总产列第七位。我国是世界上最大的甘薯生产国,常年种植面积稳定在600
万hm2,约占世界种植面积的65.4%;年生产量约1.2亿吨,占世界甘薯总产量的85.9%。近年来,世界各国从可
持续发展和环境保护的角度出发,竞相开发能够使用酒精-汽油混合燃料的汽车。甘薯生物学产量高,并且是生
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第6期·研究报告·
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第6期
产酒精的主要原料,作为新型能源植物已经引起多国家的高度重视。甘薯作为新型能源用植物,其市场潜力巨
大,它将在我国能源安全中扮演重要角色[1]。
近年来由于甘薯生产上引种不当,造成甘薯茎线虫病的大面积蔓延,危害越来越严重,已经危及了甘薯的
生产。该病害是由线虫危害引起的,病原经南京农业大学丁再福等[2]鉴定是马铃薯腐烂线虫(Ditylenchusde-
structor),这是植物寄生线虫中惟一引起植物干腐症状的病原物,一般发病田块减产20%～50%,重病田块基本
上绝产无收 [3]。该线虫除了危害马铃薯、甘薯,还危害胡萝卜、花生、薄荷等[4]。
为了很好地控制线虫病的发生和危害,必须了解植物寄生线虫的生活习性、生理生化特性、遗传特性和防
治机理。培养得到大量的一致的线虫群体作为研究对象就显得十分重要。植物寄生线虫、植物宿主和环境之间
的关系是极其复杂的,并且难以评估在土壤中所发生的变化。无菌培养条件下研究它们之间的关系不失为一种
良好的方法。过去植物寄生线虫的无菌培养多采用在愈伤组织或离体根上进行单外源培养[5～7],愈伤组织和离体
根透明性差,不便于线虫行为的观察,不能继代培养,影响实验的连续性。用发根农杆菌侵染植物而获得的发根
生长速度快,透明或半透明,具激素自主性,分化水平高,遗传特性稳定,合成能力较强,因此,发根被用于研究
植物与寄生物之间的相互关系以及维持线虫的常规培养[8～10]。笔者曾成功地构建过胡萝卜发根培养马铃薯腐烂
线虫体系[11],但不同寄主植物与病原线虫之间的关系差异很大。为了进一步研究甘薯与病原线虫(马铃薯腐烂
线虫)之间的相互关系,为研究马铃薯腐烂线虫的生活习性、生理生化、遗传特性和防治机理构建一个平台。
1 材料与方法
1.1 发根农杆菌
发根农杆菌A4购于北京中科院微生物所。
1.2 植物材料
选取感甘薯茎线虫病的植物材料诱导发根,胡萝卜用天红2号的直根,甘薯用徐薯18的试管苗。
1.3 发根的诱导
取天红2号胡萝卜的直根洗净,削去外表皮,用 0.05%的次氯酸钠表面消毒20min,无菌蒸馏水冲洗5次,
然后用手术刀切成0.5~1cm厚,接种于1%水琼脂培养基,将活化的菌液滴一滴于胡萝卜切片中心处,25℃暗培
养。
取徐薯18试管苗(培养3周的植株)的叶柄,叶片和茎段用手术刀划出伤口,浸入活化的菌液中20min,然
后用无菌滤纸吸干表面的菌液,接种于MS固体培养基上,25℃暗培养。
1.4 发根的选取与培养
2～3周后,发根从农杆菌侵染的部位长出,将其生长迅速,粗壮的发根剪下,胡萝卜发根转接在MSR固体培
养基上[12],甘薯发根转接在MS固体培养基上,将其倒置培养。经过数代连续根尖培养,除去发根表面可能带有
的土壤农杆菌,得到纯净无菌的发根。
1.5 DNA的提取和PCR检测
胡萝卜、甘薯和发根的基因组DNA提取采用CTAB法,质粒DNA的提取使用上海生工生产的质粒抽提试
剂盒。PCR检测采用 2对根据 RiT-DNA的 rol基因序列设计的引物:Rob1:5′CTATTCCTTCCACGATTTCA3′
Rob2:5′CCGGCTGACTAACAAACATA3′(长 度 256bp);Roc1:5′CTGAGCCCTCTATTGACCT3′Roc2:5′AAT-
GAGCGTAAACCCTTG3′长度230bp)。采用25μl的反应体积:模板50ng,bufer2.5μl,dNTP(25mM)1.0μl,Mgcl2
(10mM)2.0μl,Taq酶1.5U,用双蒸水补平。PCR反应条件:第一步,94℃预变性5min;第二步,94℃变性40s,55℃
退火50s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
1.6 病原物的分离
病薯采自于安徽省颖上县十八里铺甘薯茎线虫病高发田块,采用浅盘分离法得到线虫。在解剖镜下挑出成
虫,留下幼虫备用。
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M为 Marker rolB基因 PCR扩增 1～5:徐薯 18发根,天红
2号发根,阳性对照,徐薯 18阴性对照,天红 2号阴性对
照 rolC基因 PCR扩增 6～10:徐薯 18发根,天红 2号发
根,阳性对照,徐薯 18阴性对照,天红 2号阴性对照
图 2 转化发根的 rolB(1～5)、rolC(6～10)
基因 PCR检测
1.7 发根培养马铃薯腐烂线虫体系的构建
取长约5cm带有3~5个分支的胡萝卜和甘薯发根,接种到含有MSR培养基的9cm培养皿上,25℃倒置预
培养3d,以备接种线虫。
用1000ppm升汞和2000ppm链霉素的混合液对所分离出来的马铃薯腐烂线虫虫体表面消毒10min,无菌
水冲洗3次。然后用无菌水配成10条/10μl的线虫悬浮液。将消毒后的线虫悬浮液50μl接入到预培养好的发
根培养皿中,重复10皿,用parafilm膜封口,25℃黑暗正置培养过夜,然后倒置培养。
1.8 显微观察
用Olympus倒置显微镜分别于接种3d后,观察线虫行为;4周后,采用Byrd,D.W.T改良的方法[13]进行根组
织内部线虫的染色,观察线虫在发根上的繁殖情况。
1.9 线虫繁殖计数与统计分析
培养4周、8周后,分别挑取3皿无污染的胡萝卜和甘薯培养线虫的发根,连同培养基一起用贝曼漏斗法对
线虫进行分离[4],在解剖镜下计线虫成虫和幼虫的总数,采用SAS6.0统计分析软件进行数据处理。
2 结果和分析
2.1 发根农杆菌转化胡萝卜和甘薯发根产生及扩繁
接入活化发根农杆菌的胡萝卜切片在10d后陆续产生发根,甘薯叶片、叶柄和茎段在2周后陆续产生发
根。待诱导生成的发根生长到3～5cm时,将其剪切,连续进行根尖继代培养,以除去发根表面可能存在的农杆
菌,得到无菌的发根。然后将无菌的胡萝卜发根在MSR培养基上扩繁,甘薯发根在MS培养基上扩繁,每皿接一
条9cm长的发根,4周后发根长满培养皿(图1)。
2.2 转化发根的PCR检测
从发根农杆菌诱导的徐薯 18和天红 2号发
根系中分别调取一个生长最好的的发根系,用于
RiT-DNA的rol基因的检测(图2)。检测结果说明
这两个发根系为发根农杆菌 A4RiT-DNA转化的
发根。
2.3 马铃薯腐烂线虫侵染发根情况
接种到发根培养体系中的马铃薯腐烂线虫,3d后,通过
显微观察发现,线虫多聚集在发根及其周围处,比较活跃(图
3)。并沿根运动,可能是为了寻找适宜的侵入位点。4周后通过
对根组织内部线虫的染色,能够清楚的观察到线虫在发根内
的位置(图4和图5),同时在甘薯和胡萝卜的发根内都观察到
有马铃薯腐烂线虫的卵、幼虫及成虫存在,卵大小为 62.4×
31.9(μm),卵长略大于体宽,卵宽约为卵长的一半。说明马铃
薯腐烂线虫能够在这两种培养体系内正常的完成其生长周期并繁殖出后代。
2.4 发根繁殖马铃薯腐烂线虫情况
培养4周和8周后,在甘薯发根上线虫数由50条分别增加到132条和2532条,繁殖倍数分别为2.6和
图 1 左图为甘薯发根(培养 2周),
右图为胡萝卜发根(培养 4周)
阮龙等:甘薯、胡萝卜发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂线虫的研究 105
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图 5 甘薯发根内染色的线虫(左图未压片,右图压片)
50.6倍;在胡萝卜发根上线虫数由50条分别增加到85条和494条,繁殖倍数分别为1.7和9.9倍;方差分析表
明在相同培养时间,线虫在甘薯发根上的繁殖数明显高于在胡萝卜发根上的繁殖数,差异达到极显著水平(表
1)。说明用甘薯发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂线虫优于胡萝卜发根繁殖马铃薯腐烂线虫体系。
3 讨论
用发根农杆菌A4成功的诱导出甘薯徐薯18和胡萝卜天红2号的发根,转移RiT-DNA的甘薯和胡萝卜发
根能够自身合成生长所需要的植物生长激素,因而不需要加入外源激素。发根易于继代培养,而且长期培养不
会出现退化,本实验所使用的发根经过6个月以上的连续培养,生长依然迅速,未见异常。目前植物寄生线虫主
要通过植物愈伤组织和无菌苗离体根进行无菌培养。两者都需要在培养基上加入外源生长激素。愈伤组织连续
继代比较烦琐,且存在易于老化和突变的缺点,愈伤组织是脱分化细胞,不能真实反映植物内寄生线虫和植物
体的相互作用。离体根生长缓慢,根部不透明,不能连续培养。同离体根相比,因发根生长迅速,继代方便,避免
了为建无菌苗而必须的种子消毒和萌发问题;发根侧根丰富,根毛密集能够为线虫提供大量取食位点,利于线
虫大规模扩增培养。
马铃薯腐烂线虫可以成功的在发根农杆菌A4诱导的甘薯和胡萝卜发根上繁殖,发根接种线虫4周和8周
后,甘薯发根上线虫的繁殖速度分别为2.6和50.6倍,胡萝卜发根上线虫的繁殖速度分别为1.7和9.9倍,甘薯
发根繁殖线虫的速度极显著的快于胡萝卜发根。这可能是因为每一种寄生线虫都有其最适宜的寄主,也是造成
我国甘薯主产区甘薯茎线虫病非常严重的主要因素之一。试验中我们观察到线虫在甘薯发根中的分布多集中
在几个侧根处,这有利于线虫群体之间的协作,提高了雌虫和雄虫的交配几率;在胡萝卜发根中线虫分布较为
分散,这就降低了雌虫和雄虫的交配几率;这也可能是甘薯发根繁殖线虫的速度快于胡萝卜发根的又一因素。
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培养基的成分及其浓度对线虫的发育影响很大,试验中笔者发现将甘薯发根接种在MS固体培养基上培
养,然后接种上马铃薯腐烂线虫,线虫不能正常发育和繁殖,这和前人的研究报道相一致[8],可能是因为 MS培
养基中氨态氮含量太高的原因,因此能否通过田间施肥成分的改变,来控制马铃薯腐烂线虫种群数量,有待于
进一步研究。
本实验中,我们清楚的观察到线虫侵入到发根内部,这和Verdejo.所观察到Meloidogynejavanica能侵入到
胡萝卜发根中[8]的结果相一致,但是 Soledad却发现 Zygotylenchusguevarai不能侵染马铃薯发根[9],这可能是由
于植物内寄生线虫具有高度的寄主专一性,对不同的植物侵染力不同的缘故。究其原因有待进一步研究。
另外,通过此培养方法,能够得到大量无菌线虫,可以直接用于接种和研究应用,避免了由于消毒所造成的
线虫活力的下降。同时这种单寄主培养体系也可以用于线虫种质的保藏。并且此单寄主培养体系可为研究植物
线虫和其他根际微生物提供了新的途径,为研究植物寄生线虫的生化和遗传特性构建一个平台。它排除了其他
因素的干扰,更能反映线虫和菌根真菌[14]、线虫和细菌[15]、以及不同线虫之间的相互作用。通过此系统还能研究
不同的理化因子(比如温度、金属离子、杀线剂)对线虫的影响。
发根具有完整的正常根组织结构,符合植物内寄生线虫的生长环境,因此本体系更能反映出植物寄生线虫
和寄主相互作用的真实情况,可以用于鉴定植物对线虫的抗性[10],尝试其作为甘薯茎线虫病抗性鉴定的一种新
方法;研究植物线虫的一个关键是研究线虫与寄主细胞发生关系的直接部位,利用发根系统繁殖线虫的方法,
可为很多高技术实验如微芯片研究和制作cDNA文库等提供大量实验材料。
参考 文献
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阮龙等:甘薯、胡萝卜发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂线虫的研究 107