全 文 ：人生长素基因的合成及克隆
卢希彬1 卢步峰 2, 3* 郭礼和2, 3* 戴平1
( 1华东师范大学,上海 200062; 2中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞
生物学研究所,上海 200031; 3上海赛达生物技术研究中心,上海 201203)
摘 要: 根据人生长素基因的氨基酸序列 ,选择大肠杆菌所偏好的密码子, 人工设计并合成了 20 个寡核苷
酸片断。通过重叠区扩增法,利用 PCR成功地合成了人生长激素基因的全序列。经克隆测序, 证明已成功地实现
了人生长素基因的合成及克隆。
关键词: 人生长素基因 基因合成 聚合酶链反应
Gene Synthesis and Cloning of Human Growth Hormone
Lu Xibin
1 Lu Bufeng2, 3 * Guo Lihe2, 3* Dai Ping1
( 1East China N or mal Univ e sti ty , S hanghai 200062; 2 Inst itut e of Biochemistr y and Cel l B iolog y ,
S hanghai Inst itut e f or Biological Sc ienc es, Chinese A cad emy of S ci ences , Sh anghai 200031;
3 Shanghai Cel-star I nsti tu te of Biotechnology , S hanghai 201203)
Abstract: Acco rding to the amino acids and by select ing high-usage codons in E. coli, we designed and synthe-
sized 20 o ligonucleit ides DNA fr agments w ith the length about 55bp. By over lap ex tension PCR method, we suc-
cessf ully synthesized t he overall sequence of human grow th hormone. The clones o f inter est w ere identified by DNA
sequencing. The result showed that we have successfully accomplished the synthesis and cloning of human grow th
ho rmone.
Key words: Human grow th ho rmone gene Gene synthesis Polymerase chain reaction
人类的生长激素( Grow th hormone , GH )是由脑垂体前叶合成分泌的一种非糖化蛋白类激素,由 191
个氨基酸组成。人生长激素的主要生理功能是促进人体生长发育和维持组织器官的正常功能。如果缺乏就
会产生侏儒症及组织器官的萎缩和功能衰竭。除此之外,人生长激素还广泛地用于烧伤、骨折、创伤、出血性
溃疡、组织坏死、肌肉萎缩、骨质疏松以及过渡肥胖等疾病的辅助治疗。过去临床应用只能从人脑垂体提取,
来源十分困难, 价格昂贵。现在大多采用基因工程的方法生产[ 1]。由于 hGH 没有糖链,用细菌表达不会存
在由于无翻译后修饰造成影响,因此大部分研究者采用原核细胞系统表达。
在后基因组时代,重点是阐明基因功能及研究蛋白结构与功能之间的关系。通过人工合成 DNA 序列
无疑为基因改造提供了强有力的工具。而且,在许多情况下, 根据不同物种的密码子的偏爱性,在不改变蛋
白质氨基酸组成的前提下,人工合成基因的编码序列可以带来更高的蛋白表达量。基因合成的方法主要是
先合成寡核苷酸, 然后通过 PCR 的方法得到全基因。如重组 PCR[ 2]、T BIO 法[ 3] ( thermodynamically ba-l
anced inside-out )、重叠延伸 PCR[ 4] 及不对称 PCR[ 5]等。我们按高表达序列人工设计并合成了人生长素基
因 20个寡核苷酸片断,通过重叠区扩增法, 成功地合成了人生长素的全基因, 以期在原核系统中得到高
表达。
收稿日期: 2005-11-01
作者简介:卢希彬( 1980- ) ,男,硕士, Email : lufeng228@ 163. com
* 通讯作者: T el : 021-50805425- 234, Fax: 50803194, Email: yjzx@ cels tar. com . cn
生物技术通报
# 研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
1 材料与方法
1. 1 材料
大肠杆菌( E. col i ) XL-1-Blue 由本实验室保存,克隆载体 pGEM-T、T4DNA 连接酶购自 Promega公司。
寡核苷酸片断由上海申能博彩公司合成, 并经 PAGE 纯化。限制性内切酶为 T akara 公司产品。Pfu、
dNT P、10 @ buffer 购自上海申能博彩公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 基因设计 我们根据生长素基因的氨基酸序列,采用大肠杆菌偏爱的密码子, 借助计算机设计了人
生长素基因的碱基序列。结构基因全长 573bp,结构基因前加了 ompA 信号肽序列,并 5c端设计了 Nde I酶
切位点,在 3c端添加了两个终止密码子 T AGT GA,并设计了 BamH I酶切位点。这样序列全长为 651bp。
1. 2. 2 寡核苷酸片断的合成 将整个基因 651个碱基分为 20 个相互重叠的寡核苷酸片断,标记为 O1到
O20。设计时 O 1和 O 20两个片断相对较小,分别有 38bp和 41bp,作为全长片断的两端引物,其余寡核苷酸片
断有 55bp左右。由上海申能博彩公司合成,并经 PA GE 纯化。
1. 2. 3 PCR扩增 基因片断合成后, 稀释成10pmol/Ll。反应体系 20Ll , O1和 O 2或 O3和O 4各取1. 5Ll, 10
@ PCR buf fer 2. 5Ll, dNT P 2. 0Ll, pfu DNA 聚合酶 0. 2Ll, 加水补足 20Ll。第一次 PCR反应合成 O 1~ 2及
O3~ 4 ,纯化后各取 1Ll,按上述 20Ll反应体系(不加引物)反应 3 个循环, 然后加上引物 O 1和 O4 , 继续进行
PCR反应,条件均为: 94 e 1min, 60 e 30S, 72 e 45S。循环 30 次, 最后 72 e 延伸 10m in, 4 e 保存。实验过
程中必要时进行温度梯度。
1. 2. 4 扩增片断的克隆及序列分析 PCR得到扩增
片断后, 胶回收后连接于 pGEM-T 载体, 16 e 过夜。
然后转化感受态细胞 XL-1-Blue,经蓝白斑筛选, 挑白
色克隆,进行 PCR及酶切鉴定, 并进行测序。
2 结果与分析
2. 1 全基因拼接
2. 1. 1 采用重叠区扩增法两步合成,重叠碱基 20bp
左右,基本流程图(图 1)。
实验过程中, 我们利用重叠延伸的方法, 并利用
温度梯度,通过两种途径都得到了目的片断。流程图
(图 2)如下: 其中, O 1~ 4代表合成的前四段寡核苷酸,
其余同理。
2. 1. 2 中间片断的合成。如 O 1~ 4、O 1~ 8、O7~ 20、
O1~ 12的温度梯度电泳图(图 3~ 图 6)。
2. 1. 3 全基因合成 中间片断合成后,利用 O 1~ 12和
O7~ 20及 O1~ 8和 O 7~ 20四个寡核苷酸片断,通过重叠延
伸的方法都得到了目的片断, 温度梯度的电泳图
如图 7。
2. 3 基因克隆及序列分析
扩增产物胶回收后连接于 pGEM-T 载体, 涂布
于含 X-gal、IPTG 和氨苄青霉素的平板上, 培养过夜,
挑白色菌落。利用引物 O1和 O20进行 PCR 鉴定(图
8)及用 NdeI和 BamHI进行酶切鉴定(图 9) ,鉴定阳性者测序。
70 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
挑了 2号和 4号克隆测序,经测序 4号克隆结果序列与设计结果完全正确, 2号发生了两个碱基突变。
图 7 O1~ 12+ O7~ 20 vO1~ 20 O1~ 8+ O7~ 20 vO1~ 20 ( 651bp)
以上结果表明: 本研究已成功地合成了人
生长素基因,为开展以后原核表达研究奠定了基
础。
3 讨论
现已知,外源蛋白在大肠杆菌中的表达水平
与多种因素有关, 如启动子和终止子的强弱、SD
序列、密码子的偏爱性、基因二级结构、宿主菌的
遗传背景、培养条件等等。而基因的本身结构则
是一个十分重要的因素[ 6, 7] 。因此, 为了实现
hGH 基因在大肠杆菌中高效表达, 采用了基因全合成的途径,首先从基因水平上进行优化。
该试验中, 将人生长素基因中某些稀有密码子替换为大肠杆菌偏好的密码子, 并借助计算机软件分析,
利用重叠延伸的方法,即两步合成法[ 8, 9] , 成功的合成了人生长素基因。合成基因,特别是在合成较长片断
的基因,费用主要在两方面:一是寡核苷酸片断的合成,二是后面的测序。合成寡核苷酸片断时,考虑到长度
太短,则寡核苷酸数目会增加,增加工作量及成本;长度太长,又会使引物合成中出现错误的几率增加。依据
国外报道,我们选择了 55个左右的寡核苷酸长度,两端的两个引物 O1及 O 20相对要短,可以作为全长基因扩
增引物。PCR产物合成后,通过克隆测序,得到序列与设计结果完全一致的目的产物。
基因合成中,寡核苷酸片断之间重叠的碱基数也是一个比较重要的因素。重叠片断小,可以减少合成的
寡核苷酸的数目,但较低的退火温度同时也会降低 PCR的特异性,导致非特异性产物。在保证足够的退火
712005年第 6期 卢希彬等:人生长素基因的合成及克隆
图 8 PCR鉴定
1~ 8是挑选的 8个克隆
温度下,使各寡核苷酸片断之间重叠 20bp左右。实
验过程中,发现:重叠区域适度加大, PCR过程中越
容易得到目的条带, 且在某些片断的合成过程中, 温
度梯度也是有必要的。如在合成 O 1~ 12时, 用 O1~ 8
和 O9~ 12拼接时, 没有出现目的条带。于是换用用
O1~ 8和 O7~ 12进行拼接, 同时进行温度梯度, 很容易
的得到所需要的目的片断。由于 T aq DNA 聚合酶
忠实度比较低,有可能引入点突变。而在所有热稳
定 DNA 聚合酶中, Pfu 聚合酶在 PCR 过程中的出
错率是最低的 [ 10, 11] , 采用了高保真的聚合酶 Pfu。
图 9 4 号克隆的酶切鉴定
随机挑选了 2个克隆拿去测序,结果其中一个完全正确,另一个发生两个碱基突
变(以后可以研究基因的结构与功能) , 说明该方法的正确率是比较可靠的。
从理论上讲, 20个寡核苷酸片断可以放在一起通过一次 PCR得到基因全
长。但由于不同的实验设计及寡核苷酸片断之间配对的复杂性,很多情况下并
不是很容易实现。我们曾试过将 20个寡核苷酸片断放到一起,希望通过一次
PCR拉出基因全长,没有成功。利用该方法则比较顺利得到了基因全长。可以
说,该方法可以合成任意长度的基因片断,在保证引物质量的情况下,全基因合
成及克隆测序可以在两周内完成。由于寡核苷酸合成价格越来越低, 所需时间
周期也不长,该方法在基因合成的过程中还是具有比较高的使用价值。
参 考 文 献
1 陈蓓,朱威. 生物学杂志, 2004, 21( 1) : 9~ 11.
2 S temm er WP, C ram eri A, H a KD , et al. Gene, 164: 49~ 53.
3 Gao X, Yo P, Kei th A, et al . Nucleic Acids Res, 2003, 31( 22) : 143.
4 M ehta RK, S ingh J. Biotechn iqu es, 1999, 26: 1082~ 1086.
5 S andhu GS, Aleff RA, Kline BC. Biotechn iques , 1992, 12: 14~ 16.
6 赵志虎,张京生,曹诚,马清钧,等.生物技术通讯, 2002, 13( 1) : 26~ 29.
7 M ak rides SC. M icrob iol Rev, 1996, 60( 3) : 512.
8 L ei Y, Don g QH . Nu cleic Acids Res, 2004, 32( 7) : e59.
9 Xiong AS, Yao QH , Peng RH , et al. Nucleic Acids Res, 2004, 32( 12) : e98.
10 Cl ine J, Bram an JC, H ogrefe HH. Nucleic Acids Res , 1996, 24: 3546~ 3551.
11 Andre P, Kim A, Khrapko K, T hilly WG. Genome Res , 1997, 7: 843~ 852.
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