全 文 ：腈水解酶基因 bxn的结构与功能研究
张锐1 王清路1 倪万潮2 郭三堆* 1
( 1中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081; 2江苏省农业科学院遗传生理研究所,南京 210014)
摘 要: 前期研究发现腈水解酶基因 bxn-R D127 表达产物无功能, 测序证明该基因结构中存在 4 处突变。
本文对 4 处突变逐点进行结构与功能回复突变研究,发现其中 2处突变能使基因表达产物丧失功能, 1 处使基因表
达产物活性降低, 1 处对基因表达产物活性基本无影响。进一步将完全回复突变的 bxn 基因转化烟草,获得的转基
因烟草具有抗溴苯腈除草剂特性,结果证明结构中的 3处突变与活性中心功能有关。
关键词: 溴苯腈除草剂 腈水解酶基因 转基因烟草
Study on the Construction and Function Relation
of Nitrilase Gene bxn
Zhang Rui1 Wang Q ing lu1 Ni Wanchao2 Guo Sandui1*
( 1 I nsti tu te of B iote chnology , Chine se Aca demy of A g ri cul tur al S ci ences , Be ij ing 100081;
2 Inst i tut e of A gr obiolog ical Geneti cs and P hysiology , J iangsu A cad emy of A gr icu ltura l S cie nces , Nanj ing 210014)
Abstract: Prophase r esear ch of bxn-RD 127 gene indicated it s expressing product had no nitrilase act ivit y. Se-
quencing data showed ther e w ere 4 sit es of mutants in it. In this paper , we studied the four mutants site by site, two
of them made the nitr ilase unfunctionally , one made the nitr ilase activit y decreased, the o ther had no influence on
the activity . T hen, the completely recruited mutation bxn gene was expressed ulter ior ly in tr ansgenic tobacco plants
which could resistant to the br ombxnnil herbicide. Tho se r esults attested thr ee mutants o f t he construction have re-
lation to the enzyme activ ity domains.
Key words: Brombxnnil herbicide Nitr ilase gene T ransgenic tobacco
杂草和农作物竞争水分、养料及光照,影响农作物的产量和品质。利用化学方法来控制杂草已成为现代
农业不可缺少的一部分, 除草剂的年产量已居诸农药之首, 据估计美国每年用在除草剂上的费用大约是 50
亿美元。溴苯腈( 3, 5-二溴-4-羟基-1-氰基苯)以及它的钠盐、钾盐是一种在国外被广泛使用的非选择性芽后
茎叶处理触杀型除草剂。主要由叶片吸收,通过抑制光合系统 II 的电子链传递而使组织坏死,对于生长素
2, 4-D不能控制的杂草特别有效。特别是在欧洲国家和澳大利亚,溴苯腈已成为大吨位除草剂。腈水解酶
可以把溴苯腈转变为无除草剂活性的 3, 5-二溴-4-羟基苯甲酸 [ 1]。1987年, Dav id 等从土壤细菌臭鼻杆菌
( K lebsiel la Oz aenae )中分离出腈水解酶基因 bxn并在大肠杆菌中表达[ 2]。后来, 通过基因工程的方法,获
得了抗溴苯腈转基因棉花、烟草、向日葵、油菜、小麦等 [ 3~ 6]。2001年,我们通过合作协议从国外获得携带有
bxn基因表达盒的质粒 RD127,利用花粉管通道法大量转化棉花,但连续 2年未筛选到转基因抗溴苯腈棉花
植株,而同期注射的其它外源基因均筛选到转基因棉花植株, 因此,本实验首先对质粒 RD127进行测序,并
通过分析序列结果证实质粒 RD127上的 bxn基因结构中存在 4处突变,致使基因功能丧失。然后通过定点
回复突变,获得原功能基因及系列突变体,转化酵母,证明 4处突变与基因功能间存在不同的关系,进一步将
完全回复突变的 bxn基因转化烟草,获得的转基因烟草具有抗溴苯腈除草剂特性, 结果证明结构中的 4处突
收稿日期: 2004-11-08
* 通讯作者: T el : 86-10- 62136406: Fax: 86-10-62136406: E-mail: gsdu i@ mail . caas. n et . cn
生物技术通报
# 研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 2期
变有 3处与活性中心功能有关。
1 材料与方法
1. 1 酶与主要试剂
限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、EX T aq DNA 聚合酶等均购自日本 TaKaRa 公司。DNA M aker 为
MBI公司产品。其余试剂及烟草组培所用激素等均为国产分析纯。
1. 2 质粒、表达载体与菌株
质粒 RD127通过协议获得,本实验室保存;质粒 pPIC9K-vgbbxn为本组构建[ 7] (构建过程及图谱见文
献 7) ;质粒克隆载体 pU C19、中间克隆载体 pG8 4A 和 pBI121、大肠杆菌菌株 DH5A、农杆菌 LBA4404 为本
实验室保存;组培用烟草为 NC89。
1. 3 引物
由上海博亚公司合成。共 13条,具体序列如下:
FP1: 5c- GCCAGTGAATTCCCAAGCAAGCAG-3c; RP1:5c-CCACCTGCGTCGACATGAGAACGA-3c;
FP2: 5c- GAAAAAATTCGCTGCGCGGCTCAGGA-3c; RP2: 5c-TCCTGAGCCGCGCAGCGAATTTTTTC-3c;
FP3: 5c- GAACGGGCTGGCCGTACGCTCTA-3c; RP3: 5c-TAGAGCGTAC GGCCAGCCCGTTC-3c;
FP4: 5c- GCGCTTGCTGCCGAGGGTGAAC-3c; RP4: 5c- CTGTTCACCCTCGGCAGCAAGC-3c;
FP5: 5c- CCGACGAGGGGGATCGTGAGGT-3c; RP5: 5c-ACCTCACGATCCCCCTCGTCGG-3c;
FP6: 5c- GTTCTCAT GTCGACGCAGGTGGTT-3c; RP6: 5c- CCAAGCTTAGGAATGTCCGCAATAAC -3c
RP6a: 5c- CCAAGCTTAGGAATGTCCCCAATAAC -3c。其中 FP1和 RP1 为基因 650bp片段首尾引物, FP2
和 RP2是针对第一处突变点设计的回复突变引物(下划线部分为引入的正确序列, 下同) ; FP3和 RP3是针
对第二处突变点设计的回复突变引物; FP4和 RP4 是针对第三处突变点设计的回复突变引物; FP5和 RP5
是针对第四处突变点设计的回复突变引物; FP6和 RP6为基因 450bp片段首尾引物, RP6a为定点突变第4
处突变点设计的引物。
1. 4 bxn-RD 127基因完全回复突变及系列突变体构建
对质粒 RD127上的 bxn-RD 127基因(全长 1. 1kb)进行测序,获知该基因存在 4处突变(图 1, 1~ 3处突
变位于 650bp片段, 4处突变位于 450bp片段) ,致使所编码的蛋白质活性丧失。采用 PCR法对 bxn-RD 127
基因各变异位点进行定点回复突变,具体方法如下:以质粒 RD127为起始模板, FP1+ RP2和 FP2+ RP1两
对引物同时进行 PCR反应,扩增产物回收后等量混合作为第二次 PCR 反应模板, 引物为 FP1+ RP1,第二
次扩增产物克隆至 pUC19载体后进行测序, 正确的克隆子即为完成第一处回复突变的 650bp片段。同样,
使用 FP1、RP1、FP3和 RP3可完成第二处回复突变;使用FP1、RP1、FP4和 RP4可完成第三处回复突变;使
用 FP5、RP5、FP6和 RP6可完成第四处回复突变。
对完成第二处回复突变的 650bp片段进一步进行第三处回复突变,正确的突变产物与完成第四处回复
突变的 450bp片段连接,即获得第一处突变的突变体 bxn-1。采用相同的技术路线,可以获得第二、三处突
变的突变体 bxn-2 、bxn-3。对已经完成第四处位点回复突变的 450bp片段利用 FP6+ RP6a 引物扩增, 正确
的突变产物与完成三处回复突变的 650bp片段连接,即获得第四处突变的突变体 bxn-4。而已经完成第四
处位点回复突变的 450bp 片段与完成三处回复突变的 650bp片段连接, 即获得完全回复突变的 bxn基因。
PCR反应程序:先 94 e 变性3m in;然后 94 e 变性 45s, 56 e 退火 45s, 72 e 延伸 1m in,共 30个循环; 最后
72 e 延伸 7m in。回复突变重组克隆的测序由上海博亚公司完成。
1. 5 表达载体构建
4个 bxn基因突变体酵母表达载体的构建: SnaBI+ EcoRI双酶切酵母表达质粒 pPIC9K-vgbbxn,回收
38 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 2期
12. 2kb 的大片段并分别与 4个 bxn基因突变体连接,构建出酵母表达载体 pPIC9K-vgbbxn-1、pPIC9K-vgb-
bxn-2、pPIC9K-vgbbxn-3和 pPIC9K-vgbbxn-4。
完全回复突变基因植物表达载体构建:采用 NcoI和 Xhol双酶切将 pU Cbxn上 1. 1kb 的 bxn基因克隆
至本实验室保存的中间载体 pG8 4A, 获得重组克隆 pG4Abxn。然后, 利用 EcoRI 和 HindIII 双酶切将
pG4Abxn。质粒上的 bxn 基因表达盒替换 pBI121 质粒上的 gus 基因表达盒, 获得植物表达载体
pGBI4Abxn。
1. 6 转 bxn突变基因酵母获得
将 BglII线性化的重组质粒 DNA pPIC9K-vgbbxn-1~ 4及对照 pPIC9K、pPIC9K- vgbbxn 分别转化酵
母 GS115感受态细胞,选取在 MD上生长正常而在 MM 平板上生长缓慢(表型为 His+ Mut s)的转化子进行
培养和诱导表达 [ 7] (具体方法见文献 7)。
1. 7 转基因酵母表达产物活性检测及 SDS-PAGE分析
各类转基因酵母经甲醇诱导培养 48h 后, 12 000r/ min 离心 10m in, 取 2m l上清加入溴苯腈原液中至后
者终浓度为 0. 5% , 37 e 温育 30m in后测定 OD600吸光值。同时,取适当发酵上清液进行 SDS-PAGE 分析。
采用 BIO-RAD公司的蛋白质电泳系统,浓缩胶 5% ,分离胶 15%,考马斯亮蓝 R-250染色观察。
1. 8 农杆菌介导转化烟草
应用液氮冻融法将 pGBI4Abxn质粒转化农杆菌 LBA4404,再采用农杆菌介导法转化烟草,获得抗性植
株。
1. 9 转基因烟草检测
包括 PCR 检测、溴苯腈抗性检测及腈水解酶活性检测。PCR 检测: CT AB法提取转基因烟草叶片总
DNA 作为模板,以定点回复突变引物 FP2、RP4为检测引物, PCR检测转基因烟草中 bxn基因的整合, PCR
反应程序: 94 e 变性 3min;然后 94 e 变性 45s, 56 e 退火 45s, 72 e 延伸 1min,共 30个循环;最后 72 e 延伸
7min;溴苯腈抗性检测:将 1 000ppm 溴苯腈水溶液浸泡的棉球贴于烟草叶片,接触面积为 1cm2 , 3天后观察
烟草叶片受害情况, 对抗性烟草植株使用 2 000ppm 溴苯腈水溶液浸泡的棉球进行第二次检测;腈水解酶活
性检测:将 1g 烟草叶片于液氮中研磨成粉末后装入含有 2mLT ris-Cl( pH6. 8)的缓冲液, 4 e 放置 4 hr, 离心
收集上清为蛋白粗提液, 将其加入溴苯腈原液中至后者终浓度为 0. 5% , 37 e 温育 30m in后测定 OD600吸光
值。
2 结果
2. 1 bxn-RD 127基因测序结果及分析
通过上海博亚公司测序, 获得了质粒 RD127中含有的 bx n-RD 127基因序列,将该序列与原序列比对,
发现有4处涉及 6个碱基的突变(括弧内为碱基位置) ,具体见图 1: ( 1) CT( 258, 259)→T C; ( 2) C( 316)→G;
( 3) CG( 525, 526)→GC; ( 4) GA ( 988, 989)→GGA。这 4 处突变导致其编码的氨基酸序列相应发生 4处改
变,如图 2所示,下划线部分为突变部分: 1、C( 87)→R; 2、R( 106)→G; 3、E( 176)→Q; 4、移码突变,造成 2个
氨基酸改变并提前 18个氨基酸终止,同时使 348位 C残基丢失。
2. 2 bxn-RD 127基因完全回复突变及系列突变体构建
为了确定 4处突变中,那一处是导致基因功能丧失的关键变异, 本组首先对 bxn-RD 127基因进行完全
回复突变,并与 v gb基因一起构建出双价酵母表达载体 pPIC9K-vgbbxn, 在转基因毕赤酵母中分泌表达出
了具有腈水解酶活性的 BXN蛋白(双价载体构建及酵母转化见文献 7)。然后,分别构建 4个只包含单一位
点变异的 bxn基因突变体。
以质粒 RD127为起始模板, FP1+ RP3和 FP3+ RP1两对引物同时进行 PCR反应, 扩增产物( 310bp和
340bp, 见图 3A)回收后等量混合作为第二次 PCR反应模板,引物为 FP1+ RP1,第二次扩增产物(见图 3B)
392005年第 2期 张锐等:腈水解酶基因 bxn的结构与功能研究
克隆至 pU C19载体后进行测序,正确的克隆子即为完成第 2处回复突变的 650bp片段。进一步以其为模板
进行第 3处回复突变,测序正确的克隆子即为只存在第 1处突变的 650bp片段。利用基因 650bp处原有的
图 1 bxn-RD127 与原基因序列比较
图 2 BXN-RD127 与原蛋白一级结构比较
SalI 位点将其与完成第 4处突变的 450bp片段连接,即获得第1处突变的基因突变体,命名为bxn-1,长度为
1. 1kb,其 pUC19克隆经 EcoRI+ H indIII双酶切鉴定结果如图 3C所示。采用类似的方法获得第 2、3处突
变的突变体,命名为 bxn-2、bxn-3。
图 3 基因定点回复突变过程
bxn-RD 127的第 4处变异引起一个包含 18个氨基酸残基的移码突变,其中包含 348位的 C 残基, 为了
确定这个 C残基是否为腈水解酶活性所必须,以位点 4回复突变正确(即移码突变消除)的 450bp产物为模
板,利用引物FP6+ RP6a扩增获得只包含表达产物 C( 348位)→W突变的 450bp片段,测序正确后与完成3
处回复突变的 650bp片段连接,获得了第 4处突变的突变体,命名为 bxn-4。
40 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 2期
2. 3 系列 bxn突变体酵母表达载体构建
SnaBI+ EcoRI双酶切质粒 pPIC9K-vgbbxn, 回收 12. 2kb 的大片段并分别与 4个 bxn 突变基因连接,
构建出酵母表达载体 pPIC9K-vgbbxn-1、pPIC9K-vgbbxn-2、pPIC9K- vgbbxn-3 和 pPI C9K-vgbbxn-4。
pPIC9K-vgbbxn-1的酶切鉴定结果如图 4所示, 泳道 1为 BamHⅠ+ E coRⅠ双酶切结果, 出现了与预期相
符的 1. 45kb、1. 8kb和 10. 5kb三条带,泳道 2为 BamHⅠ单酶切结果,也出现了与预期大小相符的 1. 8kb
和 12. 0kb 左右的带,说明质粒构建正确。
2. 4 系列 bxn突变体转基因酵母表达产物 SDS-PAGE检测
bx n基因的表达产物为含 349个氨基酸残基的蛋白,分子量约为 37. 81kD。取酵母发酵液上清, 分析胞
外表达蛋白情况, 所得结果如图 5 所示: 转 pPIC9K-vgbbxn 菌株 (正对照, 泳道 1) 有明显的蛋白带, 转
pPIC9K空载体的菌株(负对照,泳道 2)无对应的蛋白条带,转 pPIC9K-vgbbxn1~ 4的菌株(依次为泳道 3~
6)表达产物大小与转 pPIC9K-vgbbxn菌株表达产物大小一致,除转 pPIC9K-vgbbxn-4的菌株表达量稍高
一点外,其余 3种突变体转基因酵母相互间表达量基本相同。
2. 5 转基因酵母表达产物活性检测
溴苯腈溶液为乳浊液, 腈水解酶可以将其苯环上的-CN 还原成-COOH, 同时使溴苯腈溶液由乳浊液缓
慢地变透明。使用分光光度计测定溴苯腈溶液的透光率,可以间接地判断溴苯腈溶液中腈水解酶的活性。
将溴苯腈原液分别加入各类转基因酵母发酵液上清中至终浓度为 0. 5%, 37 e 温育 30m in后测定其 OD600
值,各类型转基因酵母具体结果见表 1。
表 1 经各类型转基因酵母发酵液上清作用后溴苯腈溶液 OD600值
突变体名称 正对照 负对照 bxn-1 bxn- 2 bx n-3 bxn-4
OD 600值 1. 7382 3. 5768 3. 6149 2. 4536 1. 8635 3. 5347
* 正对照:转 pPIC9K-vgbbx n菌株;负对照:转空载体 pPIC9K 菌株
结果表明: 正对照的发酵液上清可使溴苯腈溶液变清亮, OD600值变小, 而负对照则不能, OD600值较大。
4个转 bxn基因突变体的菌株中, bxn-3突变体的透光率与正对照相近, bxn-2 介于正负对照之间, bxn-1、4
与负对照相近。
2. 6 植物表达载体鉴定
NcoI+ Xhol双酶切将 pU Cbx n上 1. 1kb 的完全回复突变的 bxn 基因克隆至 pG8 4A, 获得重组克隆
412005年第 2期 张锐等:腈水解酶基因 bxn的结构与功能研究
pG4Abxn,其酶切鉴定结果如图 6A 中 1, 3泳道所示, 1. 1kb 的小片段即为克隆至载体的完全回复突变 bxn
基因。pG4A bxn质粒包含有 bxn 基因植物表达盒:基因的 5c端包括 2E 35S启动子和 8 序列、Kozak序列,
3c端包括剪切加工序列、polyA 序列和 Nos终止子。然后, EcoRI和 HindIII双酶切将 pG4Abxn质粒上2. 6
kb 的 bx n基因表达盒替换 pBI121质粒上的 gus基因表达盒,获得植物表达载体 pGBI4Abxn, EcoRI+ H in-
dIII 双酶切鉴定结果如图 6B所示,泳道 2出现了与预期大小相符的 2. 6kb片段,说明载体构建正确。
图 6 植物表达载体酶切鉴定电泳图谱
2. 7 转基因烟草 PCR检测
采用农杆菌介导法转化烟草 NC89,
共获得抗性组培苗 38 株。利用引物
FP2+ RP4进行 PCR 检测,最终获得转
pGBI4A bxn的阳性株 31株。部分植株
的 PCR检测结果如图 7所示, 目的片段
为 730bp 左右, 表明 bxn基因已整合进
烟草基因组中。
2. 8 转基因烟草抗性检测
溴苯腈除草剂的田间喷施浓度为
450~ 1 000ppm, 本文使用 1 000ppm 溴
苯腈水溶液浸泡的棉球贴于烟草叶片, 3
天后观察, 发现对照烟草叶片已开始萎
缩并逐渐枯黄, 且枯黄现象沿着叶脉向叶柄扩散(图 8A) ,而 31株转基因烟草叶片均表现正常(图 8C) ; 加大
溴苯腈浓度至 2 000ppm 后, 31株转基因烟草中有 5 株转基因烟草叶片出现萎缩(图 8D) , 但是枯黄现象没
有沿叶脉扩散, 受害症状较轻,其余 26株转基因烟草植株表现正常。
2. 9 转基因烟草腈水解酶活性检测
将溴苯腈原液加入烟草叶片蛋白粗提液中至终浓度为 0. 5%, 37 e 温育 30min后发现,经转基因烟草叶
片蛋白粗提液处理的溴苯腈溶液, OD600的平均值为 2. 1628, 加入未转基因烟草的为 3. 8768。结果表明:转
基因烟草叶片蛋白粗提液可使溴苯腈溶液透光率增加, OD600值变小。
3 分析与讨论
为了确定 bxn-RD127的 4处突变中,那些是导致基因功能丧失的关键变异,本文分别构建了 4 个只包
含单一突变位点的基因突变体 bxn1~ 4,转化酵母的结果表明:转完全回复突变 bxn的菌株(正对照)发酵液
上清作用溴苯腈溶液后可使其变清亮, 透光率增加, OD600值变小,说明转该基因的酵母菌株可分泌活性腈水
42 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 2期
解酶,作用溴苯腈而使其溶液变清亮。转空载体的菌株(负对照)因不能分泌腈水解酶,作用后的溴苯腈溶液
依旧混浊, OD600值较大。4个转 bxn基因突变体的菌株中, bxn-3 突变体的透光率与正对照相近, 说明该位
点的突变不影响 bx n基因表达产物的功能,推断该位点不在活性中心; bxn-2 突变体的透光率介于正负对照
之间,说明 bxn-2基因的表达产物仍有功能,但活性与正对照相比明显降低, 推断该位点的变异导致蛋白质
一级结构中 R残基转变为 G残基后, 引起了酶活性结构域出现一定变化, R残基应位于腈水解酶的活性中
心,并直接参与了酶促反应过程; bxn-1、4 的透光率与负对照相近, 说明这两个位点的突变均会导致 bxn基
因表达产物的功能丧失。此两个位点的变异均涉及蛋白质一级结构中 C 残基的改变, C 残基是形成二硫键
维持蛋白高级结构的关键因素, C 残基改变导致二硫键不能正常形成, 蛋白的高级结构无法维持。分析
BXN 蛋白的 C 残基含量,在整个蛋白序列中共包括 4个 C残基,分别位于 87、161、324、348位。本文的 1、4
处突变导致 87位和 348位 C残基的改变,推断 87位和 348位 C残基直接参与了维持蛋白高级结构的二硫
键形成,其改变直接引起蛋白高级结构变化, 致使酶活性结构域无法形成, 腈水解酶活性丧失。
将完全回复突变的 bxn基因转化烟草后, 获得的 31株转基因烟草植株均具有抗溴苯腈除草剂的特性,
均能在溴苯腈正常施用浓度下生长,同时,转基因烟草叶片蛋白粗提液可使溴苯腈溶液变清亮,证明经过完
全回复突变的 bxn基因可在转基因烟草植株中表达出活性腈水解酶, 解除除草剂溴苯腈的毒性; 另外,加大
溴苯腈施用浓度后有 5株转基因烟草植株出现受害症状, 其余 26株表现正常, 说明不同的转基因植株间存
在 bxn基因表达水平的差异。
通过对 bxn-RD127基因中存在的 4处突变逐点进行结构与功能回复突变研究,结果发现其中 2处突变
能使基因表达产物丧失功能, 1处使基因表达产物活性降低, 1处对基因表达产物活性基本无影响。进一步
将完全回复突变的 bxn基因转化模式植物烟草, 获得的转基因烟草具有抗溴苯腈除草剂特性,结果表明4处
突变中有 3处突变与活性中心功能相关。此研究结果目前国内外未见同类报道。
参 考 文 献
1 Kevin EM, James WK, David MS . Am er Soci M icr o, 1986, 8: 325~ 330.
2 David MS, Kevin EM. Journal of Bacteriology, 1987, 169( 3) : 955~ 960.
3 David M , Stalker, Kevin E, Malyj, L or raine D, McBride. Science, 1988, 242: 419~ 423.
4 钟蓉,朱峰.植物学报, 1997, 39( 1) : 22~ 27.
5 王小军,刘玉乐, H uang Yong.植物学报, 1996, 38( 12) : 942~ 948.
6 苏少泉.世界农业, 1998, 8: 21~ 23.
7 王清路,张锐,陈毓荃,倪万潮,郭三堆. 生物工程学报, 2004, 20( 5) : 730~ 735.
#国外动态 #
乌干达筹建生物技术实验室
AgBio tech Repo rter 2003年 20卷 8期 7页报道:《全非新闻》宣称。乌干达农业畜产业和渔业部正在卡
旺达研究站内筹建一个生物技术实验室。预期对这个实验室的投资金额, 将超过 100万美元。这个实验室
于 2003年 8月底建成并投入使用。筹建这个实验室的目的在于提高乌干达的农业产量,从而促进国民经济
的发展。
乌干达农业部部长 Kisamba Nugerw a说: /鉴于乌干达农村可耕地的短缺,我们必须采用集约式农业技
术。0又说: /绿色革命已匆匆离开非洲而不复返。但非洲决不能在科学技术上落后于其他国家。我们亟需利
用生物技术来谋求生存和发展。0 汪开治
432005年第 2期 张锐等:腈水解酶基因 bxn的结构与功能研究