全 文 ：土壤中蓖麻碱降解菌的分离及脱毒效果的初步研究
张盈1 王昌禄1* 张爱琳1 陈勉华1 张民1 王文杰2
( 1天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津市食品营养与安全重点实验室,天津 300450;
2 天津市畜牧兽医研究所,天津 300112)
摘 要: 以蓖麻碱为底物, 从蓖麻种植地土壤中筛选出脱毒能力强、生长旺盛的菌株 66t, 经初步鉴定为假
单胞菌,其最适生长温度为 30 , 最适 pH 为 7. 0。经脱毒实验, 66t菌降解蓖麻碱的脱除率达到 71. 63% ,且该菌
并不降解蓖麻饼粕中的蛋白质。
关键词: 蓖麻饼粕 蓖麻碱 生物降解 饲料
Primary Study on Isolation of Ricinine Degrading
Microbes from Soil
Zhang Ying
1 Wang Chang lu1* Zhang Ailin1 Chen M ianhua1 Zhang M in1 Wang Wenjie2
( 1 S chool of Food Eng ine ering and B iot echnolog y , T ianj in Univ er si t y of S ci ence and T echnology ,
Tianj in key laborator y of Food N ut ri ti on and Saf ety , T ianj in 300450;
2 T ianj in I nsti tute of A nimal H usbandr y and Ve ter inar y Sc ienc e , T ianj in 300112)
Abstract: The bacter ium o f 66t w as iso lated fr om so il of castoroil plant by enrichment culture w ith r icinine
as subtrate This bacterium w as observ ed by modality , and determ ined its character istic of physiolo gy and bio chemis
tr y. The results show ed that the bacterium of 66t was Pseudomonas sp. Its suitable gr ow ing temperature was 30
and pH w as 7. 0. T he r ate of det ox ification to ricinine w as 71. 63% . And this bacter ium did not use up protein o f
casto r bean meal.
Key words: Casto r bean meal Ricinine Biog radation Forage
蓖麻饼粕的主要成分有蛋白质、纤维、脂肪、钙和磷等一些矿物质, 其中蛋白质含量丰富, 占 33% ~
35% ,不含或含少量动物难以吸收的醇溶蛋白,主要含有绝大多数动物可消化吸收的蓖麻蛋白,同时,必须氨
基酸种类齐全[ 1] 。与其他饼粕中氨基酸含量相比, 差异较显著,只要多种饼粕混合使用作为动物饲料,可以
达到氨基酸互补的作用[ 2] 。但是,由于蓖麻饼粕中含有蓖麻碱和变应原等有毒物质[ 3] ,目前添加到饲料中的
用量十分有限, 一直将蓖麻饼粕当作肥料,效益低。可见,开发蓖麻饼粕作为畜禽蛋白饲料,增加饲料行业的
蛋白质来源具有重要意义。
从蓖麻饼粕中脱除毒素的方法有生物法、化学法、物理法以及化学和物理联合法[ 4~ 8]。化学法和物理法
脱毒易使蓖麻饼粕中的营养物质受到破坏,降低了其营养价值, 同时也污染了环境, 而且耗能大,成本高。生
物脱毒经济安全,生产工艺简单,可以利用生物脱毒菌种与一些耐毒性的产单细胞蛋白菌种混合使用,达到
脱毒和平衡氨基酸, 解决蛋白质缺乏问题 [ 9~ 10]。本文从蓖麻种植地中分离筛选出能够降解蓖麻碱的菌株,
并对其脱毒效果进行了初步研究。
1 材料与方法
1. 1 材料
收稿日期: 20051031
作者简介:张盈( 1981 ) ,女,江苏泰兴人,硕士研究生, Email: jstxzy_lyg304@ 163. com, T el: 02260273027
* 通讯作者:王昌禄,男,教授,博士生导师, Email: changluw ang123 @ 163. com
生物技术通报
研究报告 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 1期
1. 1. 1 样品来源 土样:采自天津南大海泰植物蛋白生产基地蓖麻种植试验地。
蓖麻饼粕: 天津南大海泰植物蛋白生产基地提供。
1. 1. 2 培养基 富集培养基:葡萄糖 5g; ( NH 4 ) 2SO 4 2g ; MgSO 4 7H 2O 0. 2g; K 2H PO 44g; KH 2PO4 6g;
NaCl 5g; 蒸馏水 1 000m l; pH7. 0~ 7. 2; 121 灭菌 20min; 0. 2mg / ml蓖麻碱 20m l(过滤细菌)。
分离培养基:在 1L 富集培养基中加入 0. 04%溴百里酚蓝(变色范围 pH6. 0~ 7. 6) 40m l。
复筛培养基:葡萄糖 5g; ( NH 4 ) 2SO 4 2g; M gSO 4 7H 2O 0. 2g; K 2HPO4 4g ; KH 2 PO 4 6g; NaCl 5g ;蒸馏
水 1 000m l; pH7. 0~ 7. 2; 121 灭菌 20min; 0. 2mg/ ml蓖麻碱 20m l(过滤除菌)。
牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏 3g ;蛋白胨 10g; N aCl 5g ;琼脂 20g; 蒸馏水 1 000m l; pH7. 2~ 7. 4; 121
灭菌 20min。(液体培养基中不加琼脂)
蓖麻饼粕脱毒培养基:蓖麻饼粕:蒸馏水 1: 4( w / v ) ; 121 灭菌 20m in。
1. 2 方法
1. 2. 1 脱毒菌株筛选
1. 2. 1. 1 富集培养 将从蓖麻地不同方位采集的土壤样品每份称取 5g, 放至 45m l无菌水中(内装玻璃珠
若干) ,充分振荡 10min( 120r/ m in) ,从中吸取 1m l菌悬液于 50m l液体富集培养基中,置于 26~ 28 恒温箱
中培养 3d~ 5d, 待培养基混浊后进行初筛。
1. 2. 1. 2 初筛 从富集的菌悬液中吸取 1ml至 9ml无菌水中,充分振荡, 制成 10- 1菌悬液,用无菌水稀释
成 10- 2、10- 7 , 分别取 10- 5、10- 6、10- 7菌悬液涂布于初筛培养基平板上, 每个稀释度重复三次, 倒置于
28 恒温箱中培养 3d~ 5d,待菌落长出后,根据菌落周围颜色的变化, 挑取形态、色泽、大小不同的单菌落在
初筛平板上重新划线纯化,培养 [ 11]。挑取单菌落,编号,接入牛肉膏蛋白胨培养基中培养后, 4 冰箱中保
存。
1. 2. 1. 3 复筛 用接种环取一环斜面上初筛的细菌,接入牛肉膏蛋白胨培养基中活化 24h, 以 10%接种量
接入到复筛培养基中, 28 恒温培养箱中培养 3d~ 5d, 待培养基混浊后,检测其中蓖麻碱含量。
1. 2. 2 初步鉴定
1. 2. 2. 1 革兰氏染色[ 12]
1. 2. 2. 2 生理生化试验 [ 12]
1. 2. 3 最适生长温度、pH 确定[ 13]
1. 2. 4 脱毒效果
1. 2. 4. 1 微生物脱毒 将不同菌株接入牛肉膏蛋白胨培养基斜面上进行活化,挑取一环接入牛肉膏蛋白胨
液体培养基中, 30 恒温培养到稳定期,按 10% ( v/ w)接种量转接入蓖麻饼粕脱毒培养基中进行脱毒实验,
培养 3d,过滤蓖麻饼粕,经过多次水洗,烘干, 检测蓖麻碱含量。
1. 2. 4. 2 蓖麻碱对照品紫外扫描检测最大吸收波长 采用紫外分光光度法测定蓖麻碱含量。取少量蓖麻
碱对照品溶于氯仿中,以氯仿为空白对照,用紫外分析仪在 200~ 400nm 区间进行扫描, 确定蓖麻碱的最大
吸收波长。
1. 2. 4. 3 蓖麻碱对照品标准曲线的绘制
准确称取蓖麻碱柱状晶体 10mg, 用甲醇溶解, 定容在 100ml容量瓶中, 准确吸取上述溶液 0. 1ml、0. 2
ml、0. 4m l、0. 8ml、1. 2ml、1. 6m l、2m l,用甲醇定容在 10m l容量瓶中, 用紫外分光光度计测其吸光度。以蓖
麻碱浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
1. 2. 4. 4 蓖麻碱含量的测定 准确称取蓖麻饼粕 10g, 加入 100m l氯仿,在索氏抽提器中回流提取 12h,过
滤,滤液用旋转蒸发仪浓缩, 蒸干, 用无水乙醚 100ml分三次进行洗涤, 回收瓶中干燥物,置真空燥器中干
燥,用甲醇溶解,定容在 100ml容量瓶中。再从中取 1m l滤液定容在 10m l容量瓶中,用紫外分光光度计在
792006年第 1期 张盈等:土壤中蓖麻碱降菌的分离及脱毒效果的初步研究
最大吸收波长处测其吸光度, 根据标准曲线, 求出蓖麻碱含量[ 14~ 15]。
1. 2. 4. 5 粗蛋白含量的测定 采用凯氏定氮法[ 16] 测定样品中含氮量, 推算其蛋白质含量。
2 结果与讨论
2. 1 菌株的筛选
按照 1. 2. 1至 1. 2. 3的方法, 从蓖麻种植地土壤中分离筛选出 120株细菌,通过其对蓖麻碱降解能力及
耐受能力进行比较, 选出生长快、降解和耐受蓖麻碱能力强的一株细菌 66t。
2. 2 脱毒菌株的初步鉴定
2. 2. 1 个体形态观察 按照 1. 2. 2. 1的方法,观察 66t菌的个体形态,其结果如图 1所示。
图 1 66t菌的革兰氏染色
由图 1中可以看出, 66t菌为革兰氏阴性球菌。
2. 2. 2 分离菌株的部分生理生化实验 按照 1. 2. 2. 2的方法,测定 66t
菌的生理生化特性, 结果如表 1所示。
表 1 66t菌的生理生化特性
菌号 66t 菌号 66t
氧化酶 + 果聚糖形成
过氧化氢酶 非荧光色素
葡萄糖氧化发酵 氧化产酸 荧光色素
淀粉水解 类胡萝卜素
明胶水解 脓青素
+ 为阳性, –为阴性
根据 66t 菌株的个体形态、菌落形态以及部分生理生化实验, 参照
《伯杰氏细菌鉴定手册》[ 17] ,初步鉴定 66t 菌为假单胞菌。
2. 3 最适温度、pH 的确定
按照 1. 2. 3的方法, 测定 66t菌在不同温度和不同 pH 下的生长情
况,其结果如图 2和图 3所示。
图 2 不同温度下生长曲线 图 3 不同 pH下生长曲线
由图 2和图 3可知, 66t菌的最适生长温度为 30 ,最适生长 pH 为 7. 0。
2. 4 脱毒效果的研究
2. 4. 1 蓖麻碱对照品标准曲线 按照 1. 2. 4. 3方法, 测得的蓖麻碱标准曲线如图 4所示。
80 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期
由标准曲线求出的线性回归方程: Y= 0. 0471X- 0. 0024, R2= 0. 9996, 线性范围为 1. 197~ 20. 178g。
2. 4. 2 蓖麻碱及粗蛋白含量的测定 按照 1. 2. 4. 4和 1. 2. 4. 5方法, 测定在蓖麻饼粕中接入 66t 菌前后
蓖麻碱及粗蛋白含量,并计算蓖麻碱脱除率, 其结果如表 2所示。
表 2 66t菌脱除蓖麻碱的效果
样品 蓖麻碱( % ) 脱除率( % ) 粗蛋白( % )
脱毒前 0. 0853 0. 02177 35. 67
66t 菌处理组 0. 0242 0. 009929 71. 63 0. 80 35. 61
图 4 蓖麻碱标准曲线
由表 2中可以看出, 66t菌在 pH 为 7. 0的培养基中 30
培养 3d,蓖麻碱脱除率达到 70%以上且对蓖麻饼粕中蛋白质
的影响不大。
3 结论
以蓖麻碱为底物, 从蓖麻种植地土壤中筛选出一株生长
速度快、降解蓖麻碱能力强的菌株 66t ,经个体形态、菌落形态
及生理生化实验, 初步鉴定 66t 菌为假单胞菌。通过摇瓶脱
毒试验, 66t 菌对蓖麻碱脱除率达到 70%以上并不降解蓖麻
饼粕中的蛋白质。
参 考 文 献
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16 杨胜主编.饲料分析及饲料质量检测技术. 北京:农业出版社, 1993, 16~ 90.
17 R E布坎南, N E 吉本斯编,中国科学院生物研究所翻译组译. 伯杰细菌鉴定手册(第 8版) .北京:科学出版社, 1984, 274.
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