全 文 ：第 １３卷第 ３期
２０１５年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０３􀆰 ００３
收稿日期：２０１４－０５－０９
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１３ＣＢ７３３９０１）；国家自然科学基金（２１３０６０８７）；新世纪优秀人才支持计划（ＮＣＥＴ １２
０７３２）
作者简介：张汉文（１９８６—），男，江苏南京人，硕士研究生，研究方向：生物化工；姜　 岷（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｉｏｅｎｇｉｎｅ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
大肠杆菌 ＡＦＰ１１１利用玉米粉全水解液
厌氧发酵合成丁二酸
张汉文，刘嵘明，梁丽亚，姜　 岷，马江锋
（南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室， 江苏 南京 ２１０００９）
摘　 要：利用双酶法制得的玉米粉糖液及制糖过程中玉米糖渣酶解后含氮水解液作为发酵培养基，考察在不添加
其他营养物质条件下大肠杆菌（Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ）ＡＦＰ１１１ 专一厌氧发酵产丁二酸的可能性。 结果表明：Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１ 厌氧
发酵 ４８ ｈ后，丁二酸质量浓度达到 １５􀆰 ２４ ｇ ／ Ｌ，丁二酸的得率为 ０􀆰 ７６ ｇ ／ ｇ。 与在 ＬＢ培养基中发酵相比，产量提高了
１４􀆰 ４１％。 对关键酶酶活和辅因子 ＮＡＤ（Ｈ）含量的测定结果显示，能利用玉米粉全水解液的苹果酸脱氢酶（ＭＤＨ）、
磷酸烯醇式丙酮酸（ＰＥＰ）羧化酶（ＰＰＣ）、ＰＥＰ 羧化激酶（ＰＣＫ）酶活及辅因子 ＮＡＤ（Ｈ）含量分别为 ０􀆰 ８８ Ｕ、０􀆰 ２９ Ｕ、
０􀆰 ３１ Ｕ和 １５􀆰 ０９ μｍｏｌ ／ ｇ，均比 ＬＢ培养基中关键酶酶活和辅因子 ＮＡＤ（Ｈ）含量高。 由此推测，玉米粉全水解液中关
键生长因子（Ｄ 生物素、ＶＢ１和烟酸）的含量影响了关键酶酶活和辅因子 ＮＡＤ（Ｈ）的含量，从而影响丁二酸的产
量。 在 ５ Ｌ罐中厌氧发酵 １２０ ｈ，利用玉米粉全水解液，丁二酸的得率为 ０􀆰 ８４ ｇ ／ ｇ，比利用 ＬＢ培养基发酵得到的丁
二酸得率提高了 ２１􀆰 ７４％。
关键词：玉米粉糖液；玉米渣；大肠杆菌；丁二酸；厌氧发酵
中图分类号：ＴＱ９２１　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０３－００１４－０６
Ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ｂｙ
ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１
ＺＨＡＮＧ Ｈａｎｗｅｎ，ＬＩＵ Ｒｏｎｇｍｉｎｇ，ＬＩＡＮＧ Ｌｉｙａ，ＪＩＡＮＧ Ｍｉｎ，ＭＡ Ｊｉａｎｇｆｅｎｇ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｕｓｅ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ａｓ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎｓｔｅａｄ ｏｆ ｌｙｓｏｇｅｎｙ
ｂｒｏｔｈ （ＬＢ） ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｗｏ
ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ． Ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｅｎｚｙｍｅｓ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｃａｒｂｏｎ
ｓｏｕｒｃｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｎ ｒｅｓｉｄｕｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ． Ａｆｔｅｒ ４８ ｈ ｏｆ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎｙｏｔｈｅｒ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ
ｗａｓ １５􀆰 ２４ ｇ ／ Ｌ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ １４􀆰 ４１％ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｎ ＬＢ ｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ０􀆰 ７６
ｇ ／ ｇ． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＡＤ（Ｈ）ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＭＤＨ，ＰＰＣ，ＰＣＫ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＡＤ（Ｈ） ｗｅｒｅ ０􀆰 ８８ Ｕ，０􀆰 ２９ Ｕ，０􀆰 ３１ Ｕ ａｎｄ １５􀆰 ０９
μｍｏｌ ／ ｇ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｎ ＬＢ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｉｔ ｗａｓ ａｓｓｕｍｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ （ Ｄ⁃ｂｉｏｔｉｎ， ＶＢ１ ａｎｄ ｎｉｃｏｔｉｎ ａｃｉｄ ） ａｆｆｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅｓ， ｔｈｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＡＤ（Ｈ）ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ． Ａｆｔｅｒ １２０ ｈ ｏｆ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅ
ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ０􀆰 ８４ ｇ ／ ｇ，２１􀆰 ７４％ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｎ ＬＢ ｍｅｄｉｕｍ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ； ｃｏｒｎ ｒｅｓｉｄｕｅ； Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ；ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ； ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
　 　 丁二酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）又称琥珀酸，是一种重要
的 Ｃ４ 平台化合物，广泛应用于食品、医药、染料、香
料和塑料等行业，可作为合成 １，４ 丁二醇、四氢呋
喃、Ｎ 甲基吡咯烷酮及可降解生物高分子材料聚丁
二酸丁二醇酯（ＰＢＳ）等的原料［１］，被美国能源部认
为是未来 １２ 种最有价值的生物炼制品之一［２］。 大
肠杆菌具有代谢背景清楚、操作简便、调控容易、培
养基要求简单和生长速度快等优点，近年来被广泛
用于研究发酵生产丁二酸［３－５］。
丁二酸主要的产生途径为葡萄糖经过糖酵解
途径生成磷酸烯醇式丙酮酸，进而代谢合成草酰乙
酸、苹果酸和富马酸，最终以丁二酸的形式积累［６］。
Ｖｅｍｕｒｉ等［７－８］报道利用大肠杆菌两阶段发酵产丁二
酸的方法，首先有氧生长发酵，使菌体得到快速积
累，然后转为厌氧发酵，使菌体产生大量的丁二酸。
然而两阶段发酵过程中，需要消耗大量的营养成分
用于菌体的生长，导致丁二酸总得率下降；同时由
于菌体有氧生长对溶氧要求较高，搅拌及冷却等需
要较高的能耗及成本投入，因此，专一性厌氧发酵
产丁二酸受到越来越多的关注。 在专一性厌氧条
件下，重组大肠杆菌生产丁二酸需要酵母粉、蛋白
胨等复合氮源作为培养基成分，价格过于昂贵。 此
外，还伴随菌株生长缓慢、丁二酸终浓度和得率较
低等问题。 例如，重组 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１ 是
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１（ｐｆｌＡＢ、ｌｄｈＡ 双缺陷）的 ｐｔｓＧ 自发突变
的菌株，是一株两阶段发酵生产丁二酸的菌株［９］，
利用合成培养基专一性厌氧发酵时，Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１
菌体不生长，不产酸；在 ＬＢ 培养基中进行专一性厌
氧发酵，菌株恢复一定的生长能力，但是丁二酸得
率较低。
玉米粉是工业制作葡萄糖的重要原料［１０］，在过
滤工艺之后，产生了大量的滤渣———玉米糖渣，滤
渣中富集了大量的蛋白质。 因此，将玉米糖渣经蛋
白酶水解生产的玉米糖渣水解液作为唯一有机氮
源，玉米粉双酶法生产的玉米葡萄糖水解液作为唯
一碳源，将这 ２种水解液相结合，形成玉米粉全水解
液发酵培养基，代替含有蛋白胨和酵母粉的 ＬＢ 培
养基，考察该培养基对重组大肠杆菌厌氧发酵生产
丁二酸的影响。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌株
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１ ［ Ｆ ＋λ ｒｐｏＳ３９６ （ Ａｍ）
ｒｐｈ １ Δ（ｐｆｌＡＢ：：Ｃａｍ） ｌｄｈＡ：：Ｋａｎ ９５ ｐｔｓＧ］，由 Ｄａｖｉｄ
Ｐ􀆰 Ｃｌａｒｋ 教授（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）惠赠。
１􀆰 １􀆰 ２　 主要试剂
氯霉素、卡那霉素，上海生工生物工程有限公
司；高温 α 淀粉酶、糖化酶，苏柯汉生物工程有限
公司；中性蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司；酵
母粉、胰蛋白胨，Ｏｘｏｉｄ 公司；ＣＯ２气体，南京上元工
业气体厂；其他试剂为市售国产分析纯。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 葡萄糖水解液的制备
将玉米粉与纯水以固体质量分数 ３８％的比例
混合均匀，每克原料添加 ０􀆰 １７５ ｍｇ Ｃａ２＋，在 ｐＨ ６􀆰 ５、
９５ ℃条件下添加 ７ Ｕ ／ ｇ原料的液化酶，保温至液化
结束，液化终点为 １ 滴液化液加入到含有 ２ 滴碘液
的 １０ ｍＬ纯水中，充分振荡后显无色；将液化液灭完
酶活后，在 ｐＨ ４􀆰 ５、６０ ℃条件下添加 ２００ Ｕ ／ ｇ 原料
的糖化酶，并保温 ６０ ℃，４８ ｈ后，所得糖化液经过滤
得到的滤液为玉米葡萄糖水解液［１１］。
１􀆰 ２􀆰 ２　 玉米淀粉糖渣水解液的制备
糖化液过滤后的滤渣与纯水按固体质量分数
１０％的比例混合，在 ｐＨ ７􀆰 ０、５５ ℃条件下添加中性
蛋白酶，其添加量为滤渣质量的 ０􀆰 ３％，保温 ５５ ℃，
２４ ｈ后过滤所得滤液为含氮的玉米糖渣水解液。
１􀆰 ２􀆰 ３　 玉米淀粉糖渣水解液氮含量的测定
取 ５ ｍＬ 玉米淀粉糖液并称质量，连同 ０􀆰 １ ｇ
ＣｕＳＯ４、１􀆰 ５ ｇ Ｋ２ＳＯ４和 １０ ｍＬ 浓 Ｈ２ ＳＯ４一起加入消
解管中，４２０ ℃消解 １５０ ｍｉｎ。 然后利用全自动凯式
定氮仪，将消解好的玉米淀粉糖渣水解液进行总氮
含量的测定［１２］。
１􀆰 ２􀆰 ４　 玉米葡萄糖水解液和玉米糖渣水解液添加
量的标准
玉米葡萄糖水解液添加量的标准：因玉米葡萄
５１　 第 ３期 张汉文等：大肠杆菌 ＡＦＰ１１１利用玉米粉全水解液厌氧发酵合成丁二酸
糖水解液中含有高浓度的葡萄糖，所以，根据玉米
葡萄糖水解液中葡萄糖的浓度和发酵培养基中葡
萄糖的终浓度，计算出发酵培养基中所加玉米葡萄
糖水解液的体积。
玉米糖渣水解液添加量的标准：根据生产厂家
所提供的总氮含量和凯式定氮法的验证，得知 ＬＢ
培养基中总氮含量为 １􀆰 ８５ ｇ ／ Ｌ，为保证各发酵培养
基中总氮含量的一致性，将总氮含量 １􀆰 ８５ ｇ ／ Ｌ作为
发酵培养基的氮源终浓度；再根据凯式定氮法测出
玉米糖渣水解液中总氮含量和发酵培养基氮源终
含量 １􀆰 ８５ ｇ ／ Ｌ，从而计算出发酵培养基中玉米糖渣
水解液所添加的体积。
１􀆰 ２􀆰 ５　 生物素、烟酸和 ＶＢ１ 的检测
３０ ｍＬ ＬＢ 培养基：１０ ｇ ／ Ｌ 蛋白胨、５ ｇ ／ Ｌ 酵母
粉、５ ｇ ／ Ｌ ＮａＣｌ、２０ ｇ ／ Ｌ葡萄糖。
３０ ｍＬ全玉米粉水解液培养基：２０ ｇ ／ Ｌ 玉米葡
萄糖水解液（２０ ｇ ／ Ｌ 为发酵培养基中葡萄糖终浓
度）、含 １􀆰 ８５ ｇ ／ Ｌ总氮的玉米糖渣水解液。
２种培养基在 １２１ ℃、１５ ｍｉｎ 条件下湿热灭菌，
灭菌后的 ２种培养基送至江苏省理化检测中心检测
Ｄ 生物素、烟酸和 ＶＢ１的含量。
１􀆰 ２􀆰 ６　 酶活检测
样品处理：采取超声 ３ ｓ、停 ５ ｓ的策略共超声破
碎 ３ ｍｉｎ，于 ４ ℃、１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １５ ｍｉｎ，取上清
液即粗酶液，测定酶活。
苹果酸脱氢酶（ＭＤＨ）酶活标准反应体系参照
文献［１３］。
磷酸烯醇式丙酮酸（ＰＥＰ）羧化激酶（ＰＣＫ）酶
活标准反应体系参照文献［１４］。
ＰＥＰ 羧化酶（ＰＰＣ）酶活标准反应体系参照文
献［１５］。 采用联机紫外 可见分光光度计连续监测
４１２ ｎｍ处吸光值的变化，根据测定的标准曲线换算
成底物浓度。
ＭＤＨ酶活定义：２５ ℃、１ ｍｉｎ 内催化草酰乙酸
（ＯＡＡ）生成 １ μｍｏｌ苹果酸所需要的酶量，即 １ Ｕ。
ＰＣＫ酶活定义：２５ ℃、１ ｍｉｎ内催化 ＰＥＰ 生成 １
μｍｏｌ ＯＡＡ所需要的酶量，即 １ Ｕ。
ＰＰＣ酶活定义：２５ ℃、１ ｍｉｎ内催化 ＰＥＰ 生成 １
μｍｏｌ ＯＡＡ所需要的酶量，即 １ Ｕ。
１􀆰 ２􀆰 ７　 培养基及培养条件
种子培养基，即 ＬＢ培养基：酵母粉 ５ ｇ ／ Ｌ、蛋白
胨 １０ ｇ ／ Ｌ、ＮａＣｌ ５ ｇ ／ Ｌ；ｐＨ ７􀆰 ０，氯霉素和卡那霉素
的终质量浓度分别为 １００ μｇ ／ ｍＬ。
专一性厌氧发酵用培养基有以下 ２ 种。 ①３０
ｍＬ ＬＢ培养基：添加 １６ ｇ ／ Ｌ 碱式 ＭｇＣＯ３、２０ ｇ ／ Ｌ 葡
萄糖。 ②３０ ｍＬ 玉米粉全水解液培养基：２０ ｇ ／ Ｌ 玉
米葡萄糖水解液（２０ ｇ ／ Ｌ 为发酵培养基中葡萄糖终
质量浓度）、含 １􀆰 ８５ ｇ ／ Ｌ总氮的玉米糖渣水解液、添
加 １６ ｇ ／ Ｌ碱式 ＭｇＣＯ３，ｐＨ ７􀆰 ０，氯霉素和卡那霉素
的终质量浓度分别为 １００ μｇ ／ ｍＬ。
１􀆰 ２􀆰 ８　 培养方法
种子培养：将保存于－８０ ℃冻存管的菌种按 １％
接种量接种到 ５ ｍＬ ＬＢ 试管，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 培养
１１ ｈ，１％接种量接种到 ＬＢ 培养基中有氧培养，
３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养 ６ ｈ。
专一性厌氧发酵：转接 １０％的菌液到血清瓶
中，通入过滤除菌后的 ＣＯ２气体 ２ ｍｉｎ，保证血清瓶
中为厌氧环境，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ发酵 ４８ ｈ。
１􀆰 ２􀆰 ９　 发酵及代谢物分析
细胞生长是用紫外 可见分光光度计于波长
６００ ｎｍ 处测定吸光度值，细胞干质量（ ρ（ＤＣＷ），
ｇ ／ Ｌ）是由 ρ（ＤＣＷ）与 ＯＤ６００测定的标准曲线换算得
到，换算公式为 ρ（ＤＣＷ）＝ ０􀆰 ４×ＯＤ６００。 培养基中的
葡萄糖用 ＳＢＡ４０Ｃ 型生物传感仪（山东省科学院生
物研究所）检测，有机酸用高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）
检测，色谱柱为 Ｐｒｅｖａｉｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄ，流动相为 ２５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ ２􀆰 ５，流速 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，紫外检
测波长 ２１５ ｎｍ。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 专一性厌氧条件下重组大肠杆菌利用玉米粉
全水解液发酵
　 　 选用富含营养物的玉米粉全水解液作为培养
基，在专一性厌氧条件下，重组大肠杆菌 ＡＦＰ１１１ 发
酵生产丁二酸。 ３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 有氧培养菌体到
ＯＤ６００为 １０左右，菌液转接厌氧血清瓶，４８ ｈ 后测定
细胞干质量、残糖、乙酸及丁二酸的含量，结果如表
１所示。
由表 １可知：Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１厌氧发酵 ４８ ｈ后细
胞干质量达到 ２􀆰 ３４ ｇ ／ Ｌ，乙酸积累较少，丁二酸产量
和得率分别为 １５􀆰 ２４ ｇ ／ Ｌ 和 ０􀆰 ７６ ｇ ／ ｇ。 与在 ＬＢ 培
养基中厌氧发酵结果相比，丁二酸的产量和得率分
别提高了 １４􀆰 ４２％和 １３􀆰 ４３％。 由此可见，玉米粉全
水解液有作为发酵培养基厌氧合成丁二酸的潜质。
６１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
表 １　 玉米粉全水解液作为培养基厌氧发酵结果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ｍｅｄｉｕｍ
发酵培养基 ρ（ＤＣＷ） ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（耗糖） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（丁二酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（乙酸） ／
（ｇ·Ｌ－１） 得率 ／ （ｇ·ｇ
－１）
玉米粉全水解液 ２􀆰 ３４±０􀆰 ０４ ２０􀆰 ００±０􀆰 ０５ １５􀆰 ２４±０􀆰 ０１ １􀆰 １６±０􀆰 ０７ ０􀆰 ７６
ＬＢ培养基 ２􀆰 ３６±０􀆰 ０２ ２０􀆰 ００±０􀆰 ０５ １３􀆰 ３２±０􀆰 ０７ ２􀆰 １３±０􀆰 ０５ ０􀆰 ６７
２􀆰 ２　 玉米粉全水解液对丁二酸合成的影响初探
由上述实验结果可知，玉米粉全水解液厌氧合成
丁二酸的产量较高，玉米粉全水解液有作为丁二酸发
酵培养基的潜质。 经凯式定氮法测定，玉米粉全水解
液含有充足的总氮含量（表 ２），可以代替酵母粉和蛋
白胨，作为菌体生长和发酵的有机氮源。 娄秀平
等［１６］研究发现，ＶＢ１对菌体生长和代谢有促进作用，
Ｔｙｌｅｒ等［１７］等研究发现，Ｄ 生物素对菌体生长和产酸
有促进作用；烟酸是生物合成 ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋等辅酶的
前体物质［１８］。 将灭过菌的、相同体积的玉米粉全水
解液和 ＬＢ培养基送至江苏省理化检测中心，检测结
果如表 ２所示。 由表 ２可知：玉米粉全水解液中总氮
的质量分数为 ０􀆰 ３５％，Ｄ 生物素、ＶＢ１和烟酸的质量
浓度分别为 １１􀆰 ６ ｍｇ ／ Ｌ、１３９􀆰 ０ ｍｇ ／ Ｌ和 １２􀆰 ７ ｍｇ ／ Ｌ，明
显高于 ＬＢ培养基中总氮、Ｄ 生物素、ＶＢ１和烟酸的
含量。 所以推测玉米粉全水解液中富含菌体生长和
产酸所需的有机氮源、烟酸、生物素和 ＶＢ１等营养物
质，有利于丁二酸的积累。
表 ２　 ２种培养基中 Ｄ 生物素、ＶＢ１、烟酸和总氮含量的对比
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ⁃ｂｉｏｔｉｎ，ＶＢ１， ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ
发酵培养基 ρ（Ｄ 生物素） ／（ｍｇ·Ｌ－１）
ρ（ＶＢ１） ／
（ｍｇ·Ｌ－１）
ρ（烟酸） ／
（ｍｇ·Ｌ－１）
ｗ（总氮） ／
％
玉米粉全水解液 １１􀆰 ６±０􀆰 ０４ １３９􀆰 ０±０􀆰 ０５ １２􀆰 ７±０􀆰 ０１ ０􀆰 ３５
ＬＢ培养基 ８􀆰 ０３±０􀆰 ０２ １００􀆰 ５±０􀆰 ０５ １０􀆰 ４±０􀆰 ０７ ０􀆰 １２
　 　 通过对关键酶酶活和辅因子含量的测定，考察
玉米粉全水解液对厌氧合成丁二酸的影响，实验结
果见表 ３。 由表 ３ 可知：使用玉米粉全水解液做培
养基，Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１发酵 ４８ ｈ 后，菌体内辅酶 ＮＡＤ
（Ｈ）总含量、ＭＤＨ、ＰＰＣ 和 ＰＣＫ 的酶活分别为 １５􀆰 ０９
μｍｏｌ ／ ｇ、０􀆰 ８８ Ｕ、０􀆰 ２９ Ｕ和 ０􀆰 ３１ Ｕ，玉米糖渣水解液作
为培养基菌体内辅酶 ＮＡＤ（Ｈ）总含量和 ３种关键酶
的酶活均比在 ＬＢ 培养基菌体内的辅酶 ＮＡＤ（Ｈ）总
含量和 ３种酶酶活要高。 再与表 ２结合分析，可以发
现辅酶 ＮＡＤ（Ｈ）总含量和关键酶酶活与关键生长因
子含量成正相关关系，由此推测，玉米粉全水解液中
较多的关键生长因子含量使菌体在培养过程中产生
较高的酶活和较多的辅因子供给重组大肠杆菌
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１厌氧代谢生产丁二酸。
表 ３　 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１厌氧发酵中ＭＤＨ、ＰＰＣ和 ＰＣＫ酶活以及辅因子 ＮＡＤ（Ｈ）的对比
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＭＤＨ，ＰＰＣ，ＰＣＫ ａｎｄ ＮＡＤ（Ｈ）ｄｕｒｉｎｇ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｂｙ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１
发酵培养基 ＭＤＨ酶活 ／ Ｕ ＰＰＣ酶活 ／ Ｕ ＰＣＫ酶活 ／ Ｕ ＮＡＤＨ总含量 ／（μｍｏｌ·ｇ－１）
ＮＡＤ＋总含量 ／
（μｍｏｌ·ｇ－１）
ＮＡＤ（Ｈ）总含量 ／
（μｍｏｌ·ｇ－１）
玉米粉全水解液 ０􀆰 ８８±０􀆰 ０４ ０􀆰 ２９±０􀆰 ０２ ０􀆰 ３１±０􀆰 ０１ ３􀆰 ７８ １１􀆰 ３１ １５􀆰 ０９
ＬＢ培养基 ０􀆰 ０４±０􀆰 ０２ ０􀆰 ０５±０􀆰 ０１ ０􀆰 ２２±０􀆰 ０２ ２􀆰 ２７ ８􀆰 ７２ １０􀆰 ９９
２􀆰 ３　 碳氮比对发酵的影响
培养基中的碳氮比对于菌体的培养有关键性
的作用［１９］。 笔者设计单因素实验，培养基中总氮浓
度不变，添加不同浓度的初糖，考察不同碳氮比对
于重组大肠杆菌利用玉米粉全水解液厌氧发酵丁
二酸的影响。 实验结果见图 １。
由图 １ 可知：当初糖质量浓度为 ２０ ｇ ／ Ｌ 时，
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１在玉米粉全水解液培养基厌氧发酵
７１　 第 ３期 张汉文等：大肠杆菌 ＡＦＰ１１１利用玉米粉全水解液厌氧发酵合成丁二酸
图 １　 不同初糖浓度专一性厌氧发酵结果
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｉｎｉｔｉａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
４８ ｈ 后，菌体细胞干质量、糖消耗量以及丁二酸积
累都是最高的，丁二酸的产量为 １５􀆰 ２１ ｇ ／ Ｌ，丁二酸
转化率为 ０􀆰 ７６ ｇ ／ ｇ。 与其他初糖浓度的发酵结果相
比，初糖质量浓度为 ２０ ｇ ／ Ｌ 时，是菌体生长和产酸
较适宜的碳氮比。
２􀆰 ４　 ５ Ｌ发酵罐厌氧发酵丁二酸结果
选用上节实验所得到的碳氮比，在 ５ Ｌ 发酵罐
中分别进行玉米粉全水解液培养基和 ＬＢ 培养基厌
氧发酵的放大实验，发酵结果如图 ２、图 ３ 和表 ４
所示。
由图 ２、图 ３和表 ４可知：专一性厌氧条件下发酵
１２０ ｈ，Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＡＦＰ１１１在玉米粉全水解液培养基中消
耗 ５０ ｇ ／ Ｌ葡萄糖，发酵生产丁二酸 ４２􀆰 ２９ ｇ ／ Ｌ，得率
　 　 　 　 　
为 ０􀆰 ８４ ｇ ／ ｇ，与在 ＬＢ培养基中发酵生产丁二酸相比，
丁二酸产量相差无几，但得率提高了 ２１􀆰 ７４％。
图 ２　 玉米粉全水解液培养基专一性厌氧 ５ Ｌ发酵罐发酵结果
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ
ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ
ｍｅｄｉｕｍ ｉｎ ａ ５⁃Ｌ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
图 ３　 ＬＢ培养基专一性厌氧 ５ Ｌ发酵罐发酵结果
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ
ＬＢ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎ ａ ５⁃Ｌ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
表 ４　 ５ Ｌ发酵罐中 ２种培养基专一性厌氧发酵结果对比
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎ ａ ５⁃Ｌ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
发酵培养基类型 ρ（ＤＣＷ） ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（耗糖） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（丁二酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（乙酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
得率 ／
（ｇ·ｇ－１）
玉米粉全水解液 ３􀆰 ３０±０􀆰 ０８ ５０􀆰 ００±０􀆰 ０５ ４２􀆰 ２９±０􀆰 ０１ ４􀆰 ５５±０􀆰 ０７ ０􀆰 ８４
ＬＢ培养基 ５􀆰 ６±０􀆰 ０２ ６０􀆰 ００±０􀆰 ０５ ４１􀆰 ７２±０􀆰 ０７ ８􀆰 ５２±０􀆰 ０５ ０􀆰 ６９
３　 结论
用不同的酶水解得到葡萄糖水解液和玉米糖
渣水解液，在不添加其他碳、氮源的前提下，利用玉
米粉全水解液作为培养基代替含有价格昂贵的酵
母粉和蛋白胨的 ＬＢ 培养基。 重组大肠杆菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ＡＦＰ１１１在专一性厌氧条件下利用玉米粉全水解液
发酵生产丁二酸，发酵 １２０ ｈ，利用玉米粉全水解液
做培养基，消耗 ５０ ｇ ／ Ｌ 的葡萄糖，丁二酸产量为
４２􀆰 ２９ ｇ ／ Ｌ，与用 ＬＢ 培养基消耗 ６０ ｇ ／ Ｌ葡萄糖生产
的丁二酸产量相差无几；但利用玉米粉全水解液的
丁二酸得率为 ０􀆰 ８４ ｇ ／ ｇ，比利用 ＬＢ培养基的得率提
高了 ２１􀆰 ７４％。 对玉米粉全水解液的部分成分分
析，发现与 ＬＢ 培养基相比，Ｄ 生物素、烟酸和 ＶＢ１
的含量较高，Ｄ 生物素和 ＶＢ１对菌体以糖为底物的
代谢有着密不可分的联系，而烟酸是能量与辅酶系
统中的重要前体物质。 由此可见，Ｄ 生物素、烟酸
和 ＶＢ１对于玉米粉全水解液做发酵培养基厌氧发酵
生产丁二酸有促进作用。 除此之外，玉米粉全水解
液的原料成本低于 ＬＢ 培养基的原料成本。 由此可
以表明，玉米粉全水解液作为发酵培养基有代替 ＬＢ
培养基厌氧发酵生产丁二酸的潜力。
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
参考文献：
［ １ ］　 姜岷，马江锋，陈可泉，等．重组大肠杆菌产琥珀酸研究进展
［Ｊ］ ．微生物学通报，２００９，３６（１）：１２０⁃１２４．
［ ２ ］ 　 王庆昭，吴巍，赵学明．生物转化法制取琥珀酸及其衍生物的
前景分析［Ｊ］ ．化工进展，２００４，２３（７）：７９４⁃７９８．
［ ３ ］ 　 Ｊｉａｎｇ Ｍ，Ｌｉｕ Ｓ Ｗ，Ｍａ Ｊ Ｆ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ ｆｅｅｄｉｎｇ
ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｏｎ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２０１０， ７６ （ ４ ）：
１２９８⁃１３００．
［ ４ ］ 　 Ｓａｎ Ｋ Ｙ， Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｇ Ｎ， Ｂｅｒｒíｏｓ⁃Ｒｉｖｅｒａ Ｓ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｕｘ ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［ Ｊ］ ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，
２００２，４（２）：１８２⁃１９２．
［ ５ ］ 　 Ｊｉａｎｇ Ｍ，Ｗａｎ Ｑ，Ｌｉｕ Ｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ
ｃｏｒｎ ｓｔａｌｋ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｉｎ ａｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ｍｕｔａｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ
ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ａｎｄ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｐｌａｓｍａｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ［Ｊ］ ．Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，４１（１）：
１１５⁃１２３．
［ ６ ］ 　 Ｃｌａｒｋ Ｄ Ｐ． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ［ Ｊ］ ．
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，１９８９，５（３）：２２３⁃２３４．
［ ７ ］ 　 Ｖｅｍｕｒｉ Ｇ Ｎ，Ｅｉｔｅｍａｎ Ｍ Ａ，Ａｌｔｍａｎ Ｅ． Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｄｕａｌ⁃ｐｈａｓｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｆ
ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｅｒｏｂｉｃ ｔｏ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］ ．Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，２８（６）：３２５⁃３３２．
［ ８ ］ 　 Ｖｅｍｕｒｉ Ｇ Ｎ，Ｅｉｔｅｍａｎ Ｍ Ａ，Ａｌｔｍａｎ Ｅ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｍｏｄｅ ａｎｄ
ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｏｎ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，
２００２，６８（４）：１７１５⁃１７２７．
［ ９ ］ 　 Ｍａ Ｊ Ｆ，Ｊｉａｎｇ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｋ Ｑ，ｅｔ ａｌ． Ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅ． ｃｏｌｉ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｅｔｔ，２０１０，３２（１０）：１４１３⁃１４１８．
［１０］ 　 Ｗｕ Ｑ Ｙ，Ｍｉａｏ Ｙ Ｌ．Ｍｅｃｈａｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ［Ｊ］ ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｐｏｌｙｍ，２００８，７３
（３）：３９８⁃４０２．
［１１］ 　 Ｗａｎｇ Ｆ Ｑ，Ｇａｏ Ｃ Ｊ，Ｙａｎｇ Ｃ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｔｈａｎｏｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｇｒａｖｉｔｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ［ Ｊ ］ ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，２００７，２９（２）：２３３⁃２３６．
［１２］ 　 中华人民共和国卫生部．ＧＢ ５００９．５—２０１０ 食品中蛋白质的
测定方法［Ｓ］．北京：中国标准出版社．
［１３］ 　 Ｌｉａｎｇ Ｌ Ｙ， Ｌｉｕ Ｒ Ｍ， Ｍａ Ｊ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍａｌａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，２０１０． ｄｏｉ：１０． １００７ ／ ｓ１０５２９⁃
０１１⁃０７０７⁃４．
［１４］ 　 Ｍｉｌｌａｒｄ Ｃ Ｓ，Ｃｈａｏ Ｙ Ｐ，Ｌｉａｏ Ｊ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ
ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９６，
６２：１８０８⁃１８１０．
［１５］ 　 Ｋｉｍ Ｐ，Ｌａｉｖｅｎｉｅｋｓ Ｍ，Ｖｉｅｉｌｌｅ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｖｅｒ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ ｏｎ
ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，７０：１２３８⁃１２４１．
［１６］ 　 娄秀平，沈健增，蔡宇杰，等．维生素对大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ．ＪＮ８产 Ｌ 色氨酸的影响［Ｊ］ ．食品与生物技术学报，２０１３，
（９）：９２１⁃９２６．
［１７］ 　 Ｔｙｌｅｒ Ｃ Ｂ，Ａｍａｎｄａ Ｅ Ｐ，Ｓｕｓａｎ Ｍ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｃｅｔｙｌ⁃ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ［ Ｊ ］ ．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，５２（１９）：３３４６～３３５７．
［１８］ 　 Ｊｉａｎｇ Ｍ， Ｃｈｅｎ Ｘ， Ｌｉａｎｇ Ｌ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｏｒ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］ ．Ｅｎｚｙｍ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，５６（５）：８⁃１４．
［１９］ 　 郑淑真．重组大肠杆菌生产基因治疗质粒 ＤＮＡ发酵工艺研究
［Ｄ］．厦门：厦门大学，２００７．
（责任编辑　 管　 珺）
９１　 第 ３期 张汉文等：大肠杆菌 ＡＦＰ１１１利用玉米粉全水解液厌氧发酵合成丁二酸