全 文 ：第 １４卷第 ２期
２０１６年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０２􀆰 ００７
收稿日期：２０１５－０３－１７
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢＡ００８０４）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２２１０１）；江苏高校优势学
科建设工程
作者简介：张瑾成（１９８９—），男，江苏无锡人，研究方向：生物催化；严　 明（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ ：ｙａｎｍｉｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
一种新型醛酮还原酶的克隆表达、性质研究以及在
不对称合成 （Ｒ） ＣＨＢＥ中的应用
张瑾成，魏　 淼，许　 琳，严　 明
（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：为开发催化 ４ 氯乙酰乙酸乙酯（ＣＯＢＥ）制备（Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯（（Ｒ） ＣＨＢＥ）的新型催化剂，挖
掘到了来自白色念珠菌 ＳＣ５３１４中的一种 ＮＡＤＰＨ辅酶依赖型醛酮还原酶 ＣＡＫ基因（ｃａｋ），并将该基因在大肠杆菌
中表达。 将重组酶进行纯化后，测定其酶学性质，并构建了以葡萄糖为辅底物的双酶偶联辅酶再生系统，考察其不
对称转化制备（Ｒ） ＣＨＢＥ的能力。 结果表明：ＣＡＫ对多种醛酮类化合物有催化活性，其催化 ＣＯＢＥ 的最适反应温
度为 ４０ ℃，最适 ｐＨ为 ５。 ＣＡＫ在 ４０ ℃下以及酸性条件中能保持较好的稳定性。 Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、 Ｋ＋对酶活有一定的激
活作用，而 Ｃｕ２＋存在条件下酶会彻底失活。 乙酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯对酶活的抑制作用较小。 利用双酶偶联
辅酶再生系统不对称转化制备（Ｒ） ＣＨＢＥ。 在合适的条件下，转化 ６００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的底物，产率达 ８０􀆰 ６％，产物对映
体过量值（ｅ􀆰 ｅ．值）＞９９％。
关键词：醛酮还原酶；ＮＡＤＰＨ再生；蛋白纯化；酶学性质；（Ｒ） ４ 氯 ３羟基丁酸乙酯
中图分类号：Ｑ８１５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０２－００３３－０８
Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｌｄｏ⁃ｋｅｔｏ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｏｒ
ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ （Ｒ） ⁃ＣＨＢＥ
ＺＨＡＮＧ Ｊｉｎｃｈｅｎｇ，ＷＥＩ Ｍｉａｏ，ＸＵ ｌｉｎ，ＹＡＮ Ｍｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ ＮＡＤＰＨ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｌｄｏ⁃ｋｅｔｏ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ＣＡＫ） ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＣ５３１４ ｗａｓ
ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ４⁃ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ （ ＣＯＢＥ ） ｔｏ ｅｔｈｙｌ （ Ｒ ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃
ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ （（ Ｒ）⁃ＣＨＢＥ）． Ｔｈｅ ＣＡＫ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｒｏｓｅｔｔａ． Ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＣＡＫ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ａｎ ｅｎｚｙｍｅ⁃ｃｏｕｐｌｅｄ ｃｏｅｎｚｙｍｅ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｃｏ⁃ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄ ｉｔｓ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＣＯＢＥ ｔｏ
（Ｒ）⁃ＣＨＢＥ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＣＡＫ ｈａｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ａｎｄ
ｋｅｔｏｎｅｓ． ＣＡＫ ｈａｄ ａ ｍａｘｉｍｕｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ４０ ℃ ａｎｄ ｐＨ ５． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ｂｅｌｏｗ ４０ ℃ ａｎｄ ｕｎｄｅｒ
ａｃｉｄｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｍｇ２＋，Ｎａ＋ ａｎｄ Ｋ＋ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＡＫ． Ｗｈｅｎ Ｃｕ２＋ ｗａｓ ａｄｄｅｄ， ｎｏ
ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ｄｉｂｕｔｙｌ⁃Ｏ⁃ｐｈｔｈａｌａｔｅ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ
ｌｉｇｈｔ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｅｎｚｙｍｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ，ｔｈｅ ｍｏｌａｒ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
ｙｉｅｌｄ ｒｅａｃｈｅｄ ８０􀆰 ６％ ｗｉｔｈ ６００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＣＯＢＥ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｏｖｅｒ ９９％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｌｄｏ⁃ｋｅｔｏ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ； ＮＡＤＰＨ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ； ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｙ；（Ｒ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃
３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ
　 　 （Ｒ） ４ 氯 ３ 羟基丁酸乙酯（（Ｒ） ＣＨＢＥ）
作为一种手性醇，是合成 Ｌ 肉碱［１］ 、阿托伐他汀
钙［２］ 、（ ） 大内酰亚胺 Ａ［３］ 、（Ｒ） γ 氨基 β 羟
基丁酸（ＧＡＢＯＢ） ［４］ 、负霉素［５］ 、（Ｒ） ４ 氨基 ３
羟丁酸［６］等手性药物的重要中间体，全细胞催化
还原 ４ 氯乙酰乙酸乙酯（ＣＯＢＥ）制备手性 ＣＨＢＥ
具有反应条件温和、操作工艺相对简单、对环境污
染小等优势，是目前首选的制备方法。 早期的研
究多采用野生细胞作为催化剂［７－８］ ，其缺点是产率
及光学纯度很低，且筛选野生型菌株非常困难。
为了克服这些缺点，近年来的研究侧重于将能够
不对称还原 ＣＯＢＥ 的酶在工程菌中过表达用于催
化。 目前，文献报道的用于不对称还原 ＣＯＢＥ 制
备（Ｒ） ＣＨＢＥ 的酶以醛酮还原酶［９］（ＡＫＲ）、短链
脱氢酶［１０］（ＳＤＲ）、羰基还原酶［１１］（ ＣＡＲ）为主，然
而其中大多数酶在制备（Ｒ） ＣＨＢＥ 中仍然不能同
时获得较高的产率和光学纯度。 Ｈｅ 等［１２］将一种
来自于鲑色锁掷酵母的羰基还原酶 ＳｓＣＲ 用于不
对称还原制备（Ｒ） ＣＨＢＥ，其产率和产品的光学
纯度均达到较高的水平（转化 ６００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＣＯＢＥ，
产率为 １００％，光学纯度为大于 ９９％），但反应需在
有机 水两相并添加辅酶的情况下进行。
酶催化合成手性醇时需要辅酶 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ 提
供氢，额外添加会大大提高生产成本。 引入另一
种酶及辅底物构建双酶偶联反应，使 ＮＡＤ（Ｐ） ＋再
生为 ＮＡＤＰＨ，可以实现辅酶的循环，避免辅酶的
持续添加。 例如使用葡萄糖脱氢酶和葡萄糖就可
以将 ＮＡＤＰ ＋再生为 ＮＡＤＰＨ［１３］ 。 在全细胞催化
中，为实现双酶耦联反应，可以将用于不对称还原
ＣＯＢＥ的酶与葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中共表达，
相比于将两种酶单独表达，这种方式的效率通常
会更高。
本研究利用基因数据挖掘的手段，发现一种白
色念珠菌来源的醛酮还原酶 ＣＡＫ，将其在大肠杆菌
中表达，研究其酶学性质。 同时构建双酶偶联辅酶
再生系统，将其应用于不对称转化制备（Ｒ） ＣＨＢＥ
中，并对多个催化条件进行优化，以期实现经济高
效催化制备（Ｒ） ＣＨＢＥ的目的。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌株和试剂
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ、质粒 ｐＥＴ ２２ｂ（＋）
及白色念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＣ５３１４）基因组，保
藏于笔者所在实验室。
４ 氯乙酰乙酸乙酯，Ｆｌｕｋａ 公司；（Ｒ） ／ （Ｓ） ４
氯 ３羟基丁酸乙酯标准品，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ公司；限
制性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶、Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ
聚合酶，宝生物工程 （大连） 有限公司；蛋白质
ｍａｒｋｅｒ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 公司；质粒抽提试剂盒及 ＤＮＡ 凝
胶回收试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；抗
生素及其余试剂，生工生物工程（上海）股份有限
公司。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
种子培养基使用 ＬＢ培养基［１４］。
发酵培养基（ ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 ２５、酵母提取物
１５、 ＮａＣｌ １０、乳糖 ３、 葡萄糖 ２。 用于诱导目标蛋白
的表达。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 醛酮还原酶 ＣＡＫ的克隆
根据来自白色念珠菌 Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＳＣ５３１４
醛酮还原酶 ｃＤＮＡ 序列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＸＭ＿７１４７６１）设
计引物。 上游、下游引物分别引入 Ｎｄｅ Ｉ 及 Ｎｃｏ Ｉ 酶
切位点。 上游引物为 ５′ ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡ⁃
ＧＣＴＣＡＡＴＴＧＣＡ ３′，下游引物为 ５′ ＣＡＴＧＣＣＡＴ⁃
ＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＡ ３′（划线处为酶
切位点）以白色念珠菌基因组为模板，通过 ＰＣＲ 获
得目的片段 ｃａｋ。 ｃａｋ 片段和质粒 ｐＥＴ ２２ｂ（ ＋）经
过 ＮｄｅＩ和 ＮｃｏＩ ３７ ℃双酶切、连接后转化大肠杆菌
ＤＨ５α。 在含有氨苄青霉素（１００ μｇ ／ ｍＬ）和氯霉素
（３４ μｇ ／ ｍＬ）的抗性平板上挑取阳性克隆后抽提质
粒，送交南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
１􀆰 ２􀆰 ２　 醛酮还原酶 ＣＡＫ的表达
经测序验证后，将重组质粒转化表达宿主
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ。 接种于含氨苄青霉素（１００ μｇ ／ ｍＬ ）
和氯霉素（３４ μｇ ／ ｍＬ）的液体 ＬＢ 培养基中，于 ３７
℃培养，８ ｈ 后，将菌液按 ２％（体积分数）接种量转
接于 ５０ ｍＬ（５００ ｍＬ 三角烧瓶）含氨苄青霉素（１００
４３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
μｇ ／ ｍＬ）和氯霉素（３４ μｇ ／ ｍＬ）的发酵培养基中，３７
℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ振荡培养 ３ ｈ 后，转 ３０ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ
振荡培养 １２ ｈ。 培养结束后，８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２０
ｍｉｎ收集菌体。 菌体用同体积 ｐＨ ７􀆰 ０的 Ｎａ３ＰＯ４ 缓
冲悬浮后超声破碎，８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 低温离心 ２０ ｍｉｎ，
收集到的上清液即为粗酶液。
１􀆰 ２􀆰 ３　 蛋白浓度测定及 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
蛋白浓度测定采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法［１５］。 ＳＤＳ
ＰＡＧＥ采用分子克隆实验指南［１６］提供的方法，分离
胶质量分数为 １２％，浓缩胶质量分数为 ５％。 粗酶
液加入 ２× Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ 后，９５ ℃水浴 ５ ｍｉｎ 后上
样，上样量为 １０ μＬ。
１􀆰 ２􀆰 ４　 酶活力测定
酶活力测定体系包括 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮＡＤＰＨ、１０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ底物 ＣＯＢＥ和 ｐＨ ７􀆰 ０ Ｎａ３ＰＯ４ 缓冲液，加入
适当粗酶液启动反应。 于 ３０ ℃下测定波长 ３４０ ｎｍ
处吸光值的下降率。 酶活定义：每分钟内氧化 １
μｍｏｌ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ所需要的酶量为一个酶活单位 Ｕ。
其计算见式（１）。
酶液中的酶活力＝
ΔＡ
Ｖｔ
Ｖｓ
æ
è
ç
ö
ø
÷ ×１ ０００
εｔＬ
（１）
式中：ΔＡ为 ３４０ ｎｍ 处吸光值的变化值；ε 为消光系
数，取值为 ６ ２２０；Ｖｔ为总反应体积（ｍＬ）；Ｖｓ 为酶液体
积（ｍＬ）；Ｌ为光径，取值为 １ ｃｍ；ｔ为反应时间（ｍｉｎ）。
１􀆰 ２􀆰 ５　 蛋白纯化
将粗酶液进行（ＮＨ４） ２ＳＯ４ 沉淀以除去部分杂
蛋白，再使用疏水层析柱进行进一步纯化。 层析柱
首先用 ｐＨ ７􀆰 ４、含有 １􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ （ＮＨ４） ２ ＳＯ４的 ２０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）预平衡。 洗脱缓冲液
为 ｐＨ ７􀆰 ４、２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的磷酸盐，采用 ０～１００％缓冲
液梯度洗脱。 收集到的活性蛋白经透析、离心处理
后，最后得到的上清即为纯化后的酶液。
１􀆰 ２􀆰 ６　 酶的底物谱测定
醛酮还原酶 ＣＡＫ 的底物谱测定选用的底物主
要包括醛类和酮类化合物：乙醛、戊二醛、正丁醛、
正戊醛、辛醛、苯甲醛、甘油醛、丙酮醛、柠檬醛、乙
酰乙酸乙酯、ＣＯＢＥ、丙酮、丁酮、３ 戊酮、２，３ 戊二
酮、２ 辛酮、乙酰丙酮、甲基异丁基甲酮。 分别将上
述物质以 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的浓度加入酶活测定体系测定
酶活。
１􀆰 ２􀆰 ７　 温度对酶活及稳定性的影响
将纯化后的酶液分别在不同温度的反应条件
下测定其酶活力，研究温度对酶活的影响。 将酶液
置于 ２０、２５、３０、３５、４０、４５和 ５０ ℃的水浴中，每隔 １０
ｍｉｎ取样，分别测定残余酶活以研究酶的热稳定性。
１􀆰 ２􀆰 ８　 ｐＨ对酶活的影响及酶的 ｐＨ稳定性
使用不同 ｐＨ的缓冲体系测定酶活，研究 ｐＨ对
酶活的影响，缓冲体系为 ｐＨ ４􀆰 ０ ～ ５􀆰 ５ 醋酸盐缓冲
液、ｐＨ＝ ５􀆰 ５ ～ ７􀆰 ５ 磷酸盐缓冲液、ｐＨ ７􀆰 ５ ～ ９􀆰 ０ Ｔｒｉｓ
缓冲液。 将酶液分别置于 ｐＨ ＝ ４􀆰 ０ ～ ９􀆰 ０ 的缓冲液
中，４ ℃保存 ２４ ｈ 后测定酶活力，研究酶的 ｐＨ 稳
定性。
１􀆰 ２􀆰 ９　 金属离子对酶活的影响
向纯化后的酶液中分别加入 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的
Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎａ＋和
Ｋ＋，在 ４ ℃下孵育 １ ｈ后测定酶活，考察金属离子对
酶活的影响。
１􀆰 ２􀆰 １０　 有机溶剂对酶活的影响
向酶活测定体系中加入 １０％～５０％（体积分数）
的有机溶剂（乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛酸乙酯、三氯
甲烷、邻苯二甲酸二丁酯、异丙醚），分别测定酶活，
考察金属离子对酶活的影响。
１􀆰 ２􀆰 １１　 双酶共表达菌株的构建及表达
将葡萄糖脱氢酶 ｇｄｈ基因片段插入至重组质粒
ｐＥＴ ｃａｋ中 ｃａｋ片段下游实现双酶共表达，具体方
法：设计引物扩增 ｇｄｈ基因（来自巨大芽胞杆菌）并
在 ｇｄｈ片段 ５′端引入 ＳＤ ＡＳ序列。 上游引物为 Ｃ⁃
ＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＣ⁃
ＡＧＡＴＴＴＡＡＡＡＧ（含 Ｎｃｏ Ｉ 酶切位点），下游引物为
ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＧＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣ
（含 Ｎｏｔ Ｉ 酶切位点）经 ＰＣＲ 扩增后，将重组质粒
ｐＥＴ ｃａｋ和片段分别用 ＮｃｏＩ 和 ＮｏｔＩ 双酶切，连接
并经测序验证后转化入大肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａ 中表达。
制备粗酶液后用 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 检测。 单独测定粗酶
液中 ２种酶的酶活：ＧＤＨ酶活测定体系为 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＮＡＤＰ ＋，１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 底物葡萄糖，ｐＨ ７􀆰 ０ Ｎａ３ＰＯ４ 缓
冲液，加入适量粗酶液启动反应。 于 ３０ ℃下测定波
长 ３４０ ｎｍ处吸光值的上升率。 酶活定义：每分钟内
还原 １μｍｏｌ ＮＡＤＰ ＋所需要的酶量为一个酶活单
位 Ｕ。
１􀆰 ２􀆰 １２　 生物转化 ＣＯＢＥ至（Ｒ） ＣＨＢＥ
低温离心收集发酵培养基培养的含重组质粒
ｐＥＴ ｃａｋ ｇｄｈ的双酶共表达重组菌，以 ２０ ｇ ／ Ｌ 的
添加量添加入反应体系中。 反应体系包括 ２００～６００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ的底物 ＣＯＢＥ、８００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的葡萄糖以及
５３　 第 ２期 张瑾成等：一种新型醛酮还原酶的克隆表达、性质研究以及在不对称合成 （Ｒ） ＣＨＢＥ中的应用
Ｎａ３ＰＯ４ 缓冲液。 转化反应在恒温摇床 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ的
条件下进行，并定时调节 ｐＨ至初始值。
１􀆰 ２􀆰 １３　 底物及产物的气相检测方法
ＣＯＢＥ与 ＣＨＢＥ 浓度采用气相色谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔ
７８２０Ａ）测定。 ＰＥＧ２０Ｍ毛细管柱（２０ ｍ×０􀆰 ３２ ｍｍ×
０􀆰 ２５ μｍ）；载气为 Ｎ２，分流比 １ ∶ ２０；气化和检测室
的温度 ２２０ ℃，梯度升温（初始温度 １３０ ℃，保持 ３
ｍｉｎ；以 ２０ ℃ ／ ｍｉｎ 程序升温至 １３５ ℃，保持 ７ ｍｉｎ；
再以 ４０ ℃ ／ ｍｉｎ 程序升温至 １５０ ℃，保持 ３ ｍｉｎ；再
以 ２０ ℃ ／ ｍｉｎ程序升温至 １６０ ℃，保持 １ ｍｉｎ）；检测
器为 ＦＩＤ。 ＣＯＢＥ 和 ＣＨＢＥ 的出峰时间分别为
９􀆰 ７１３ ｍｉｎ和 １３􀆰 ８３８ ｍｉｎ。
产物对映体过量值（ｅ􀆰 ｅ􀆰 ）的测定也同样使用气
相色谱仪，分析条件：色谱柱 ＣＰ Ｃｈｉｒａｓｉｌ Ｄｅｘ ＣＢ
（２５ ｍ×０􀆰 ２５ ｍｍ×０􀆰 ２５ μｍ）；载气为高纯氮，分流比
１ ∶ ５０；进样室和检测室温度 ２５０ ℃。 （Ｒ） ＣＨＢＥ和
（Ｓ） ＣＨＢＥ 出峰时间分别为 １６􀆰 ８１３ ｍｉｎ 和
１７􀆰 ４１３ ｍｉｎ。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 基因数据挖掘获得醛酮还原酶 ＣＡＫ
以目前文献报道的几种可用于不对称还原
ＣＯＢＥ合成（Ｒ） ＣＨＢＥ的氧化还原酶（ＡＲＩ、ＢｙｕｅＤ、
ｇｏｘ２０３６、ＬＥＫ、ＣｍＡＲ 等）的氨基酸序列作为探针，
在 ＮＣＢＩ数据库中进行搜索，发现 １ 种来自白色念
珠菌 Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎ的假定蛋白，其氨基酸序列与
氧化还原酶 ＬＥＫ的氨基酸序列相似度大于 ５０％，据
此认为该假定蛋白具有不对称还原制备 （ Ｒ）
ＣＨＢＥ的潜力。 又经 ＢＬＡＳＴ 工具搜索，发现该蛋白
的氨基酸序列与多种醛酮还原酶的氨基酸序列具
有显著的相似性（超过 ４０％相似性），这说明此蛋白
属于醛酮还原酶超家族，将此酶命名为 ＣＡＫ。
２􀆰 ２　 醛酮还原酶 ＣＡＫ的克隆、表达及纯化
将 ＰＣＲ 扩增后的 ｃａｋ 基因片段和质粒 ｐＥＴ
２２ｂ（＋）分别双酶切后进行连接，经测序验证完全正
确。 将得到的重组质粒命名为 ｐＥＴ ｃａｋ。 将ｐＥＴ
ｃａｋ转化表达宿主大肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａ，经发酵培养，超
声破碎菌体得到了粗酶液。 文献报道的醛酮还原
酶绝大多数为 ＮＡＤＰＨ 辅酶依赖型，本实验酶活测
定也选择 ＮＡＤＰＨ 作为辅酶，使用 ＮＡＤＨ 作为辅酶
检测不到任何活性。 经计算，粗酶液比酶活为 ４􀆰 ３
Ｕ ／ ｍｇ。 粗酶液经纯化后，用 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析，结果
如图 １所示。 由图 １ 可知，目标蛋白大小与预期一
致（约 ３􀆰 ３ × １０４ ），纯化后的酶液比酶活达到 ９􀆰 ３
Ｕ ／ ｍｇ。
１—重组菌粗酶液； ２—经（ＮＨ４） ２ＳＯ４ 初步纯化；
３—经疏水层析纯化； ４—标准蛋白质
图 １　 蛋白纯化 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳图
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＣＡＫ
２􀆰 ３　 酶的底物谱测定
醛酮还原酶的底物谱主要由醛类和酮类化合
物构成，ＣＡＫ的底物谱测定结果如表 １ 所示。 由表
１可见，ＣＡＫ对于醛类的底物谱较宽，对多种醛类有
催化活力且活力较高。 其对丙酮醛的催化活力最高，
表 １　 ＣＡＫ的底物谱测定
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ＣＡＫ
底物 比酶活 ／（Ｕ·ｍｇ－１）
相对酶活 ／
％
乙醛 ０ ± ０􀆰 ０１ ０
戊二醛 ４􀆰 ９７ ± ０􀆰 ０９ ２６􀆰 ７
正丁醛 ８􀆰 ４４ ± ０􀆰 １３ ４５􀆰 ３
正戊醛 ７􀆰 ００ ± ０􀆰 ０７ ３７􀆰 ６
辛醛 ６􀆰 １０ ± ０􀆰 １２ ３２􀆰 ７
苯甲醛 １３􀆰 ００ ± ０􀆰 １４ ７３􀆰 ７
甘油醛 ９􀆰 ０７ ± ０􀆰 ２３ ５１􀆰 ４
丙酮醛 １８􀆰 ６４ ± ０􀆰 ２１ １００􀆰 ０
柠檬醛 ０ ± ０􀆰 ０１ ０
乙酰乙酸乙酯 ２􀆰 ８５ ± ０􀆰 １１ １５􀆰 ３
ＣＯＢＥ ９􀆰 ３０ ± ０􀆰 ２０ ４９􀆰 ９
丙酮 ０ ± ０􀆰 ０１ ０
丁酮 ０ ± ０􀆰 ０１ ０
３ 戊酮 ０ ± ０􀆰 ０１ ０
２，３ 戊二酮 １０􀆰 ５１ ± ０􀆰 １７ ５６􀆰 ４
２ 辛酮 ０ ± ０􀆰 ０１ ０
乙酰丙酮 ０ ± ０􀆰 ０１ ０
甲基异丁基甲酮 ０ ± ０􀆰 ０１ ０
６３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
酶活达到 １８􀆰 ６４ Ｕ ／ ｍｇ。 相比较而言，ＣＡＫ能够催化
的酮类化合物种类比较少，在所有测定的酮类化合
物中，除乙酰乙酸乙酯、ＣＯＢＥ、２，３ 戊二酮这类带
有 α酮基的化合物外，其他酮类均测不到活性。
２􀆰 ４　 温度对酶活的影响结果
考察温度（２０ ～ ５０ ℃）对 ＣＡＫ 酶活的影响，结
果如图 ２ 所示。 由图 ２ 可知：在 ４０ ℃时，醛酮还原
酶 ＣＡＫ的活力达到最高；低于 ４０ ℃时，酶活力受
到了抑制；而当温度超过 ４０ ℃时，虽然较高的温
度可使酶促反应速率加快，但是此时蛋白变性对
酶活的抑制作用更加明显，所以酶活力开始呈现
下降趋势。
图 ２　 温度对 ＣＡＫ酶活的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＡＫ
２􀆰 ５　 ＣＡＫ的热稳定性
不同的温度条件下研究 ＣＡＫ的热稳定性，结果
见图 ３。 由图 ３可知：其在 ４０ ℃以下能保持较好的
稳定性；而当在 ４５ ℃条件下保温 ０􀆰 ５ ｈ 后，酶活几
乎完全丧失。 这表明在超过 ４５ ℃的条件下，酶的空
间结构很容易被破坏。 Ｗａｎｇ 等［１７］ 报道了一种
Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ 来源的用于制备 （Ｒ）
ＣＨＢＥ的醛酮还原酶，其在 ４０ ℃下保温 ０􀆰 ５ ｈ 后仅
有 ２０％的残余酶活，相比较而言，ＣＡＫ 的热稳定性
要略高一些。
图 ３　 ＣＡＫ的温度稳定性曲线
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＣＡＫ
２􀆰 ６　 ｐＨ对酶活的影响
考察不同 ｐＨ 对醛酮还原酶的酶活影响，结果
见图 ４。 由图 ４可知：在 ｐＨ为 ５时酶活最高，在 ｐＨ
４～７ 之间，酶活力保留了最大酶活的 ７０％以上。 在
碱性条件下，酶活会受到较大程度的抑制。 这可能
是因为在偏酸性的环境中，ＣＡＫ 酶分子活性中心的
空间构象更有利于与底物的结合，表现出了更高的
催化活性。
图 ４　 ｐＨ对 ＣＡＫ酶活的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＡＫ
２􀆰 ７　 ＣＡＫ的 ｐＨ稳定性
图 ５比较了酶在不同 ｐＨ条件下保存 ２４ ｈ后的
残余酶活。 由图 ５可知：ＣＡＫ 在酸性条件下较为稳
定。 而当 ｐＨ大于 ８ 时，酶活损失严重。 其原因可
能是在碱性环境下，ＯＨ－浓度的增加，使得酶活性中
心的结构更容易发生不可逆的改变，从而导致其催
化活力急剧降低。 因此，ＣＡＫ 不宜保存在碱性的缓
冲液中。
图 ５　 ＣＡＫ的 ｐＨ稳定性曲线
Ｆｉｇ􀆰 ５　 ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＣＡＫ
２􀆰 ８　 金属离子对 ＣＡＫ酶活的影响
考察多种金属离子对 ＣＡＫ酶活的影响，结果见
表 ２。 由表 ２可知：其中 Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋对酶活有一定
的激活作用，其余金属离子均对酶活有抑制作用，
其中添加 Ｃｕ２＋使酶完全失活。 该结果表明，ＣＡＫ 对
某些金属离子尤其是 Ｃｕ２＋较为敏感，少量的 Ｃｕ２＋就
７３　 第 ２期 张瑾成等：一种新型醛酮还原酶的克隆表达、性质研究以及在不对称合成 （Ｒ） ＣＨＢＥ中的应用
可以使酶的空间结构破坏，导致其完全丧失活性，
因此，在催化体系中应该避免 Ｃｕ２＋的引入。
表 ２　 金属离子对酶活的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＡＫ
金属离子 相对酶活 ／ ％
Ｍｇ２＋ １０９􀆰 ３±０􀆰 ７
Ｍｎ２＋ ７４􀆰 ６±０􀆰 ２
Ｚｎ２＋ ５３􀆰 ０±０􀆰 ８
Ｃａ２＋ ９４􀆰 ７±０􀆰 ３
Ｆｅ３＋ ５０􀆰 ８±０􀆰 ２
Ｃｕ２＋ ０
Ｎｉ２＋ ９９􀆰 １±０􀆰 ２
Ｃｏ２＋ ９６􀆰 ４±０􀆰 ４
Ｎａ＋ １１８􀆰 ５±０􀆰 ５
Ｋ＋ １１２􀆰 ２±０􀆰 ７
无 １００􀆰 ０
２􀆰 ９　 有机溶剂对 ＣＡＫ酶活的影响
催化转化 ＣＯＢＥ 的反应中，为增加底物的溶解
性，降低底物和产物对酶的毒害作用，通常会加入
有机溶剂，但有机溶剂本身也可能会抑制酶活
性［１８］。 ＣＯＢＥ 和 ＣＨＢＥ 在乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛
酸乙酯、三氯甲烷、邻苯二甲酸二丁酯、异丙醚这几
种有机溶剂中的油水分配系数都较高，表明这些有
机溶剂具备用于有机 水双相催化制备 ＣＨＢＥ 的潜
力。 本实验考察上述有机溶剂及其加入量对酶活
的影响，以不加有机溶剂体系的相对酶活为 １００％，
结果见图 ６。 由图 ６ 可知：所有的有机溶剂均对酶
活有抑制作用，其中乙酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯
的抑制作用相对较小，当有机相体积分数达到
５０％，时 ＣＡＫ尚有 ６０％左右的残余酶活。
图 ６　 有机溶剂对酶活的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＡＫ
２􀆰 １０　 ＣＡＫ和 ＧＤＨ的共表达及酶活测定
双酶共表达重组菌粗酶液经 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 鉴
定，结果见图 ７。 由图 ７ 可见，目的条带明显，相对
分子质量与预期一致，２ 种酶在大肠杆菌中均得到
了良好的可溶性表达。 经计算，粗酶液中 ＣＡＫ 和
ＧＤＨ的酶活分别为 ２􀆰 ５ 和 ６􀆰 ２ Ｕ ／ ｍｇ（以 １ ｍｇ 蛋白
计）。
１—双酶共表达粗酶液； ２—细胞破碎液（沉淀）；
３—细胞破碎液（全菌）； ４—标准蛋白质
图 ７　 双酶共表达蛋白电泳
Ｆｉｇ􀆰 ７　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
图 ８　 底物浓度对辅酶再生体系催化
合成（Ｒ） ＣＨＢＥ的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＯＢＥ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ （Ｒ） ⁃ＣＨＢＥ ｂｙ ｃｏｅｎｚｙｍｅ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ
２􀆰 １１　 底物浓度对辅酶再生系统不对称催化还原
ＣＯＢＥ的影响
　 　 利用醛酮还原酶 ＣＡＫ 和葡萄糖脱氢酶共表达
的重组大肠杆菌细胞，以及在催化体系中添加的辅
底物葡萄糖来实现辅酶再生。 反应体系的 ｐＨ 设定
为 ６􀆰 ０，温度设定为 ３５ ℃。 图 ８ 表示了不同底物浓
度下，双酶共表达重组菌全细胞催化还原 ＣＯＢＥ 的
产率随时间变化的曲线。 由图 ８ 可知：在底物浓度
８３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
为 ４００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ以下时，经过 ２４ ｈ 的催化反应，底物
几乎都能转化完毕（产率大于 ９９％）。 当底物浓度
超过 ５００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ时，反应 ２４ ｈ 的产率降低至 ８０％
以下，这可能是因为体系中积累了高浓度的产物
ＣＨＢＥ，抑制了醛酮还原酶 ＣＡＫ 的活性，使反应难以
继续进行。 测定最终产物的对映体过量值（ｅ􀆰 ｅ．值），
结果均在 ９９％以上。
２􀆰 １２　 反应温度对辅酶再生系统不对称催化还原
ＣＯＢＥ的影响
　 　 考察温度对催化体系的影响，采用较高的初始
底物浓度（６００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ），ｐＨ 设定为 ６􀆰 ０，经 ２４ ｈ 反
应，测定并计算最终的产率，结果如图 ９所示。 由图
９可见，３０ ℃的温度条件下产率最高。 较高和较低
的反应温度均不利于转化，这是因为低温（低于 ３０
℃）的转化条件降低了酶促反应速率，必然会使最
终产率降低。 而较高的温度则会使酶失活，另外，
温度越高，底物和产物也就越容易发生水解，这些
原因都导致了最终产率的降低。
图 ９　 反应温度对辅酶再生体系催化
合成（Ｒ） ＣＨＢＥ的影响
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ （Ｒ） ⁃
ＣＨＢＥ ｂｙ ｃｏｅｎｚｙｍｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ
２􀆰 １３　 ｐＨ对辅酶再生系统不对称催化还原 ＣＯＢＥ
的影响
　 　 考察不同 ｐＨ的缓冲体系（ｐＨ ４～８）用于催化反
应，转化 ６００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ底物，于 ３０ ℃反应 ２４ ｈ后，测定
并计算产率，结果见图 １０。 由图 １０可知：当反应体系
的 ｐＨ为 ７时可达到最高产率（８０􀆰 ６％），这与 ＣＡＫ的
最适 ｐＨ（ｐＨ 为 ５）有一定出入。 这是因为 ＧＤＨ 在
ｐＨ大于 ７时才能表现出高活性，在酸性条件下其酶
活力较低，使得辅酶再生的效率有所下降。
３　 结论
从白色念珠菌中克隆了 １ 种具有不对称还原
ＣＯＢＥ的醛酮还原酶 ＣＡＫ，并在大肠杆菌中成功表
图 １０　 ｐＨ对辅酶再生体系催化合成
（Ｒ） ＣＨＢＥ的影响
Ｆｉｇ􀆰 １０　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ （Ｒ） ⁃ＣＨＢＥ
ｂｙ ｃｏｅｎｚｙｍｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ
达。 对 ＣＡＫ进行纯化后，研究其酶学性质：ＣＡＫ 对
多种醛酮类化合物有催化活性；其催化 ＣＯＢＥ 的最
适反应温度为 ４０ ℃，最适 ｐＨ 为 ５；酶在 ４０ ℃以下
能保持较好的热稳定性，在弱酸性条件下酶的性质
最稳定，碱性环境中酶活损失较大；Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、 Ｋ＋的
添加对酶有激活作用；多种有机溶剂均对酶活有抑
制作用，而乙酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯对 ＣＡＫ 的
酶活影响相对较小。 通过 ＣＡＫ 和葡萄糖脱氢酶在
大肠杆菌中共表达，构建辅酶再生体系，利用该体
系催化不对称合成（Ｒ） ＣＨＢＥ，在最适的转化条件
下（３０ ℃，ｐＨ＝ ７）转化 ６００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的底物，产率达
８０􀆰 ６％，且产物的 ｅ􀆰 ｅ．值超过 ９９％，表明这种制备
（Ｒ） ＣＨＢＥ的方式具有良好的应用前景。
参考文献：
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９３　 第 ２期 张瑾成等：一种新型醛酮还原酶的克隆表达、性质研究以及在不对称合成 （Ｒ） ＣＨＢＥ中的应用
［ ６ ］　 ＭＡＴＳＵＹＡＭＡ Ａ， ＹＡＭＡＭＯＴＯ Ｈ， ＫＯＢＡＹＡＳＨＩ Ｙ． Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｗｈｏｌｅ⁃ｃｅｌｌ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｃｈｉｒａｌ
ａｌｃｏｈｏｌｓ［Ｊ］ ．Ｏｒｇ Ｐｒｏｃ Ｒｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ，２００２，６：５５８⁃５６１．
［ ７ ］ 　 ＳＨＵＭＩＺＵ Ｓ， ＫＡＴＡＯＫＡ Ｍ， ＭＯＲＩＳＨＩＴＡ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌ⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ ｔｏ ｏｐｔｉｃａｌｌｙ
ａｃｔｉｖｅ ｅｔｈｙｌ⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，
１９９０，１２（８）：５９３⁃５９６．
［ ８ ］ 　 ＹＵ Ｍ Ａ，ＷＥＩ Ｙ Ｍ，ＺＨＡＯ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ４⁃
ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ ｂｙ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ ｆｒｅｓｈ ｂｒｅｗｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ
ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｌｌｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，
２００７，３４：１５１⁃１５６．
［ ９ ］ 　 ＮＩ Ｙ，ＬＩ Ｃ Ｘ，ＷＡＮＧ Ｌ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｒｏｃｈｉｒａｌ ｋｅｔｏｎｅｓ ｂｙ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｆａｃｔｏｒ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１１，９：５４６３⁃５４６８．
［１０］ 　 ＪＩＮＧ Ｋ，ＸＵ Ｚ，ＬＩＵ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｔｈｙｌ ４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ ｔｏ ｅｔｈｙｌ （ Ｒ ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃
ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ［Ｊ］．Ｐｒｅｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，３５：２０３⁃２１５．
［１１］ 　 ＬＩＵ Ｘ，ＣＨＥＮ Ｒ，ＹＡＮＧ Ｚ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ
ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ａｎｄ ｉｔｓ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｔｈｙｌ （Ｒ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ
ｅｓｔｅｒ［Ｊ］ ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，５６：２８５⁃２９５．
［１２］ 　 ＨＥ Ｙ Ｃ，ＺＨＡＮＧ Ｄ Ｐ，ＴＡＯ Ｚ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ⁃
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＣＣＺＵ⁃Ａ１３ ｕｓｉｎｇ
ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ⁃ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
ｅｔｈｙｌ （ Ｒ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ，
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ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌ （Ｒ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ：ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ
ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ ｂｙ ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ
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ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ［Ｍ］．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
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［１５］ 　 ＢＲＡＤＦＯＲＤ Ｍ Ｍ． Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ
ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ⁃ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ［ Ｊ］ ． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １９７６， ７２
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［１６］ 　 ＧＲＥＥＮ Ｍ Ｒ， ＳＡＭＢＲＯＯＫ Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ ［ Ｍ ］． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，２０１２．
［１７］ 　 ＷＡＮＧ Ｑ，ＹＥ Ｔ，ＭＡ Ｚ，ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｔｅ⁃ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｌｄｏ⁃ｋｅｔｏ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ ＮＲＲＬ ＹＢ⁃４２３９ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｅｔｈｙｌ
（ Ｒ ）⁃４⁃ｃｈｌｏｒｏ⁃３⁃ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ ［ Ｊ ］ ． Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
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（责任编辑　 荀志金）
０４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷