全 文 ：第 １３卷第 ２期
２０１５年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０２􀆰 ００９
收稿日期：２０１４－０１－０６
基金项目：山东省自然科学基金（ＺＲ２０１３ＣＭ０１１）
作者简介：范晓静（１９８６—），女，山东济宁人，硕士研究生，研究方向：发育与进化生物学；赵博生（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｏｂｏｓｈｅｎｇ＠ ｓｄｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
东亚三角涡虫 Ｄｊｔｒａｆ３基因的时空表达模式
范晓静，周鲁明，刘殿辰，赵博生
（山东理工大学 生命科学学院 发育与进化生物学实验室，山东 淄博 ２５５０４９）
摘　 要：肿瘤坏死因子受体相关因子 ３（ＴＲＡＦ３）作为 ＴＲＡＦ家族的成员之一，通过介导 ＴＬＲｓ信号通路，参与动物的
免疫反应。 通过构建东亚三角涡虫 Ｄｊｔｒａｆ３的 ｃＤＮＡ文库获得 Ｄｊｔｒａｆ３基因并分析基因结构。 结果发现，该最大开放
阅读框为 ５６４ ｂｐ，编码的蛋白质含 １８７ 个氨基酸，含有 １ 个 ＴＲＡＦ 结构域。 进化分析表明，ＤｊＴＲＡＦ３ 和果蝇的
ＴＲＡＦ３聚群，位于进化树的基部；整体原位杂交结果显示，在涡虫成体及不同再生阶段，Ｄｊｔｒａｆ３ 在整个肠部表达。
这些结果为进一步探究其功能提供了依据和方向。
关键词：东亚三角涡虫；Ｄｊｔｒａｆ３；ＤＩＧ ｌａｂｅｌｉｎｇ ＲＮＡ探针；原位杂交
中图分类号：Ｑ７８５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０２－００４７－０６
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｄｊｔｒａｆ３ ｉｎ ｐｌａｎａｒｉａｎ Ｄｕｇｅｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ
ＦＡＮ Ｘｉａｏｊｉｎｇ，ＺＨＯＵ Ｌｕｍｉｎｇ，ＬＩＵ Ｄｉａｎｃｈｅｎ，ＺＨＡＯ Ｂｏｓｈｅｎｇ
（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｚｉｂｏ ２５５０４９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ ３（ＴＲＡＦ３） ｔａｋｅｓ ｐａｒｔ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ
ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ＴＬＲｓ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ． Ｔｈｅ ｃＤＮＡ Ｄｊｔｒａｆ３ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｌａｎａｒｉａｎ ＴＲＡＦ３，ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ａ
５６４ ｂｐ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｄｅｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ １８７ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ， ａｎｄ ａ ＴＲＡＦ
ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ＤｊＴＲＡＦ３ ａｎｄ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅ ＴＲＡＦ３
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｇｒｏｕｐｅｄ ｔｏｇｅｔｈｅｒ，ａｎｄ ｆａｌｌｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｃｌａｄｅ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｂｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ
Ｄｊｔｒａｆ３ ｉｎ ａｄｕｌｔ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｏｕｒｓｅｓ ｏｆ ｐｌａｎａｒｉａｎ Ｄｕｇｅｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
Ｄｊｔｒａｆ３ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｔｈｅｓｅ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ａｎｄ
ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｄｕｇｅｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ；Ｄｊｔｒａｆ３ ｇｅｎｅ；ＤＩＧ⁃ｌａｂｅｌｉｎｇ ＲＮＡ ｐｒｏｂｅ；ｗｈｏｌｅ⁃ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
　 　 肿瘤坏死因子受体相关因子 （ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ
ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ，ＴＲＡＦｓ）是介导生物
体内细胞因子间信号传导的一类适配蛋白［１］，１９９４
年 １２月，Ｈｕ等［２］通过酵母双杂交技术得到了一个
含有高度保守的 ＴＲＡＦ 结构域和锌指结构的新蛋
白，该蛋白可以通过与 ＣＤ４０ 蛋白相互作用来促进
下游信号通路的传导，将该蛋白命名为 ＴＲＡＦ３，也
叫 ＣＤ４０结合蛋白。 ＴＲＡＦ３ 是 ＴＲＡＦｓ 家族功能最
为多样化的成员之一， ＴＲＡＦ３ 可以与 ＭｙＤ８８
（ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ８８）、ＴＲＩＦ（ｔｏｌｌ⁃ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ） 相互作用，促进
ＴＲＡＦ３ 与 ＩＲＡＫ １ （ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ⁃１ （ ＩＬ⁃１）⁃ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ⁃１）、ＴＢＫ １ （ ＴＲＡＦ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＮＦ⁃
ＫＢ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ⁃１）和 ＩＫＫ ε（ＩｋＢ ｋｉｎａｓｅ⁃
ε） 蛋白复合物的形成，诱导 ＩＦＮ （ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）
的表达，介导 ＴＬＲｓ 信号通路，从而参与机体的免
疫［３－４］；Ｏｇａｎｅｓｙａｎ 等［５］发现 ＴＲＡＦ３ 在不依赖 ＴＬＲｓ
信号通路的抗病毒过程中也有重要作用。 ＴＲＡＦ３
蛋白还能通过自身指环结构的活性和 ＴＲＡＦ结构域
与 ＮＦ κＢ 诱导激酶（ＮＦ⁃κＢ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ，ＮＩＫ）
的绑定结合来调控 ＭＡＰＫ （ｍｉｔｏｇｅｎ⁃ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｋｉｎａｓｅｓ），激活蛋白激酶的蛋白水平，从而调控 ｐｌ００
转变为 ｐ５２的 ＮＦ κＢ活化过程，同时，ＴＲＡＦ３还可
以通过抑制 ＮＦ κＢ 的活性参与淋巴毒素 β 受体
（ＬＴβＲ） 诱导细胞凋亡的过程［６－９］。 此外，ＴＲＡＦ３
还与 ＥＢＶ（ｅｐｓｔｅｉｎ⁃ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）介导的疾病、套细胞淋
巴癌和自身免疫疾病相关。 目前，通过对 Ｈｏｄｇｋｉｎ
疾病的研究，证明抑制 ＴＲＡＦ３ 的降解，有助于对于
该疾病的治疗［１０］。 迄今为止，已在线虫、果蝇、斑马
鱼、鼠和人等多种生物体中发现了 ＴＲＡＦ３ 的存在，
在哺乳动物中，ｔｒａｆ３ 基因广泛表达于体内的各个组
织，例如心、脾、肺、肝脏和肠等［１１］。
东亚三角涡虫（Ｄｕｊｅｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）属于扁形动物门
（ Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ ）、 涡 虫 纲 （ Ｔｕｒｂｅｌａｒｉａ ）、 三 肠 目
（Ｔｒｉｃｌａｄｉｃｌａ）、三角涡虫科（Ｄｕｇｅｓｉｉｄａｅ）、真涡虫属
（Ｄｕｇｅｓｉａ），是扁形动物门涡虫纲的代表动物。 扁形
动物是在动物演化进程中是首次出现两侧对称、三胚
层的类群［１２－１３］，且涡虫具有很强的再生能力，身体的
每一小段都能再生成一个完整的个体，因而其已成为
研究进化、发育和再生机制的模式动物［１４－１５］。
笔者通过 ＤＩＧ ｌａｂｅｌｉｎｇ ＲＮＡ 探针和原位杂交
技术来研究 Ｄｊｔｒａｆ３ 基因在涡虫成体和不同再生阶
段的具体位置，为进一步研究其功能奠定基础，同
时为探究该基因在不同物种中的生物学功能及进
化历程提供依据。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
东亚三角涡虫采于山东省博山区泉河头，用大约
２０ ℃灭菌且用充氧过夜的凉开水饲养，每周用鸡蛋
黄喂食涡虫 １ 次，隔天换水，实验前涡虫饥饿处理 １
周。 含东亚三角涡虫 Ｄｊｔｒａｆ３基因的重组质粒 ｐｃＤＮＡ
３􀆰 ０ Ｄｊｔｒａｆ３保存在由笔者所在实验室成员构建的涡
虫 ｃＤＮＡ 文库中。 Ｎｄｅ Ｉ、 Ｓｐ６ ＲＮＡ 聚合酶、ＲＮａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｄｎａｓｅ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 公司；Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、甘氨酸
（Ｇｌｙ）、蛋白酶 Ｋ， Ａｍｒｅｓｃｏ 公司； ＤＩＧ ＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ
Ｍｉｘ、地高辛抗体、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｒｏｃｈｅ 公司，其他
药品为市售分析纯。
１􀆰 ２　 生物信息学分析
经初步分析的 ＤｊＴＲＡＦ３ 氨基酸序列，在 ＮＣＢＩ
进行 Ｂｌａｓｔｐ 比对， 寻找保守区域 （ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ
ｄｏｍａｉｎ，ＣＤ）和同源蛋白序列。 用 ＤＮＡＳＴＡＲ软件包
中的 ＭｅｇＡｌｉｇｎ软件分析同源蛋白的 ＣＤ序列之间的
相似性；用 ＰＨＹＬＩＰ ３􀆰 ５ｃ 软件包中的 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ
Ｊｏｉｎｉｎｇ 方法，采用 ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 复制数为 １ ０００，并用
Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ ＴＲＡＦ２作为外类群构建进化树。
１􀆰 ３　 ＤＩＧ标记的 ＲＮＡ探针的合成
碱裂解法提取 ｐｃＤＮＡ３ Ｄｊｔｒａｆ３质粒，Ｎｄｅ Ⅰ限
制性内切酶酶切 ｐｃＤＮＡ３ Ｄｊｔｒａｆ３ 质粒，以线性化
的 ｐｃＤＮＡ３ Ｄｊｔｒａｆ３质粒 ＤＮＡ 为模板，用 ＳＰ６ ＲＮＡ
聚合酶体外转录合成反义的 ＤＩＧ 标记的 ＲＮＡ 探
针；对照利用 Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶合成正义链的探针。
１􀆰 ４　 再生涡虫及成体涡虫的制备
选择大小适中的涡虫，将其切割成头、中、尾 ３
部分，隔天换水，依次收集再生 ３、５、７ 和 １０ ｄ 的涡
虫各 １５条，将再生涡虫与 ２０ 条成体涡虫用 ２％（体
积分数）的盐酸杀死，除去盐酸，加入 ４％（体积分
数）的多聚甲醛于 ４ ℃固定 ４ ｈ，用 ３０％、５０％和
７０％（体积分数）的乙醇依次脱水，每次 １ ｍｉｎ，最后
溶于 ７０％的乙醇中，－２０ ℃保存。
１􀆰 ５　 原位杂交
标本经 ６％（体积分数） Ｈ２Ｏ２漂白，２０ mｇ ／ ｍＬ的
Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｋ消化 ２５ ｍｉｎ， Ｇｌｙ终止后，用磷酸钠 吐温
缓冲液（ＮａＰＢＳＴｗ）和磷酸钠缓冲液（ＮａＰＢＳ）洗涤，
４０ ｇ ／ Ｌ 多聚甲醛固定 １ ｈ，０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ 三乙醇胺加
０􀆰 ２５％（体积分数）乙酸酐进行乙酰化，５６ ℃预杂交
３ ｈ，加入 ＤＩＧ标记的探针 ５６ ℃杂交 ３６ ｈ，其中 ５条
成体涡虫不加探针作为空白对照组。 杂交后分别
用柠檬酸钠缓冲液（ ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ） ２、０􀆰 ５ 和
０􀆰 ２倍体积洗脱，２０ μｇ ／ ｍＬ ＲＮＡ酶 Ａ ３７ ℃消化 ３０
ｍｉｎ，１００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ７􀆰 ４）含 １５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＮａＣｌ 洗 ３ 次。 １％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ７􀆰 ４） 含 １５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ），室温封
闭 １ ｈ，在含 Ａｎｔｉ⁃ｄｉｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ （１ ∶ ４ ０００）的 Ｂｌｏｃｋｉｎｇ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ中，室温孵育 ２ ｈ， １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（ｐＨ ８􀆰 ０）含 １５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ 和 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２
洗 ３ 次，然后氯化硝基四氮唑蓝 四唑硝基蓝（ＮＢＴ ／
ＢＣＩＰ）显色，ＮｉｋｏｎＡＺ１００ 显微镜观察拍照。 重复以
上实验 ６次。
８４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 生物信息学分析
ｐｃＤＮＡ３􀆰 ０ Ｄｊｔｒａｆ３ 的 ｃＤＮＡ 全长为 ７４６ ｂｐ
（图 １）。 由图 １ 可知：最大开放阅读框为 ５６４ ｂｐ，
编码的蛋白质含 １８７ 个氨基酸，蛋白相对分子质
量大小约为 ２􀆰 １３ × １０４。 蛋白序列经 ＮＣＢＩ 的
ＢＬＡＳＴ比对，发现该蛋白包含 １ 个 ＭＡＴＨ（ｍｅｐｒｉｎ
ａｎｄ ＴＲＡＦ⁃Ｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ） ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ 结构域，也即
ＴＲＡＦ结构域，包含约 １５０ 个氨基酸残基，预测其
底物结合区位于９８ ～ １５９位氨基酸区域内，与其他
动物类群的 ＴＲＡＦ３ 氨基酸序列比对发现，该蛋白
与果蝇相似度约 ２３％，与斑马鱼相似度约 ３６％，与
哺乳动物相似度高达 ３５％ ～ ３９％。 利用 ＤＮＡＳＴＡＲ
软件包中的ＭｅｇＡｌｉｇｎ程序对各物种的 ＴＲＡＦ３蛋白序
列中 ＴＲＡＦ结构域进行比对，结果显示 ＴＲＡＦ３ 蛋白
中的 ＴＲＡＦ结构域具有高度保守性，尤其是ＴＲＡＦ Ｃ
区域（图 ２）。 利用 Ｐｈｉｌｉｐ３􀆰 ５ｃ 软件包，采用邻位相连
法，Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ 的 ＴＲＡＦ２为外类群（ＧｅｎＢａｎｋ 登录
号：ＸＰ＿００３４７３１５４􀆰 １），１ ０００ 次重复，对代表物种的
ＴＲＡＦ３蛋白进行进化分析，结果见图 ３。 由图 ３ 可
知：ＤｊＴＲＡＦ３和果蝇的 ＴＲＡＦ３聚群，位于进化树的基
部，属于 ＴＲＡＦ３的原始类型。
Ｍ—标准 ＤＮＡ；１～８—４５～６０ ℃温度梯度 ＰＣＲ扩增产物
图 １　 ｐｃＤＮＡ３ Ｄｊｔｒａｆ３菌落不同温度梯度的
ＰＣＲ检测结果
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｃＤＮＡ３⁃Ｄｊｔｒａｆ３ ｐｌａｓｍｉｄ
２􀆰 ２　 Ｄｊｔｒａｆ３在涡虫整体和再生过程中的时空表达
利用地高辛标记的探针进行原位杂交，不含
探针的空白对照组成体涡虫，结果见图 ４。 由图 ４
可知：不含探针的空白对照组没有出现阳性信号；
Ｄｊｔｒａｆ３ 阳性信号遍于涡虫整个肠上，而且重复实
验结果一致。 这表明，Ｄｊｔｒａｆ３ 特异性地表达于成
熟涡虫的肠。 同时，在涡虫再生过程中的不同时
间和不同切段，阳性信号均广泛分布于切段和新
再生的肠，再生 ７ ｄ后恢复到类似于成虫的表达图
式（图 ５），而在涡虫的再生胚基中，未观察到
Ｄｊｔｒａｆ３ 的表达，由此推测，Ｄｊｔｒａｆ３ 基因可能在涡虫
再生过程中并不发挥作用，而主要是参与涡虫的
先天免疫。
目前，已在从低等到高等的多种生物体内（如
线虫、果蝇、斑马鱼、鼠、人等）中发现了 ｔｒａｆ３ 基因
的存在，涡虫在该基因进化历程中属于较原始类
群。 哺乳动物的 ＴＲＡＦ结构域可以介导 ＴＲＡＦｓ 成
员和受体、ＴＲＡＦｓ 成员之间、ＴＲＡＦｓ 成员和一些胞
内蛋白或信号分子的相互作用。 ＴＲＡＦ 结构域包
含约 ２００ 个氨基酸残基，可划分为 ＴＲＡＦ Ｎ 和
ＴＲＡＦ Ｃ 两部分［１６－１７］ 。 ＴＲＡＦ Ｃ 区域为高度保
守的氨基酸同源结构域，含 １６０ ～ １６５ 个氨基酸残
基，可以介导 ＴＲＡＦ分子形成同源或异源二聚体或
多聚体，并分别与不同受体蛋白胞内段的 ＴＲＡＦ 结
构域或胞浆中其他含有 ＴＲＡＦ结构域的蛋白结合。
ＴＲＡＦ Ｃ 可以与 ＴＡＮＫ、ＮＩＫ 等下游信号分子结
合［１８］ 。 ＴＲＡＦ Ｎ 含有周期排列的疏水性氨基酸
残基，可形成环 环 α 螺旋结构，此结构对 ＴＲＡＦ３
分子形成三聚体不可或缺［１９］ 。 哺乳动物的
ＴＲＡＦ３ 分子的 Ｎ 端都含有 １ 个 ＲＩＮＧ 指模序结
构，ＲＩＮＧ 指模序结构后有 ５ ～ ７ 个锌指结构域［２０］ 。
ＲＩＮＧ 指模序介导 ＤＮＡ 蛋白质以及蛋白质 蛋白
质间的相互作用，同时还与 ＮＦ κＢ 的激活相关，
之后还发现环指结构参与 ＴＲＡＦｓ 的蛋白酶体依赖
的降解过程［２１］ ，而锌指结构域对 ＮＦ кＢ 和 ＪＮＫ
的激活都十分重要，ＴＲＡＦ Ｎ 能与 ｃ ＩＡＰＩ 和 ｃ
ＩＡＰＺ等抗凋亡分子相互作用［２２］ 。 本实验研究表
明涡虫的 Ｄｊｔｒａｆ３ 基因编码的蛋白亦含有 １ 个
ＴＲＡＦ 结构域，且其ＴＲＡＦ Ｃ区域高度保守，因而
推测 ＤｊＴＲＡＦ３ 在涡虫体内也有类似作用机制。 同
时，笔者通过 ＤＩＧ ｌａｂｅｌｉｎｇ ＲＮＡ 探针和原位杂交
技术确定了 Ｄｊｔｒａｆ３ 基因在涡虫整体的具体位置和
在不同再生阶段的表达位置，结果显示，Ｄｊｔｒａｆ３ 在
涡虫成体及不同再生阶段均一致表达于整个肠
上，因而推测其参与涡虫的先天免疫，是涡虫免疫
信号通路中的一个调试蛋白，抵抗外界病原微生
物的入侵。
９４　 第 ２期 范晓静等：东亚三角涡虫 Ｄｊｔｒａｆ３基因的时空表达模式
Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ （ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ１８，ＸＰ＿４２１３７８􀆰 １）；Ｃｙｐｒｉｎｕｓ ｃａｒｐｉｏ （ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３，ＡＤＺ５５４５４􀆰 １）；
Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ（ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３，ＮＰ＿００１００３５１３􀆰 １）；Ｘｅｎｏｐｕｓ （Ｓｉｌｕｒａｎａ） ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ （ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３，
ＸＰ＿００２９３８０３６􀆰 ２）；Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ （ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３，ＮＰ＿００１１９２５１５􀆰 １）；Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ
（ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３，ＸＰ＿００３４３５１１３􀆰 １）；Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ （ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３，
ＸＰ＿００２１２３８１９􀆰 １）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｙａｋｕｂａ （ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３，ＥＤＸ０１９１８􀆰 １）；Ｄｕｇｅｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ（ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｆａｃｔｏｒ ３，ｌｃｌ ｜ １４３８４９）；Ｇｅｏｓｐｉｚａ ｆｏｒｔｉｓ （ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３，ＸＰ＿００５４１７９５４􀆰 １）；Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ （ＣＤ４０ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，
ＡＡＡ５６７５３􀆰 １）；Ｌｏｘｏｄｏｎｔａ ａｆｒｉｃａｎａ （ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３，ＸＰ＿００３４０８６５２􀆰 １）；Ｍｉｃｒｏｔｕｓ ｏｃｈｒｏｇａｓｔｅｒ （ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｆａｃｔｏｒ ３，ＸＰ＿００５３４３６２４􀆰 １）；Ｐｔｅｒｏｐｕｓ ａｌｅｃｔｏ （ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３，ＸＰ＿００６９２５６５２􀆰 １）；Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ
（ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ３，ＮＰ＿００１１０２１９４􀆰 １）
图 ２　 ＤｊＴＲＡＦ３蛋白序列与其他代表物种的 ＴＲＡＦ３氨基酸序列比对
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＴＲＡＦ３ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＤｊＴＲＡＦ３
０５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
图 ３　 ＤｊＴＲＡＦ３和其他物种 ＴＲＡＦ３蛋白序列的系统进化树
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＤｊＴＲＡＦ３ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｎｉｍａｌ ＴＲＡＦ３ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
图 ５　 Ｄｊｔｒａｆ３基因在涡虫不同再生阶段中的表达模式
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｄｊｔｒａｆ３ ｉｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｐｌａｎａｒｉａｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ
图 ４　 Ｄｊｔｒａｆ３基因在涡虫成体的表达模式
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｄｊｔｒａｆ３ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｉｎｔａｃｔ
３　 结论
研究发现，涡虫 ＴＲＡＦ３ 属于 ＴＲＡＦ３ 的原始类
型，可能在涡虫的天然免疫中发挥作用，对于丰富
ＴＲＡＦ３的进化意义以及进一步阐明其作用机制、攻
克相关疾病提供了依据和方向。
１５　 第 ２期 范晓静等：东亚三角涡虫 Ｄｊｔｒａｆ３基因的时空表达模式
参考文献：
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（责任编辑　 荀志金）
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（责任编辑　 周晓薇）
２５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷