全 文 ：第23卷 第7期
2011年7月
Vol. 23, No. 7
Jul., 2011
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2011)07-0619-11
O-糖基化起始糖基转移酶的活性与结构研究
王　静，彭　灿，张　延*
(上海交通大学系统生物医学研究院，教育部系统生物医学重点实验室，上海 200240)
摘　要：多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶 (ppGalNAc-T) 是催化 N-乙酰氨基半乳糖 (GalNAc)结合到蛋白
质 Ser或 Thr上的糖基转移酶，是黏蛋白型 O-糖基化修饰的起始糖基转移酶。ppGalNAc-T是一个酶家族，
表达产物均为Ⅱ型膜蛋白。虽然氨基酸序列高度同源，但各成员具有独特的底物特异性和动力学特征。因此，
ppGalNAc-T的底物作用机制是 O-糖基化研究领域中的关键课题。近年来，通过利用定点突变及晶体结构
解析技术，ppGalNAc-T中与底物相互作用的重要氨基酸残基以及由这些残基所形成的对底物结合起关键作
用的空间构象逐渐被揭示，为了解 ppGalNAc-T酶家族的底物作用机制及其蛋白结构与催化活性间的关系
提供了理论依据。
关键词：黏蛋白型 O-糖基化；多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶；定点突变；晶体结构解析
中图分类号：Q555+.4; Q814 文献标志码：A
Catalytic activity and structure analysis of the initial glycosyltransferase of
O-glycosylation
WANG Jing, PENG Can, ZHANG Yan*
(Key Laboratory of Systems Biomedicine of Ministry of Education, Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai
Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)
Abstract: Mucin-type O-glycosylation is iniPtiated by members of the UDP-GalNAc: polypeptide N-acetylgalactos
aminyltransferase (ppGalNAc-T) family which transfers the GalNAc residue to the Ser or Thr of target proteins.
ppGalNAc-Ts are type II membrane proteins. Although ppGalNAc-Ts are highly homologous in their amino acid
sequences, each member has unique substrate preference and dynamic properties. Thus, the mechanism of enzyme-
substrates interaction is an essential issue in O-glycosylation research. Recently, the crucial amino acid residues
which bind with substrates and the enzymatic conformation formed by these residues have been revealed by site-
directed mutagenesis and crystal structure analysis. These investigations provide an important basis for better
understanding of the mechanism of enzyme-substrate interaction as well as the structure-function relationship of the
ppGalNAc-T family.
Key words: mucin-type O-glycosylation; ppGalNAc-T; site-directed mutagenesis; crystal structure analysis
收稿日期：2011-03-09
基金项目：国家自然科学基金项目(30770482, 30970462)
*通信作者：E-mail: yanzhang2006@sjtu.edu.cn; Tel:
021-34206778
多肽：N-乙酰氨基半乳糖基转移酶 (UDP-N-
acetyl-D-galactosamine: polypeptide N-acetylgalactosa
minyltransferase, ppGalNAc-T, EC 2.4.1.41) 是催化
黏蛋白型 O-糖基化修饰起始的糖基转移酶，以尿
苷二磷酸 -半乳糖酰胺 (UDP-GalNAc)为供体底物，
以黏蛋白 (mucin)为受体底物，催化 GalNAc结合
到黏蛋白的 Ser或 Thr上，形成 GalNAc α1-O-Ser/
Thr 结构，即 Tn抗原。O-糖基化普遍存在于细胞中，
发挥重要的生物学功能，如在肿瘤细胞中能够观察
到O-糖链的改变 [1]。ppGalNAc-T酶家族作为催化O-
糖基化起始的糖基转移酶，被认为在肿瘤的发生、
∙ 评述与综述 ∙
生命科学 第23卷620
转移等过程中起到重要作用，此外，ppGalNAc-T
与某些重大疾病密切相关 (表 1)。因此，近年来，
对 ppGalNAc-T酶家族的研究受到广泛关注。研究
表明，ppGalNAc-T酶家族 20个成员的组织分布和
底物特异性呈现一定程度的重叠。但体外酶活分析
表明，它们对底物的催化活性及动力学特征同时存
在着显著差异。因此，ppGalNAc-T与底物作用机
制以及酶结构与活性间的关系是 O-糖基化研究领
域中的关键课题。
本文针对 ppGalNAc-T催化活性与结构，结合
本课题组的研究成果，综合氨基酸位点突变及晶体
结构解析结果对该酶家族的催化活性、底物作用机
制以及构效关系进行综述介绍。
1　ppGalNAc-T酶家族及其表达分布
第一个 ppGalNAc-T蛋白于 1967年由McGaire
和 Roseman在绵羊颌下腺中发现。之后，研究者分
别从肝细胞瘤性腹水和牛初乳中提纯得到该蛋白，
相对分子质量分别为 55 000和 70 000[12-13]。第一个
ppGalNAc-T基因则是 1993年从牛胎盘 cDNA中克
隆得到的 [14]，之后，伴随着 EST数据库的丰富及
人类基因组计划的实施，人类及许多其它物种的
ppGalNAc-T被克隆鉴定。对 EST和基因组数据库
分析发现人类全基因组中共有 20个成员，它们组
成一个酶家族，目前已经有 18个被研究报道 [15-16]，
该酶家族基因在基因组中分布很广，染色体定位各
不相同，但表达产物的氨基酸序列高度保守，例如
ppGalNAc-T1与 -T13的氨基酸序列相似性高达
84.3%[17]。大部分 ppGalNAc-T家族成员分布在消
化道、淋巴系统以及外周血细胞等产生大量 O-糖
基化修饰蛋白的部位 (表 2)，而 ppGalNAc-T9、-T13
表1 ppGalNAc-Ts与疾病的相关性
ppGalNAc-T 成员 功能 参考文献
ppGalNAc-T1 微血管循环及淋巴归巢 [2]
ppGalNAc-T2 冠状动脉疾病 [3]
ppGalNAc-T3 家族性钙质沉积症 [4]
ppGalNAc-T5 遗传性多发外生性骨疣 [5]
ppGalNAc-T6 乳腺癌 [6]
ppGalNAc-T12 结肠癌中抑癌基因 [7]
ppGalNAc-T13 成神经细胞瘤发生标志物 [8]
ppGalNAc-T14 参与细胞凋亡 [9]
ppGalNAc-T16 参与中枢神经系统发育 [10]
ppGalNAc-T17 Williams-Beuren综合征 [11]
表2 20个人ppGalNAc-Ts的酶活特性和mRNA组织表达分布
ppGalNAc-T家族成员 染色体定位 GalNAc转移酶活性 mRNA组织表达分布 参考文献
裸肽 糖肽
ppGalNAc-T1 18q12.1 + + 广泛分布 [18]
ppGalNAc-T2 1q41-q42 + + 广泛分布 [18]
ppGalNAc-T3 2q24-q31 + + 胰腺、小肠、脾脏、肾脏、前列腺、睾丸 [19]
ppGalNAc-T4 12q21.33 + + 广泛分布 [20]
ppGalNAc-T5 2q24.1 + + 舌下腺、胃、小肠、结肠 [21]
ppGalNAc-T6 12q13 + + 脑、气管、胰腺、胎盘 [22]
ppGalNAc-T7 4q31.1 - + 广泛分布 [23]
ppGalNAc-T8 12p13.3 - - 广泛分布 [24]
ppGalNAc-T9 12q24.33 - - 脑(小脑、壳核、颞叶、额叶、大脑皮层) [25]
ppGalNAc-T10 5q33.2 - + 甲状腺、胃、胰腺、脾脏、小肠、卵巢 [26]
ppGalNAc-T11 7q36.1 + + 肾脏 [27]
ppGalNAc-T12 9q22.33 + + 胃、胰腺、小肠、结肠、睾丸 [28]
ppGalNAc-T13 2q24.1 + + 胎脑、成人小脑、大脑皮层、全脑 [17]
ppGalNAc-T14 2p23.1 + + 肾脏、胚肾 [29]
ppGalNAc-T15 3p25.1 + + 大脑皮层、小脑、全脑、胃、乳腺、脾脏 [30]
小肠、胎盘、卵巢、子宫
ppGalNAc-T16 14q24.1 ND ND ND -
ppGalNAc-T17 7q11.23 - - 小脑、大脑皮层 [31-32]
ppGalNAc-T18 11p15.3 - - 肺 [32]
ppGalNAc-T19 7q36.1 ND ND ND -
ppGalNAc-T20 4q34.1 - + 脑、睾丸 [16]
ND, 未检测。
王　静，等：O-糖基化起始糖基转移酶的活性与结构研究第7期 621
和 -T17在脑中特异性高表达，ppGalNAc-T11和 -T14
则特异性表达在肾脏。最新研究结果表明 pp-
GalNAc-T20的 mRNA特异性表达在睾丸和脑中，
提示该酶可能在哺乳动物精子生成和神经元发育的
O-糖基化过程中起着重要作用 [16]。以上反映出
ppGalNAc-T各成员具有其独特的组织表达模式和
生物学功能。
ppGalNAc-T分布于高尔基体中，为Ⅱ型跨膜
蛋白 (图 1)，由 N端结构域、中央催化区 (catalytic
的 20个人类 ppGalNAc-T家族成员的酶活特性进行
详细比较分析 (表 2)发现，大部分 ppGalNAc-T家
族成员对非修饰裸肽底物和已发生 O-GalNAc糖基
化修饰的糖肽底物均具有 GalNAc转移酶活性。
ppGalNAc-T1和 -T2对裸肽底物具有强催化活性，
已有 GalNAc修饰的 Ser或 Thr残基对其邻近位点
的O-GalNAc糖基化具有抑制效应 [38-39]。ppGalNAc-T4
倾向于催化 GalNAc 糖基化修饰糖肽作为其底
物 [40]。而 ppGalNAc-T7[23]、-T10[27]和 -T20[16]只能
催化将 GalNAc添加到已发生 O-GalNAc修饰糖肽
底物的 Ser或 Thr残基上，对没有糖基化多肽的底
物不具有催化活性。本课题组体外酶活实验结果显
示 ppGalNAc-T8、-T9、-T17和 -T18不具有经典的
ppGalNAc-T酶家族GalNAc糖基转移酶催化活性 [25]。
此外，不同的 ppGalNAc-T对同一种多肽底物的反应
动力学特征也不尽相同。因此，ppGalNAc-T底物选
择特异性研究成为 O-糖基化研究领域中的重要课
题。近年来，通过氨基酸位点突变，研究者对
ppGalNAc-T1中能够与底物进行相互作用的关键氨基
酸残基进行了详细研究 [36,41-44]，为揭示 ppGalNAc-T
一级结构与催化活性间的关系提供了重要的科学依据。
2.1　GT1基序
ppGalNAc-T家族酶的中央催化区是行使酶催
化功能的重要结构域，中央催化区的第一个保守基
序为 GT1基序，存在于所有的糖基转移酶中。GT1
基序的 C末端有一个保守的 DXH序列，类似于其
他糖基转移酶中的 DXD序列，可与酶催化活性必
需的Mn2+进行相互作用 [33]。
ppGalNAc-T1的 GT1基序由 5个 β折叠和 4
个α螺旋组成。β 折叠的排列顺序为β3−β2−β1−β4−β5，
其中 β1位于蛋白的内部。β1末端的 His125和 Glu127，
β2末端的 Asp156以及位于 β4末端 DXH box中的
Asp209和 His211在 ppGalNAc-T酶家族中均高度保守
(图 2)，并且位于酶的活性中心 [33]。在这些位点分
别引入突变，会对酶的催化活性产生显著影响。
将 His125突变为 Ala，会导致酶活完全丧失；
而如果将其突变为 Phe或 Tyr，酶活可提高 3倍 [41]。
提示 His侧链咪唑环对酶活的重要作用，而芳香族
氨基酸在这一位点的优势则更加明显。将 Glu127和
Asp156分别突变为 Gln，酶活将分别下降至原来的
0.2%和 0.1%[41]，显示侧链羧基在这一位点至关重要。
ppGalNAc-T酶家族行使催化功能需要Mn2+参
与，解析 ppGalNAc-T1的晶体结构发现，能够与
Mn2+形成复合物的氨基酸是 GT1基序中 DXH box
图1 ppGalNAc-T家族酶的蛋白一级结构
domain)和 C端蓖麻样凝集素结构域 (lectin domain)
组成。N端包括胞浆区、穿膜区及茎区，分别由
4~24、15~25、40~50个氨基酸组成，长短在酶家
族各成员中各不相同，且无序列保守性。
茎区之后为中央催化区，大约由 330~340个氨
基酸组成，是 ppGalNAc-T行使其催化功能的重要
区域，也是该酶家族氨基酸序列保守性最高的区
域。中央催化区包括 2个保守基序，即 GT1 (glyco-
sytransferase 1)基序和 Gal/GalNAc-T 基序。GT1基
序中保守的 DXH box位于酶活性中心，负责与二
价锰离子相互作用，是酶行使催化功能必不可少的
单元 [33-35]。Gal/GalNAc-T 基序位于 GT1基序之后，
负责与供体底物 (UDP-GalNAc)和受体底物 (蛋白
质或多肽 )相互作用，其中的WGGE box发挥了极
其重要的作用 [34-36]。
中央催化区之后为 C末端蓖麻样凝集素结构
域。在糖基转移酶中，只有 ppGalNAc-T酶家族存
在这一结构域 [37]。ppGalNAc-T1的凝集素结构域与
R-型凝集素 (ricin-type lectin)高度相似，由三个重
复序列组成，分别称为 α、β、γ亚结构域，由于每
个亚结构域中均有QXW box，因此也被称为 (QXW)3
重复。Lectin domain可识别、结合多肽底物上已存
在的 GalNAc[35]。
2　ppGalNAc-T酶家族的催化活性研究
由 ppGalNAc-T起始催化的黏蛋白型 O-糖基
化普遍存在于细胞中，是一种重要的蛋白质翻译后
修饰过程，在细胞的生长、发育、凋亡和癌变等过
程中起着重要作用。研究显示，ppGalNAc-各成员
都具有独特的底物特异性和动力学特征。对已发现
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的 Asp209 和 His211，以及 Gal/GalNAc-T 基序中的
His344[33]。若将 His211突变为 Asp，即突变为其他糖
基转移酶中的 DXD序列，这样几乎检测不到
ppGalNAc-T的催化活性 [41]。同样，Asp209对酶的
活性也是不可或缺的，将其分别突变为 Ala、Asn
和 Glu，酶活将完全丧失或下降至原来的 0.3%以
下 [41]。
GT1 基序中还有 3 个高度保守的 Cys，在
ppGalNAc-T1中分别是 Cys106、Cys212和 Cys 214。其
中 Cys106与 Gal/GalNAc-T基序中的 Cys330之间形
成二硫键，将这 2个 Cys分别单独突变为 Ala后，
酶的表达量均明显减少，且酶活完全丧失 [42]。这表
明它们在维持 ppGalNAc-T结构稳定性方面发挥重
要作用，如果发生突变，将导致蛋白表达失败或被
降解。Cys212和 Cys214位于 DXH序列之后，不参与
二硫键的形成，但若将其突变，酶活将分别降低至
原来的 6%和 17%。酶动力学分析显示它们参与和
供体底物 UDP-GalNAc的结合 [42]。
由此可见，GT1基序对于 ppGalNAc-T行使催
化功能非常重要，其中的保守氨基酸残基和 DXH
box对酶的活性尤为关键，或参与与Mn2+的相互作
用，或参与同供体底物的结合，或维持酶的结构稳
定。其他保守残基的酶活性决定机制还有待于进一
步研究。
2.2　Gal/GalNAc-T基序
中央催化区的第二个基序在 ppGalNAc-T酶家
族中高度保守，由于这段序列也存在于 β1,4糖基
转移酶家族中，所以被称为 Gal/GalNAc-T基序。
Gal/GalNAc-T可与糖苷供体和受体相互作用。
ppGalNAc-T的 Gal/GalNAc-T基序包含 6个保守的
芳香族氨基酸残基 (图 3)：Tyr302、Phe303、Tyr309、
Trp316、Phe325和 Trp328。其中 Trp328在所有的 ppGalNAc-T
图中氨基酸序列下方的符号表示氨基酸残基保守程度。文中所述高度保守氨基酸残基在图中以黑体字标出。
图2 人类20种ppGalNAc-T的GT1基序部分氨基酸序列比对
王　静，等：O-糖基化起始糖基转移酶的活性与结构研究第7期 623
中高度保守，其突变会造成 ppGalNAc-T1催化活性
的完全丧失 [36]，晶体结构解析发现它在 ppGalNAc-T
与受体多肽的结合中发挥重要作用。另外 5个氨基
酸残基在其他 ppGalNAc-T家族成员中同样为芳香
族氨基酸，表明这些位点芳香族残基的重要性。若
将它们突变为非芳香族氨基酸残基，如极性相似的
Lys，酶的活性会有所下降。其中 F303L和 Y309L
均可使酶活下降至原来的 40%，酶动力学分析显示，
Phe303既参与了与 UDP-GalNAc的结合，也参与了
与受体多肽的结合；而 Tyr309则主要参与和 UDP-
GalNAc的结合 [36]。更值得注意的是，WGGE box
中的 Trp316几乎在所有 ppGalNAc-T家族成员中保
守。W316Y和W316F分别使酶活降至原来的 40%
和 20%，而突变为 Ala后，酶活完全丧失 [36]，进一
步说明了这一位点芳香族氨基酸的重要作用。
Y302L和 F325L对酶活的影响没有上述残基剧烈，
动力学分析也显示其对酶与底物的结合并不那么重
要，但这两个残基在 ppGalNAc-T家族中非常保守，
并与上述残基相邻，其作用可能在于维持酶活性中
心的疏水微环境。Gal/GalNAc-T基序中的另外两个
保守氨基酸残基 Glu319和 Asn320参与同UDP-GalNAc
的结合，E319Q和N320A使 ppGalNAc-T1的催化活性
分别降至原来的 0.04%以下和 55%[41]。由此可见
Gal/GalNAc-T基序在酶的催化过程中所发挥的重要
作用。
2.3　C-端结构域
中央催化区后为 C-端 lectin domain，由重复的
α、β、γ三个亚结构域组成，每个重复单元包含大
约 50个氨基酸残基。在 ppGalNAc-T酶家族成员中，
lectin domain的氨基酸序列保守性很低，这可能与
各个成员的底物特异性有关。
Lectin domain主要参与维持酶结构的稳定，将
其进行不同程度的删除均会导致 ppGalNAc-T1的表
达量降低和失活 [43]。ppGalNAc-T的 lectin domain
中存在 3对二硫键，在 ppGalNAc-T1中分别为：α
单元的 Cys442-Cys459、β单元的 Cys482-Cys497和 γ单
元中的 Cys523-Cys540，分别将这 6个 Cys突变为
Ala，酶的表达量会显著下降 [43]。因此，这 3对二
硫键可能在维持酶结构的稳定中起着至关重要的
作用。Tenno等 [43]对删除了 lectin domain的 ppGalNAc-T1
进行了酶活检测和动力学分析，发现其虽然对多肽
(PPDAATAAPL)和牛下颌腺黏蛋白 aopmucin的催
化活性丧失，但仍然保留了对 UDP和底物多肽的
亲和性，由此说明 lectin domain的缺失并不会造成
酶催化结构域构象的显著改变。
Lectin domain可结合多肽底物上已存在的
GalNAc。将 QXW 保守序列中的 Phe468 突变为
Ala，酶蛋白表达量将明显减少，且酶活下降至原
来的 10%[43]；而突变为其他两种芳香族氨基酸残基
Trp和 Tyr，对酶活和表达量均没有明显影响 [43]，
表明此位点上的芳香族氨基酸残基扮演着重要的
角色，可能参与形成结合多肽底物上已存在的
GalNAc的疏水核心 [46]。氨基酸位点突变表明，
ppGalNAc-T1 α 单元中的 Asp444和 β 单元中相对应
图中氨基酸序列下方的符号表示氨基酸残基保守程度。文中所述高度保守氨基酸残基在图中以黑体字标出。
图3 人类20种ppGalNAc-T的Gal/GalNAc-T基序氨基酸序列比对
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的 Asp484对 lectin domain与多肽上 GalNAc的结合
最重要，它们的突变会导致酶与牛下颌腺黏蛋白
aopmucin的 Km值分别提高 8.3和 3.6倍 [44]；而将
γ单元中相对应的 Asp525突变，Km值则没有明显
变化 [44]。但 Asp444、Asp484和 Asp525同时突变会使
Km值提高 22.6倍 [44]，显示了突变的叠加效应。综
上所述，ppGalNAc-T1中 lectin domain的 α和 β单
元可识别结合糖肽上的 GalNAc，且 α单元的亲和
性较强，而 γ 单元的功能则不在于此。
3　ppGalNAc-T蛋白结构及其与酶催化活性间
的关系
为更深入了解 ppGalNAc-T的构效关系，研究
者致力于解析 ppGalNAc-T蛋白的晶体结构。目前，
可催化裸肽和糖肽的 ppGalNAc-T1 (T1)、ppGalNAc-T2
(T2) 以及只可催化糖肽的 ppGalNAc-T10 (T10)的
晶体结构已被解析 (表 3)。通过分析比较，对酶结
构以及酶与底物的作用机制有了进一步的了解。
由于 ppGalNAc-T1的晶体 [33]来源于鼠类，且
没有与其底物共结晶，故在此不作详细介绍。美国
Tabak研究组和日本 Narimatsu研究组分别解析了
ppGalNAc-T2和 -T10的晶体结构。T2的晶体结构 [34]
中包含活性必需的Mn2+、供体底物 UDP和受体多
肽 EA2；T10的晶体结构 [35]中包含Mn2+、供体底
物 UDP-GalNAc以及受体糖肽的代替物 GalNAc-
Ser。通过比较晶体结构得知，3种 ppGalNAc-Ts在
与底物相互作用的机制上有着高度一致性，造成不
同底物选择性的原因很可能是中央催化结构域与
lectin domain之间的相对构象不同。
3.1　ppGalNAc-T的晶体结构
图 4为 ppGalNAc-T1、ppGalNAc-T2-UDP和 pp-
GalNAc-T2-UDP-EA2的晶体结构。从整体上看，T2
与 T1的三级结构相似，这是一级结构的高度同源
性所决定的。T2的催化结构域从 Asp115至 Asn432，
其中的 Arg362—Ser373形成一段短的弹性连接，而在
T1的晶体结构中不存在该连接 [34]。此外，T2 N端
有两个 α螺旋，在 T2-UDP-EA2共结晶中靠一段卷
曲相连，这两个 N端螺旋在 T1中也未被观察到 [34]。
与T2相同，ppGalNAc-T10在整体结构上与T1相似，
其催化结构域 (Arg125至 Lys448)中也存在一段短的
表3 ppGalNAc- T晶体结构信息
来源 蛋白编号 晶体结构PDB 编号 参考文献
Mouse T1 NP_038842.2 1XHB [33]
Human T2 NP_004472 T2-UDP: 2FFV [34]
T2-UDP-EA2: 2FFU
Human T10 NP_938080 T10-GalNAc-Ser: 2D7R [35]
T10-UDP-GalNAc: 2D7I
图中α-螺旋和β-折叠片分别用蓝色和黄色表示，无规则卷曲则用灰色线条表示。在ppGalNAc-T1晶体中缺失的N端螺旋和弹
性连接(Arg362—Ser373)分别用红色和黄色表示，绿色碳骨架表示UDP和EA2。
图4 ppGalNAc-T2与ppGalNAc-T1的蛋白结构比较[34]
王　静，等：O-糖基化起始糖基转移酶的活性与结构研究第7期 625
弹性连接 (Arg373—Val384)[35]，氨基酸序列比对显示
其与 T2中的弹性连接相对应 [35]。提示该连接在酶
与底物的相互作用中发挥重要作用。这些结构上的
差异与底物存在与否直接相关，酶与底物的结合会
引起一系列的构象改变。
从晶体结构中还可以看出，T2的 lectin domain
在结构上与 T1相似，均呈现 β-三叶草状 [34]，但
与催化结构域的相对方位与 T1不同。在 T1中，
催化结构域与 lectin domain联系紧密，有 645 Å[34]
的相互作用区域，分子呈直线形。在 T2-UDP共结
晶中两结构域之间只有约 325 Å[34]的接触区域；而
在 T2-UDP-EA2共结晶中，两个结构域之间没有
相互接触，只通过一段氨基酸序列相连，分子近似
L形。同样的情况也可在 T10的晶体结构中观察到，
催化结构域与 lectin domain的相对位置更接近 L
形 [34]，两结构域之间由一条短氨基酸链相连。由
此可见，酶与底物的结合会导致 lectin domain与催
化结构域之间的相对构象发生改变 [34-35]，催化结构
域与 lectin domain相对构象的不同被认为有可能与
ppGalNAc-T的活性以及底物特异性相关。
3.2　与供体底物UDP-GalNAc及Mn2+的作用机制
ppGalNAc-T2晶体结构 [34]中所显示的与 UDP
及Mn2+相互作用的氨基酸残基，与 T10晶体 [35]中
所显示的具有一致的对应关系。而 T10的晶体结构
更详细全面地展示了酶与供体底物 UDP-GalNAc之
间的作用机制，这里主要围绕 T10进行介绍。
T2和 T10催化结构域中的 Gal/GalNAc-T基序
后方均存在一段短的弹性连接，在 T2中为 Arg362—
Ser373[34] (图 4中黄色 loop)，在 T10中为 Arg373—
Val384[35]。这段 loop的作用在于封住 UDP结合口袋，
以防止供体底物在反应结束前释放 [34-35]。T10中有
两个位置的相互作用稳定了该 loop：(1) Arg373、
Tyr378 与 UDP α- 磷酸的相互作用；(2) Lys374 与
Tyr108芳香环形成的 π键以及 Tyr375与 Arg109形成的
氢键。此外，N端 Gly68—Leu123也能稳定该 loop，
并且封住 UDP结合口袋 [35]。
在 T10-UDP-GalNAc晶体中，UDP与 GalNAc
之间的糖苷键在结晶时断开 [35]。UDP的尿嘧啶与
Asp185和 Arg214形成氢键，与 His154和 Tyr378通过疏
水作用和范德华力相互作用；UDP的核糖基团与
T10的 Pro152、Glu156、Ser238形成氢键，高度保守的
Glu156也许在其中发挥最重要的作用。Ser238在某些
ppGalNAc-T中突变为 Ala或 Cys，它们也被认为能
够与 UDP结合，但 Ala的作用较弱 [35]。此外，UDP
还与 Trp342通过氢键相互作用。GalNAc与 DXH box
的 3个氨基酸残基 (Asp237、Ser238、His239)，WGGE
box的 Gly343、Glu345以及 Ala318、Gly320通过氢键相
互作用，并与 His370发生疏水相互作用。其中的
Glu345通过与半乳糖 C4和 C6的羟基形成氢键并在
识别半乳糖的过程中起重要作用 [35]；Ala318和
Gly320参与形成结合 GalNAc的疏水口袋。有意思
的是，Gly320的主链和 His370的咪唑环分别识别 N-
乙酰基的甲基和羧基并进行相互作用 [35]，因此能够
将 GalNAc与 Gal(半乳糖 )相区别。这充分体现了
酶调节底物选择性的精确机制。
Mn2+共与 6个配体相互作用，分别为 UDP β-
磷酸的 2个氧原子，DXH box的 Asp237、His239和
His370，以及水分子 [35]。上述 DXH box的三个氨基
酸在所有 ppGalNAc-T酶家族成员中高度保守。此
外，Arg373、Tyr378和 Trp342间接地与Mn2+相互作用 [35]。
当与供体底物结合时，这三个氨基酸的构象以及附
近氨基酸序列的构象较未结合底物时 (mT1) 有很大
差异。这反映了酶与底物结合与否，构象会发生很
大的改变，而正是这种改变，可以使我们真正了解
ppGalNAc-T与底物的作用机制，以及哪些氨基酸
残基或序列起着关键作用。目前尚未对 T10和 T2
的裸酶进行晶体结构解析，因此更深入地理解
ppGalNAc-T与底物的作用过程还需要进一步的研
究。
在 ppGalNAc-T10 与 UDP-GalNAc 和 Mn2+ 的
作用位点立体结构中 (图 5)可以清楚地看到，酶与
底物通过氢键相互作用。如果这些氨基酸残基发生
图中碳骨架表示ppGalNc-T10中的氨基酸残基，球棍模型表
示供体底物UDP和GalNAc，紫色球体表示Mn2+，黑色虚线
表示氢键。
图5 ppGalNAc-T10的供体底物UDP-GalNAc结合位点[35]
生命科学 第23卷626
突变，那么它们与底物的相互作用将明显减弱或消
失，从而导致酶活的下降和丧失。这充分反映了结
构与酶催化功能间的密切联系。
3.3　与多肽底物的作用机制
T2-UDP-EA2的晶体结构解析分析了酶与多肽
底物 EA2的作用位点。EA2的 Thr7 被认为是最有
可能的糖基化起始位点，其与 UDP的 β-磷酸氧形
成很强的氢键 [34]。T2与受体底物 EA2之间的相互
作用包括氢键和疏水相互作用。氢键主要与 EA2
的 Ser5—Pro8形成，而疏水相互作用主要与 Ala9—
Lys13形成 [34]。
EA2结合在 T2形成的疏水空穴中，空穴由
Val255、Leu270、Trp282 和 Phe361 形 成。EA2 的 Pro10
与空穴的一侧结合，其环状侧链插入空穴中与
Trp282侧链相互作用 [34]。空穴的另一侧还有一些更
浅的口袋，其中 2个被水分子占据。Thr7的羟基氢
与 UDP的 β-磷酸氧作用，其甲基指向一个以
Phe280、Ala307和 Phe361组成的疏水空穴 [34]。Thr6通
过羟基与 Arg362的主链羧基形成氢键而与酶表面的
短序列 Arg362—His365作用 [34]。
由此可见，酶主要通过由一些氨基酸残基所形
成的疏水空穴与受体多肽进行相互作用，多肽插入
疏水空穴中，而后通过氢键与酶形成更紧密的相互
作用。形成该疏水空穴的氨基酸残基不像与 DUP-
GalNAc作用的那些高度保守，提示不同 ppGalNAc-T
的受体底物相互作用位点也不尽相同，这很可能是
产生底物特异性的原因之一。
3.4　中央催化结构域与凝集素结构域之间的相对位
置对酶活的影响
T2-UDP-EA2的晶体结构显示，T2的催化部
位与 lectin domain之间没有紧密接触，只靠一段氨
基酸序列相连。那么 ppGalNAc-T的催化活性是否
需要 lectin domain呢？研究者接下来比较了全长 T2
与删除 lectin domain T2的体外酶活，发现它们对多
肽 EA2和Muc5AC的催化活性相差不大 [34]。但删
除 lectin domain后，T2对糖肽的催化活性明显减弱，
其 Kcat/Km值为全长酶的 5.6%~25%[34]，说明 T2
对糖肽的催化活性依赖 lectin domain，而对非糖肽
的催化活性不依赖 lectin domain。这与 2.3中阐述
的对 ppGalNAc-T1 lectin domain的研究结果相异，
删除其 lectin domain C端 12或 12个以上氨基酸后，
导致 T1对多肽链 (PPDAATAAPL) 和牛下颌腺黏蛋
白 aopmucin均无催化活性 [43]。因此 lectin domain
对 ppGalNAc-T酶活性的调节还未有定论，有待于
进一步研究探讨。
ppGalNAc-T酶家族各成员的中央催化结构域
高度保守，其后 lectin domain的氨基酸序列保守
性较低，这可能是导致各个成员间底物特异性的
另一原因。与 T2-UDP-EA2的晶体结构相似，T10-
UDP-GalNAc的催化结构域与 lectin domain之间也
只靠一段氨基酸序列相连，但该段连接呈现更伸展
的构象，使两结构域之间的相互作用更加微弱。实
际上，在所有 ppGalNAc-T家族成员中，催化结构
域与 lectin domain间的连接序列可能均存在差异 [35]，
由此导致了两个结构域的相对构象在不同的
ppGalNAc-T中各不相同，而这种结构特征有可能
是产生底物特异性的原因之一 [35]。若将 T10中的
该段连接序列替换成 T1的，重组酶不仅保留了对
糖肽的催化活性，对未被糖基化的多肽也表现出了
催化活性 [35]，这证明了上述观点。
综上所述，lectin domain可识别结合底物上已
存在的 GalNAc，在 ppGalNAc-T对糖肽或糖蛋白
的催化作用中起着关键作用。Lectin domain与催化
结构域间的相对构象可能是导致底物特异性的原
因，但 lectin domain与底物的作用机制以及对酶催
化活性的调节机制还有待于进一步的研究。
4　ppGalNAc-T的两个亚家族
本课题组通过进化树和遗传学分析发现，pp-
GalNAc-T酶家族可分为两个亚家族，一个包括
ppGalNAc-T8、-T9、-T17和 -T18，该亚家族基因
仅存在于脊椎动物中；其余 ppGalNAc-T则组成另
一个亚家族，其在非脊椎动物和脊椎动物中均有表
达。氨基酸序列比对显示，Gal/GalNAc-T基序中高
度保守的 DX5WGGENXE序列在 ppGalNAc-T8、-
T9、-T17和 -T18中突变为 LX5YGGENXE。研究表
明，DX5WGGENXE序列在所有 ppGalNAc-T中保
守 [41]，且其中的WGGE序列在 β-1,4-半乳糖转移
酶 [47-48]以及 β4半乳糖转移酶中也保守存在 [35]。
这说明WGGE序列是半乳糖 /半乳糖酰胺转移酶
家族的标志性序列，在酶与底物的相互作用中起
着至关重要的作用 [34-36]。根据这段序列，我们将
ppGalNAc-T8、-T9、-T17及 -T18命名为 Y亚家族；
相应的，其他 ppGalNAc-T命名为W亚家族。除
WGGE box外，Y亚家族成员在其他几个保守位点
也发生了突变。有趣的是，ppGalNAc-T8、-T9、-T17
和 -T18在体外均未表现出经典的 GalNAc糖基转移
酶活性。
王　静，等：O-糖基化起始糖基转移酶的活性与结构研究第7期 627
了明显改变，从而不能与供体底物 UDP-GalNAc进
行有效的结合。这 3个氨基酸残基在所有 Y亚家族
酶中均发生了保守的突变，提示 Y亚家族成员可能
因为关键位点的氨基酸突变导致酶与供体底物
UDP-GalNAc作用位点的空间构象改变，从而导致
其酶活丧失。这也充分体现了酶活与结构之间的密
切关系。
5　结语
ppGalNAc-T是催化黏蛋白型 O-糖基化修饰起
始的糖基转移酶，其以 UDP-GalNAc为供体底物，
以黏蛋白为受体底物，催化 GalNAc结合到黏蛋白
的 Ser或 Thr上，形成 Tn抗原。复杂的 O-糖结构
则在此基础上进一步延伸形成。因此，ppGalNAc-T
酶家族在蛋白质的 O-糖基化修饰过程中发挥着举
足轻重的作用。近年来，为研究 ppGalNAc-T催化
活性的调节机制，研究者主要通过特定氨基酸位点
突变和晶体结构解析来探讨酶结构与活性间的关
系。目前晶体结构解析的主要研究对象为酶单结晶
或酶与底物的共结晶，对与底物结合前后的酶结构
并未进行比较研究。未来的研究将致力于同时获得
ppGalNAc-T的单结晶以及 ppGalNAc-T与其底物的
共结晶并进行比较，分析底物结合前后酶的构象
变化。这样将有助于更直观地展现 ppGalNAc-T结
构变化与催化活性间的关系。此外，对 Y亚家族
ppGalNAc-T的晶体结构分析将有利于对其功能的
理解。
[参　考　文　献]
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图中显示可与UDP-GalNAc相互作用的氨基酸残基。保守残基以灰色表示，在T18中发生突变的残基以绿色表示，相对应的
残基在T10中以紫色表示。DUP和GalNAc以橙色碳骨架表示。黄色虚线表示氢键。红色箭头指示空间构象发生显著改变的氨
基酸残基。
图6 ppGalNAc-T18与-T10的UDP-GalNAc相互作用位点比较
本课题组以 ppGalNAc-T10 为模板模拟 pp-
GalNAc-T18的立体结构 (图 6)。通过比较 ppGalNAc-T10
和 -T18的晶体结构，发现 ppGalNAc-T18的 Gln228、
Cyc333和WGGE box中的 Tyr354在空间构象上发生
生命科学 第23卷628
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