全 文 ：第23卷 第9期
2011年9月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 23, No. 9
Sep., 2011
文章编号：1004-0374(2011)09-0860-09
生物元件的挖掘、改造与标准化
王钱福，严　兴，魏　维，张　磊，钱昌丽，周志华*
(中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，中科院合成生物学重点实验室，上海 200032)
摘　要：生物元件是合成生物学中的三大基本要素之一，是合成生物学的基石。现阶段，生物元件的挖掘、
鉴定和改造仍然是合成生物学领域的重要研究方向之一。合成生物学与基因工程和代谢工程最显著的差别
在于能够将大量的生物元件进行快速、随意的组装，而实现这一目标的前提是将生物元件标准化。目前，
已经有大量基因组被解析，通过这些基因组数据库的注释与功能验证，并借助于各种生物信息学软件预测
启动子、终止子、操纵子、转录因子和转录因子结合位点、核糖体结合位点以及蛋白质编码区等部件，为
合成生物学提供丰富的生物元件信息资源。随着元基因组技术的兴起，大量未培养微生物中的基因和基因
簇信息被解析，使得我们可以从占自然界中实际存在微生物总数 99％的未知微生物中挖掘更多的生物元件。
另外，生物元件可以从自然界分离出来，也可以对天然生物元件进行修饰、重组和改造后得到新的元件。
酵母是异源蛋白表达的通用宿主和生物基产品生产的细胞工厂，但其本身可用的启动子非常有限，近年来
各国学者在酵母启动子改造和文库构建方面做了很多工作，该文也将概述酵母启动子改造和在合成生物生
物学研究领域中的应用方面的研究进展。
关键词：合成生物学；生物元件；基因组；元基因组；启动子； 文库构建
中图分类号：O621.33; Q812 文献标志码：A
Screening, modification and standardization of biological
parts for synthesis biology
WANG Qian-Fu, YAN Xing, WEI Wei, ZHANG Lei, QIAN Chang-Li, ZHOU Zhi-Hua*
(Key Laboratory of Synthetic Biology, Institute of Plant Physiologyl and Ecology, Shanghai Institutes for Biological
Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China)
Abstract: Biological part is the foundation for synthetic biology. Seeking, defining and modifying of new biological
parts are attracting common attentions. The most significant difference between synthetic biology and genetic
engineering or metabolic engineering must be that the interchangeable biological parts are used and assembled
quickly in synthetic biology, which had better to be standardized previously. With more and more genomes of
different organisms being sequenced, parts such as promoters, terminators, operons, transcriptional factors and
transcriptional factor binding sites, ribosome binding sites and protein encoding regions could be annotated by
different bioinformatics tools. Owing to the development of metagenomic technology, vast information about the
genes and gene clusters of the remaining 99% uncultured microorganisms in nature were explored and a lot of new
biological parts could be mined from natural resources directly. Of course, the biological part originated from nature
need be modified, reconstructed and improved before it shows highly compatible in a synthetic module or biological
system. Saccharomyces cerevisiae was widely used as the general host for heterologous proteins expression as well
as cell factory for producing biobased products. However, only a few promoters could be applied in S. cerevisiae.
收稿日期：2011-05-23； 修回日期：2011-06-08
基金项目：中科院生命科学基础前沿研究所专项(KSCX2-EW-J-12)
*通信作者：E-mail: zhzhou01@sibs.ac.cn
王钱福，等：生物元件的挖掘、改造与标准化第9期 861
合成生物学是按照一定的规律和已有的信息设
计和构建新的生物元件、装置和系统，或者重新设
计已有的天然生物系统 (http://syntheticbiology.
org/)。合成生物学的核心在于设计、改造、重建或
制造生物元件、生物反应系统、代谢途径与过程，
乃至创造具有生命活动能力的细胞和生物个体，为
生命起源、生物进化、复杂疾病、干细胞等生物学
难题的研究开拓新的蹊径，为解决人类发展在环境、
资源、能源等方面面临的若干重大挑战提供新技术
与方法 [1]。合成生物学旨在将工程原理应用到生物
系统来改变生物技术 [2]。在短短不到十年的时间里，
合成生物学领域已经产生了很多技术应用，为药品
生产 [3-4]、生物基产品的生产 [5]和基因治疗 [6-7]提供
了新的途径。除此之外，合成生物学在替代能源生
产方面也展现出巨大的应用潜力 [8]。
生物元件、装置和系统是合成生物学的三大基
本要素。生物元件是指遗传系统中最简单、最基本
的生物积块 (BioBrick)，是具有特定功能的氨基酸
或者核苷酸序列，可以在更大规模的设计中与其他
元件进一步组合成具有特定生物学功能的生物学装
置 (Device)[9-10]。早在 2003年，美国麻省理工大学
相关合成生物学实验室就成立了标准生物元件登记
库 (Registry of Standard Biological Parts)(http://
partsregistry.org/)，专门收集各种满足标准化条件
的生物元件。全世界的科学家都可以提交自己设计
的模块供其他人获取，以便设计更加复杂的系统。
目前标准生物元件登记库有 15 000多个生物元件
BioBrick(http://partsregistry.org/cgi/partsdb/Statistics.
cgi)，既包括启动子、转录单元、质粒骨架、接合
转移元件、转座子、蛋白质编码区等 DNA序列，
也包括核糖体绑定位点和终止子等 RNA序列以及
蛋白质结构域。标准生物元件登记库中，每一个生
物学元件 , 例如启动子、核糖体结合位点 (RBS)都
以载体形式保存 [11]。
虽然有越来越多的生物元件被发现，但很多生
物元件都没有详细定性，标准生物元件库中的元件
大部分都是 iGEM参赛者提供的，其中很多生物元
件都没有经过系统的定性，也无法保证品质。生物
元件的性能会随不同的底盘细胞类型，或者不同的
实验室条件而改变，而不是总表现相同的功能，发
挥功能的时间也不总是相同的 [12]。2010年 12月 12
日在夏威夷举行的生物技术工业组织环太平洋地区
会议上，合成生物学工程研究中心的创建人 Drew
Endy和 Vivek Mutalik发起了国际发展生物技术开
放基金，由美国国家自然基金 (NSF)、劳伦斯伯克
利国家实验室 (LBNL)和生物砖基金 (BBF)联合支
持，用于开发新的生物元件并对已经存在的元件进
行详细定性描述。Drew Endy、Vivek Mutalik以及
生物砖基金的执行主席 Holly Million强调该开放基
金的目的是开发上千个可免费使用的标准 DNA元
件，推动合成生物学的研究进程，缩短研发周期并
降低研发成本。
为了使合成物生物学像其他工程学设计那样，
可以在电脑帮助的模拟设计下构建新的生物系统，
英国学者 Cooling等 [13]创建了一个标准虚拟生物元
件库 (SVPs)，为合成生物学提供模块化建模元件库。
最近华盛顿大学的研究者又创建了一个标准生物元
件知识库 (SBPkb)，用于查询和检索生物元件用于
合成生物学研究和应用 [14]。SBPkb将标准生物元件
知识库中所有元件的信息转换成可以利用合成生物
学元件语义框架进行运算的信息。该框架称作为合
成生物学公开语言语义 (SBOL-semantic)，是合成
生物学公开语言的一部分，用于描述通用的合成生
物学实体，其目的是提高所有生物元件的分散和交
换。
与自然界中巨大的生物元件资源相比，MIT标
准生物学元件登记库中的现有库存仅仅是沧海一
粟。现阶段如何鉴定与建立更多的可通用型生物元
件依然是合成生物学的重要任务 [15-16]。生物元件可
以从自然界分离出来，也可以对天然生物元件进行
修饰、重组和改造后得到新的元件。
1　基因组信息中挖掘生物元件
生物元件主要来源于自然界，因此从自然界中
分离是获得生物元件的主要途径之一。在大规模基
因组测序前，从自然界中分离生物元件主要是运用
Many efforts to modify promoters and establish promoter mutant libraries for S. cerevisiae have been tried recently.
A brief introduction of studies on promoter evolution of S. cerevisiae and its application in synthetic biological field
are also included in this manuscript.
Key words: synthetic biology; biological parts; genome; metagenome; promoter; library construction
生命科学 第23卷862
传统的分子克隆方法或基于保守序列的 PCR方法。
随着越来越多的基因组信息得到解析，可以通过生
物信息学预测直接从基因组中得到各种生物元件。
目前已有超过 1 000个微生物的全基因组得到了分
析，对这些基因组数据库的注释与功能验证将为合
成生物学提供丰富的生物元件信息资源。
通过对基因组中的功能蛋白、转录和翻译特征
序列分析，可以得到丰富的启动子、核糖体结合位
点、蛋白质编码序列以及终止子等生物元件资源。
利用基因组信息，结合各种生物信息学软件和在线
网站可以预测各种生物元件，并对元件信息进行详
细分析。利用 FPROM可从人类基因组预测启动子
序列，TSSG和 TSSW可预测人的 PolII启动子区
域和转录开始位点 [17-19]。TSSP可预测植物启动子
序列 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&
group=programs&subgroup=promoter)。PromH(G)、
PromH(W)和 Promoter2.0软件可从真核基因组预测
启动子序列 [20-21]。SCOPE可以预测部分原核生物
和真核生物的调控 DNA基序，该方法利用 BEAM、
PRISM和 SPACER三种程序分别预测非退化基序、
退化基序和两者都有的基序 [22-26]。BPROM(http://
www.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=
programs&subgroup=gfindb)可预测原核生物的启动
子序列。同样多个软件可从基因组信息预测终止子
序列，如通过 TransTermHP可预测原核生物的终止
子 [27-28]。最新建立的WebGesTer DB 是目前已知的
最大的转录终止子资料库，其中包括来源于 1 060
个细菌基因组序列和 798个质粒序列信息的百万个
终止子 [29]。RibEx可预测终止子和一些细菌中保守
的转录调控序列 [30]。RNA序列家族信息可通过
Rfam信息库 [31]，tRNAs和 snoRNAs信息可通过
tRNAscan-SE、snoscan 和 snoGPS 进 行 查 找 [32]。
BDB是一个预测序列特异性 DNA结合转录因子的
数据库，可从已经公布的 929个完整基因组序列预
测其中的转录因子 [33]。TFSEARCH可预测真核生
物转录因子结合位点 (http://www.cbrc.jp/research/db/
TFSEARCH.html)，Tfsitescan(http://www.ifti.org/cgi-
bin/ifti/Tfsitescan.pl)和 TESS(http://www. cbil. upenn.
edu/cgi-bin/tess/tess)可预测原核和真核生物转录因
子结合位点。rVISTA 2.0是一个比较分析非编码序
列调控潜力的工具，它整合了转录因子预测、序列
比对和聚类分析，用于确认进化上保守和出现在基
因组序列中特定分子构型中的非编码 DNA区域序
列 [34]。利用 operonHMM方法可在没有实验数据的
情况下预测细菌基因组中的操纵子模型 [35]。可利用
神经网络预测大肠杆菌和其他生物的核糖体结合位
点 [36-37]。蛋白质结构域可通过多种方法进行预测，
可从已有的基因组资源挖掘更多的具有特定功能的
新结构域。Pfam是一个庞大的蛋白质家族和结构
域数据库 [38]，最新版本 (25.0)中收集了 12 273个
蛋白家族信息。Smart 是一个确认和注释蛋白质结
构域的重要在线工具 [39]，最新的版本中已经收集了
886个蛋白质结构域信息。
2　利用元基因组技术挖掘生物元件
随着微生物分子生态学技术的发展，使人们认
识到自然界中的大部分微生物是不可培养的，可培
养的微生物仅占自然界中实际存在微生物的 1％，
这些未培养微生物中必然蕴藏着巨大的生物元件资
源。近年来发展起来的元基因组研究技术，可以让
我们走出纯培养微生物的局限，从自然界，特别是
极端环境中获得更丰富的生物资源，包括合成生物
学所需要的各种生物元件。利用元基因组技术，一
方面通过测序可以得到未培养生物中的基因信息，
获得许多未知的生物元件信息；另外一方面可以通
过功能筛选，得到许多具有各种用途的功能基因。
21世纪以来，元基因组学的研究越来越受到
关注，不断有新的报道。应用 DNA 序列导向和功
能导向的元基因组筛选方法，可以筛选并鉴定具有
某种功能的新基因或基因簇，是获得功能蛋白生物
元件的重要途径。如对河底沉积物的富集培养物元
基因组测序后，从中找到了以 NO2为电子受体来
氧化甲烷的新代谢途径 [40]。目前各国科学家利用
元基因组技术，从未培养生物中分离到许多有重要
工业应用价值的酶基因，如酯酶基因 [41-43]、脂肪酶
基因 [44-45]、蛋白酶基因 [41,46]以及从冰川冰的元基因
组文库中筛选到 DNA聚合酶 I 基因 [47]。同时，随
着单细胞全基因组扩增技术和流式细胞仪分选技术
的日益成熟，已经可以利用单细胞扩增和分析未培
养微生物的基因组 [48-49]。从这些未培养微生物的元
基因组，我们可以挖掘到大量新的生物元件。
近年来随着化石原料的不断枯竭以及工业原料
与粮食争地矛盾的凸显，新一代工业生物技术将逐
步以木质纤维素类生物质代替淀粉、糖类等粮食类
生物质和化石原料。因此，与木质纤维素利用和炼
制密切相关的纤维素酶受到普遍关注 [50]。而纤维素
酶在生产生物燃料应用方面的研究也是各国生物技
术领域研究的热点，其对关键技术的解决更是全球
王钱福，等：生物元件的挖掘、改造与标准化第9期 863
生物技术领域知识产权争夺的重要制高点。美国能
源部 (DOE)为了寻求解决环境修复、再生能源及气
候变化等问题的途径和策略，率先启动了“Genome
To Life”计划，并完成了对极端酸性条件下生物膜
中微生物 [51]、海洋微生物 [52]和白蚁肠道微生物 [53]
的元基因组测序工作。目前各国学者已经从厌氧
高温木头堆 [54]、盐湖和火山口湖床沉淀物 [55]、土
壤 [56,57]、牛瘤胃 [58]、兔子盲肠 [59]等各种生境通过
元基因组测序和筛选得到许多纤维素基因。尤其牛
瘤胃作为一个高效的纤维素酶降解系统，对该系统
中微生物群落的元基因组解析发现大量的糖基水解
酶基因，大大增加了 CAZy数据库中纤维素酶基因
的数量 [60-61]。我们中科院合成生物学重点实验室也
以具有高效降解纤维素的厌氧沼液系统和白蚁肠道
为基质，建立了元基因组文库，从中分离到很多与
木质纤维素降解相关的新酶基因 [62]。
3　生物元件的改造及其在合成生物学中的应用
生物元件可以从自然界分离出来，也可以被修
饰、重组和改造后得到新的生物元件。启动子是专
一地与 RNA聚合酶结合并决定转录开始位置的元
件，控制基因转录的起始时间和表达程度。启动子
是合成生物学中一个非常重要的调控元件，各种遗
传线路 [63]、基因开关 [64]、基因振荡 [65]和细胞群体
系统脉冲发生器 [66]等功能的发挥大都是需要通过
启动子的调控来实现的。
最近，台湾学者创建了一个集成的酿酒酵母启
动子特性知识库，称作酵母启动子图谱 (YPA)。
YPA整合了启动子的九种特性，包括启动子序列、
转录起始位点、3和 5非编码区、TATA框、转录
因子结合位点、核小体占用率、DNA弯曲性、转
录因子结合、转录因子敲除表达和转录因子之间相
互作用。酵母启动子图谱设计利用联合方式呈现其
资料，即仅当对启动子的各种特性进行综合考虑时
才能揭示许多重要的观察值。例如，刚性 DNA能
阻止被核小体包裹，从而使得转录因子更易接近刚
性 DNA区域的转录因子结合位点。结合核小体占用
率、DNA弯曲性、转录因子结合、转录因子敲除表
达和转录因子结合位点等资料，可以帮助我们确定
其中真正发挥功能的转录因子结合位点。在酵母启
动子图谱中，各种启动子特性被整合进一个集中的、
有组织的平台中。研究者可以方便地观察其感兴趣
的转录因子结合位点是否被核小体占有或者位于刚
性 DNA区域，也可以知道下游基因的表达是否响应
相关转录因子的敲除。跟其他酵母启动子资料库相
比，酵母启动子图谱不仅仅集合了转录因子结合位
点，而且结合了许多其他启动子特性，这些信息将
对生物学家研究基因的转录调控有帮助 [67]。
对基因功能的研究往往需要通过改变基因的表
达水平来考察不同表达水平下产生的结果。原则上，
目的基因可以通过特定调控实现连续不同的表达
水平。传统的方法中，对基因功能的研究是在两
个极端的状态：基因敲除和高表达。但是，基因
功能在代谢优化和控制分析方面的研究需要基因
表达呈现一种连续的、增量微小的表达水平，这
就需要基因在一系列连续的强弱不同的启动子调
控下表达 [68]。而作为通用蛋白表达宿主和合成生物
学中的细胞工厂的酵母，其本身可用的启动子极其
有限，因此需要对现有的启动子进行改造和人工合
成新的启动子。随着蛋白定向改造技术的日益成熟，
可以将蛋白定向改造技术引入到酵母启动子的改造
中。通过定向改造技术，建立包括各种不同强度启
动子的文库，是实现基因精确调控的有利遗传工具。
目前，已经对毕赤酵母和酿酒酵母中的启动子进行
了改造，通过构建启动子文库，得到了一系列不同
强度的启动子元件。
3.1　毕赤酵母中启动子改造和文库构建
醇氧化酶启动子 (AOX1)是毕赤酵母中最强的
诱导型启动子，Hartner 通过敲除和复制启动子
AOX1中可能的转录因子结合位点建立了由 46个
AOX1突变子组成的启动子文库，得到了一系列强
度不同的启动子，其活性范围为野生型启动子活性
的 6%到 160%。另外，研究表明至少有 12个顺式
调控元件与 AOX1启动的高水平表达有关，Hartner
等 [69] 基于敲除分析，通过在启动子基本元件上结
合顺式调控元件构建了由新的、短的人工突变启动
子组成的文库。利用新合成的 AOX1突变启动子，
不仅提高了异源蛋白的产量和质量，而且将作为一
个基本的工具盒，用于在代谢工程中精细调控基因
表达和在合成生物学中顺序诱导蛋白表达。
Qin等 [70]利用易错 PCR技术，对组成型启动
子 GAP进行突变，利用荧光蛋白作为标记，创建
了一个由 33个突变子组成的，具有功能的启动子
文库。相对于 GAP来说，33个突变子的活性范围
是野生型的 0.6%~19.6倍，并呈现由高到底的线性
化分布。为了证实该文库更广泛的适用性，利用 β-
半乳糖苷酶和蛋氨酸腺苷转移酶 (MAT)基因作为报
告基因，研究了启动子强度对基因在转录水平和蛋
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白表达水平上的影响。通过研究异源蛋氨酸腺苷转
移酶基因表达水平对细胞生长和 S-腺苷甲硫氨酸
(SAM)产生的影响来考察启动子文库的实用性。依
靠文库中启动子强度的宽泛性，通过确定最适的蛋
氨酸腺苷转移酶活性来获得最大的 S-腺苷甲硫氨
酸产量。可以利用启动子文库实现基因表达的精确
调控以及定量评估基因表达水平与生理学参数的相
关性。
3.2　酿酒酵母中启动子改造和文库构建
过去研究特定基因表达对表型和代谢流的影
响，采用的传统方法是通过对野生型基因、敲除
和高表达三种条件下的变化情况来研究的。但是，
基因的高表达或完全敲除往往不能完全反应某种
表型或合成途径的真实信息，期望的表型通常需
要基因的适度表达而不是高拷贝表达，基于这种
方法的基因功能研究是不完整的 [71-74]。通过调节
目的基因在一个宽的范围内的连续不同的表达水
平，才能实现酿酒酵母中基因表达的精确调控。
很多方法可以实现目的基因的梯度表达，如利用
各种不同强度的天然启动子和拷贝数不同的质粒
调控基因表达水平 [72,75]以及通过改变诱导物的浓
度来调控诱导型启动子调控下基因的表达水平等 [76]，
但这些方法都有其局限性。近年来，利用基于定向
进化和基因改组的蛋白工程技术 [77-78]，人工构建了
包括不同强度启动子的文库，从而实现基因在一个
宽的范围内的调控。
Alper等 [79]首先构建了噬菌体 PL-λ启动的突
变文库，在保证在单细胞水平均一性的情况下，以
GFP为报告基因研究了启动子强度对荧光产生水平
的影响，表明启动子强度的增加和荧光强度的增强
之间呈线性关系；进一步利用 RT-PCR从转录水平
考察了启动子强度对 GFP基因转录的影响，表明
启动子在转录水平调控 GFP基因的表达；另外，以
cat为报告基因，根据对氯霉素的抗性研究表明，
随着启动子强度的增加，菌株对氯霉素的抗性也增
强。该研究从三个角度评估了启动子对基因表达的
影响，并显示了启动子文库宽的调控范围和 PL-λ 调
控不依赖于下游基因的组成型特性。将这些启动子
整合到染色体中，可以进行遗传控制的精确定量评
估。利用该启动子文库评估磷酸烯醇式丙酮酸羧化
酶表达水平对生物量的影响，表明最大生物量的产
生需要最适的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶表达水平，
随着启动子强度的增加，生物量达到一个最高值，
但当强度继续增加时，会产生负面影响，生物量会
降低；同样，以脱氧木酮糖磷酸合成酶为目的基因，
研究其表达水平对番茄红素产生的影响时也表明最
大量番茄红素的产生需要最适的脱氧木酮糖磷酸合
成酶表达水平。表明利用文库中不同强度的启动子，
确定基因的最佳表达水平，从而得到最期望的表型。
但是，在工程化的产番茄红素菌株中，番茄红素产
量与脱氧木酮糖磷酸合成酶表达水平成线性增长关
系，脱氧木酮糖磷酸合成酶是其限速步骤，表明启
动子调控的基因型－表型关系跟菌株的遗传背景相
关 [79]。为了拓宽利用该方法在其他研究领域的应用，
他们也对酿酒酵母的 TEF1启动子利用易错 PCR方
法进行改造，建立了突变启动子库，得到了一系列
强度不同的突变启动子。在此基础上，Nevoigt等 [74]
进一步对 TEF1突变库的 11个启动子特性进行了研
究。研究表明，突变启动子的活性是野生型活性的
8％ ~120％；11个突变启动子控制的报告基因的表
达水平差异与碳源的利用无关， RT-PCR证实这些
差异是由转录水平的变化引起的，而这种变化是由
启动子强度的变化产生的。除了 CEN/ARS型质粒
的启动子库外，他们也创建了启动子置换盒库，能
使其下游的酵母基因整合到基因组中，通过基因表
达水平观察其详细的基因型－表型关系。为了阐述
这个方法的适用性，分别用 TEF1突变库中五个不
同强度的启动子替代了酿酒酵母的 GPD1启动子，
用于分析甘油 3磷酸脱氢酶活性对甘油产量和生物
量的影响。表明在甘油 3磷酸脱氢酶的活性是野生
型的两倍的范围内，甘油 3磷酸脱氢酶的表达水平
是酿酒酵母中甘油产生的限速步骤，在此范围内甘
油的产量随着甘油3磷酸脱氢酶活性的增加而增加；
而且表明，在一个适度范围内高表达甘油 3磷酸脱
氢酶将不会降低生物量。
除了基因的组成型表达以外，建立一个易于控
制、可进行条件诱导或抑制的基因表达系统是基础
研究和工业规模生物技术应用的必不可少的工具。
然而，诱导剂的毒性、昂贵的价格和诱导剂介导的
多效性影响等特点限制了这些诱导型启动子的应
用。通过启动子的改造，得到具有特定调节特性的
适配化启动子将使进行基因表达的复杂调控成为可
能。德国学者应用随机突变和多级流式细胞筛选，
分离酿酒酵母氧响应性启动子 DAN1的突变子。分
离到两个与野生型启动子相比，在非严格厌氧条件
下可诱导的突变子，这可通过在细胞生长过程中氧
气的消耗而实现。这使得酵母发酵中基因表达的诱
导可仅仅通过细胞生长过程中氧气的消耗而完成。
王钱福，等：生物元件的挖掘、改造与标准化第9期 865
而且，无论是在严格厌氧还是微厌氧环境下，工程
化的启动子的最大表达量远远高于未突变 DAN1启
动子的表达量 [80]。
利用模块化的组件构建具有可预测行为的工程
化基因网络是合成生物学的主要目标之一 [81-82]。然
而，由于缺乏合适的组件和构建网络通常需要大量
反复测试工作，使得构建预期功能的基因网络受到
阻碍。美国波士顿大学学者发表了一种利用启动子
文库结合杂交模型用于指导预测酿酒酵母基因网络
构建的方法。利用芯片模型耦合了由多元化组件组
成的文库，这些多元化组件是通过随机非必需序列
合成的。他们在酿酒酵母中合成了调节启动子文库，
并利用该文库构建具有各种预期输入输出特性的前
馈环网络，通过该研究证实了上述方法的有效性。
为了拓宽该方法的应用范围，他们合成了一个具有
计时器功能的基因网络，并可通过组件的选择进行
更改。运用该基因网络控制酵母沉淀的时间，表明
该设计的即插即用性质，可方便地应用到生物技术
产业中 [83]。
启动子文库不仅应用在基因的最适化表达中，
而且在基因网络的构建中发挥重大作用。利用蛋白
分子改造方法构建启动子文库是一种非常重要的遗
传改造工具，已经广泛应用于代谢工程、功能基因
组学、合成生物学和各种生物技术研究中。
3.3　生物元件的标准化与组装
合成生物学对生物元件的组装提出了很高的要
求，需要建立能够对大量生物元件进行组装的方便、
快捷的方法，最终目标是实现生物元件组装的自动
化。实现这一目标的前提之一是将生物元件标准化。
标准化元件在机械、电子和计算机工程等工业领域
早有广泛的应用。由于标准化元件的应用，使得不
同功能的元器件和不同公司的产品能够方便地集
成，从而使工业界能够生产出复杂而可靠的产品 [14]。
与此类似，标准化生物元件的使用可以让不同实验
室构建的标准生物元件都按照相同的规则进行组
装，从而可以避免大量的重复劳动，从而缩短合成
复杂的生物装置或者生命系统所需的时间。他们将
这些标准化元件以及由它们相互连接所组成的标准
生物模块称为“生物积块”(BioBrick)。
美国麻省理工大学标准生物元件登记库
(Registry of Standard Biological Parts)已在生物元件
的标准化方面开展了许多基础研究，包括建立新载
体体系和对生物元件进行标准化处理，在生物元件
两端接上统一的“接口”，这些标准化元件以及由
它们相互连接所组成的标准生物模块被称为“生物
积块”(BioBrick)。MIT的生物元件 (BioBrick)的组
装方法包括标准组装和分层组装 (Layered assembly)
两种方法 [84]。标准组装方法主要利用限制性内切酶
酶切和连接：每个标准生物元件的两端都含有 2个
规定的酶切位点，通常是 EcoRI和 XbaI酶切位点
作为序列的前缀，SpeI和 PstI酶切位点作为序列的
后缀。经过这些同尾酶酶切后产生的黏性末端，可
以让两个不同的标准元件进行连接，连接后产生的
新元件的两端也具有标准生物元件所要求具备的酶
切位点。分层组装主要利用 gateway技术产生带有
生物元件的组装载体，再利用 2ab技术将两个带有
不同生物元件的组装载体进行组装 (http://2008.
igem.org/Team: UC_Berkeley / Layered Assembly)。
以上两种组装方法产生的拼接产物本身也符合标准
生物元件的要求，也属于标准生物元件，所以可以
按照相同的方法与其他的标准元件再次进行连接，
然后分阶段，逐次完成对目标序列的拼接。
以上两种组装方法，因为每次都只组装两种元
件，因此称为二元组装法 (binary assembly)。除了
上述的两种方法之外，二元组装法还包括其他一些
方法 [85-87]，但是并不直接利用 BioBrick进行组装。
除了二元组装法，还有多元组装的方法，目前主要
是利用酵母菌同源重组的功能，将多个生物元件进
行一次性体内拼装，合成含有多个基因的代谢途径，
例如 DNA assembler等方法 [88]。Gibson等 [89]利用
类似的方法，在酵母菌内已经成功合成了生殖支原
体的基因组。除了体内重组外，SLIC是一种不依
赖于序列和连接反应的克隆方法，可利用同源重组
通过一个反应实现多个 DNA片段在体外的有效重
组 [90]。
随着合成生物学的发展，具有相似功能的生物
元件会越来越多，那么如何对这些元件进行挑选，
以达到系统或者装置的设计目标，这是一个非常重
要的问题。一般方法是利用这些元件分别合成目标
序列，然后来比较它们的功能。但是，在目前的条
件下，元件的数量越来越多，合成的步骤也越来越
复杂，往往不可能针对所有候选元件进行实验。因
此，利用计算机辅助设计 (computer-aided design,
CAD)来帮助生物元件的选择，这已成为合成生物
学一个重要的研究方向。Ellis等 [83]就是通过构建
数学模型，然后根据计算结果来选择适当强度的启
动子，从而合成了所需的基因回路，达到了预期的
实验目标。目前，已经有一些计算机软件来帮助建
生命科学 第23卷866
立数学模型，然后根据生物元件的生物学数据 (动
力学参数和启动子强度等 )来预测合成的系统是否
符合设计的目标，从而帮助生物元件的选择，计算
机辅助设计大大加快了合成生物学的研究速度 [91-96]。
随着合成生物学的发展，需要合成的目标序列
包括的元件数量越来越多，序列也越来越长，因此
需要对目标序列的合成途径进行优化，以减少合成
的时间、降低合成的成本。Densmore等 [84]开发的
算法可以高效地利用元件库中已经存在的元件，以
及目标序列中间的重复序列和多个目标序列之间存
在的共有序列，从而优化单个目标序列或者多个目
标序列 (之间存在共有序列 )的合成途径，大幅减
少合成过程中所需要的阶段和步骤，从而加快合成
的速度和降低合成的成本。
[参　考　文　献]
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