全 文 ：第 １４卷第 ４期
２０１６年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ． ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０４􀆰 ００１
收稿日期：２０１６－０１－０９
基金项目：江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１３１４２６）；江苏省高校自然科学研究重大项目（１４ＫＪＡ２２０００３）；江苏省重点研发计划项目（ＢＦ２０１５００７）
作者简介：李　 鑫（１９７５—），男，辽宁大连人，博士，副教授，研究方向：木质纤维原料生物利用，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｌｉ＠ ｎｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
米根霉两段式利用板栗栗苞生产富马酸
李　 鑫１，２，３，周　 瑾３，虞　 慧３，欧阳水平３
（１． 南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 ２１００３７；
２． 南京林业大学 林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，江苏 南京 ２１００３７；
３． 南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 ２１００３７）
摘　 要：通过自水解预处理板栗栗苞，以预水解液组成增殖培养基培养米根霉，增殖的米根霉再利用栗苞酶解液生
产富马酸。 结果表明：２２０ ℃自水解预处理栗苞，有效疏解栗苞紧密的木质纤维结构，以 ５０ ＦＰＩＵ（以 １ ｇ纤维素计）
纤维素酶水解 ５０ ｇ ／ Ｌ预处理栗苞，酶解得率大于 ９５％；经增殖培养基培养米根霉，菌体生物量达 ４􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ；增殖的米
根霉利用栗苞酶解液发酵产富马酸，富马酸质量浓度为 １５􀆰 ７８ ｇ ／ Ｌ，糖酸转化率为 ０􀆰 ３４ ｇ ／ ｇ。 通过两段式发酵工艺，
米根霉有效利用板栗栗苞生产富马酸。
关键词：板栗栗苞；自水解预处理；米根霉；两段式发酵；富马酸
中图分类号：ＴＱ３５３􀆰 ６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０４－０００１－０４
Ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｕｔｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ⁃ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｈｅｓｔｎｕｔ
ｓｈｅｌｌ ｂｙ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｉｎ ａ ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ＬＩ Ｘｉｎ１，２，３，ＺＨＯＵ Ｊｉｎ３，ＹＵ Ｈｕｉ３，ＯＵＹＡＮＧ Ｓｈｕｉｐｉｎｇ３
（１． Ｊｉａｎｇｓｕ Ｃｏ⁃Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００３７，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００３７，Ｃｈｉｎａ； ３． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｕｔｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ⁃ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｓｈｅｌｌ ｂｙ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｏｒｙｚａｅ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ａ ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ａｕｔｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｓｈｅｌｌ
ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ａｔ ２２０ ℃ ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｓｈｅｌｌ ｗａｓ ｏｖｅｒ ９５％
ｂａｓｅｄ ｏｎ ５０ ｇ ／ Ｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ５０ ＦＰＩＵ ／ ｇ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ． Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｃｏｕｌｄ
ｇｒｏｗ ａｎｄ ｏｂｔａｉｎ ４􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ ｆｕｎｇａｌ ｂｉｏｍａｓｓ ｉｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｘｙｌｏｓｅ．Ｐｒｅ⁃ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
ｏｒｙｚａｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｈｅｓｔｎｕｔ
ｓｈｅｌｌ． Ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｏｆ １５􀆰 ７８ ｇ ／ Ｌ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ９６ ｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ０􀆰 ３４ ｇ ／ ｇ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｓｈｅｌｌ； ａｕｔｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ； Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ； ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ
　 　 富马酸作为一种四碳有机羧酸（又名反丁烯二
酸），广泛应用于食品、医药、化工等领域［１］。 富马酸
的酸性是柠檬酸的 １􀆰 ５倍，可作为食品酸味剂和添加
剂［２－３］。 同时，富马酸因含有双键和两个羧基，可进
行聚合反应，合成生物可降解材料，因此美国能源部
认定其是 １２种最具潜力的平台有机化合物之一［３－４］。
利用可再生的生物质资源生产化学品，是当前
科学界和工业界研究的热点领域。 米根霉是富马
酸优良的生产菌种之一［３］，可利用葡萄糖、糖蜜、淀
粉、木材、玉米芯、玉米秸秆等原料生物合成富马
酸［１－２］。 因木质纤维素类生物质具有非食用、资源
丰富和可再生等优点，可作为生产化学品和能源替
代品的潜在原料来源［３，５］。
木质纤维类生物质，由于其结构的复杂性，必
须经过适当的预处理，解除由纤维素、半纤维素和
木质素形成的天然屏障，才可由纤维素酶降解为可
发酵糖［６］。 自水解预处理方法是一种优良的木质
纤维原料预处理方法，以水作为唯一媒介，利用水
离子化产生的水合氢离子和半纤维素上脱落乙酰
基形成的乙酸为催化剂，在高温条件下，解聚半纤
维素为可溶性糖，破坏木质纤维素紧密结构，增加
纤维素酶对纤维素的可及性［７］。
我国河北、湖北、湖南、江苏、安徽等地广泛种
植的板栗，属壳斗科，是我国传统的农副产品，年产
超过 ４６ 万 ｔ，占世界总量的 ６０％以上［８］。 据统计，
每产 １００ ｋｇ 板栗，可产 ６０ ～ ９０ ｋｇ 干栗苞［９］。 由于
板栗产量的不断增加，导致采摘过程中产生栗苞
（针状外壳）等废弃生物质急剧增加。 栗苞除少量
用于栗苞壳炭和栗食用菌生产外，可被资源化利用
途径极少［１０］。 如能有效利用栗苞，将有助于推动板
栗加工业向深层次发展。
本文中，笔者先采用自水解预处理方法，疏解
栗苞紧密的木质纤维结构；预处理后，含木糖的液
体部分用于增殖米根霉，固体部分用于纤维素酶水
解获得可发酵糖。 最后，以米根霉为发酵菌种，拟
通过两段式发酵工艺，研究其利用板栗栗苞生产富
马酸的能力。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种和原料
米根霉（ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ） ＣＩＣＣ ４０３５１，保藏于
中国工业微生物菌种保藏中心（ＣＩＣＣ）。
板栗栗苞，来自江苏省宜兴市张渚镇。
纤维素酶（滤纸酶活为 １１７ ＦＰＩＵ ／ ｇ）、 β 葡萄
糖苷酶（酶活为 ３２３ ＩＵ ／ ｇ），Ｓｉｇｍａ公司。
１􀆰 ２　 自水解预处理过程
称取 ６０ ｇ绝干板栗栗苞于反应釜内，按固液比
１ ∶ １０（ｇ ／ Ｌ）加入去离子水，在 １８０ ～ ２２０ ℃条件下恒
温处理 ４０ ｍｉｎ。 预处理结束后，冷却至室温，固液分
离，收集滤液，即为预水解液；去离子水洗涤滤渣 ３
次。 水洗滤渣置于 ４ ℃条件下平衡水分 ４８ ｈ，测量
其中的水分含量，与预水解液一同 ４ ℃冷藏备用。
１􀆰 ３　 纤维素酶水解
称取一定量绝干预处理板栗栗苞于酶解瓶中，
加入柠檬酸缓冲液（ｐＨ ４􀆰 ８），使底物质量浓度为 ５０
ｇ ／ Ｌ，分别加入 ２０～６０ ＦＰＩＵ纤维素酶（以 １ ｇ纤维素
计）和 ２０ ＩＵ 葡萄糖苷酶（以 １ ｇ 纤维素计）。 在 ５０
℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ的条件下酶水解 ７２ ｈ。 酶水解后，酶
解液 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ，取上清液测定其中
的糖和抑制物含量。
１􀆰 ４　 培养基
斜面培养基（ｇ ／ Ｌ）： 酵母膏 ３􀆰 ０、麦芽浸膏 ３􀆰 ０、
琼脂 ２０􀆰 ０、蛋白胨 ５􀆰 ０、葡萄糖 １０􀆰 ０。
米根霉增殖培养基（ｇ ／ Ｌ）：栗苞预水解液、木糖
２６􀆰 ４、（ＮＨ４） ２ ＳＯ４ ４􀆰 ４、ＫＨ２ ＰＯ４ ０􀆰 ６、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ
０􀆰 ５、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０１７ ６、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０００ ４９８；
自然 ｐＨ。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：（以浓缩的栗苞纤维素酶水
解液为碳源）葡萄糖＞４０、（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ０􀆰 ７１、ＫＨ２ＰＯ４
０􀆰 ６、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５、ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０１、ＦｅＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０００ ４、ＣａＣＯ３ １０（单独灭菌）。
上述培养基均在 ０􀆰 １ ＭＰａ、１２１ ℃条件下灭菌
１５ ｍｉｎ。
１􀆰 ５　 培养方法
１􀆰 ５􀆰 １　 孢子悬液的制备
从 ４ ℃冰箱中取出保藏菌种，接种环挑取少量
孢子，接种于斜面，３０ ℃培养时间 ６ ～ ７ ｄ。 用 ５ ｍＬ
无菌水洗涤斜面 ３次，过滤得孢子悬液，再以无菌水
稀释至孢子密度为 １０７ 个 ／ ｍＬ。
１􀆰 ５􀆰 ２　 米根霉增殖培养
２５０ ｍＬ三角瓶加入 ５０ ｍＬ米根霉增殖培养基，
以 １０％（体积分数）的接种量移入孢子悬液，置于 ３５
℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ的条件下培养 ３６ ｈ。
１􀆰 ５􀆰 ３　 发酵培养
在 ２５０ ｍＬ的三角锥形瓶中装入 ５０ ｍＬ 发酵培
养基，接入适量的增殖米根霉，３５ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 的
条件下培养 ４～６ ｄ。
１􀆰 ６　 分析方法
水分含量测定：采用 ＦＤ ７２０ 型红外水分测定
仪测定。
孢子数量的确定：采用血球计数板计数。
米根霉菌体干质量的测定：培养结束后，过滤
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
回收米根霉菌体，去离子水洗涤菌体 ３ 次，６０ ℃烘
干至恒质量，称质量。
板栗栗苞木质素、纤维素及半纤维素含量分
析：采用文献［１１］中的相关方法。
检测样品制备：发酵结束，加入 ２５０ ｇ ／ Ｌ ＮａＯＨ
溶液，将发酵液 ｐＨ 调至偏碱，再加入 ３６０ ｇ ／ Ｌ 的
Ｈ２ＳＯ４将 ｐＨ调至 ７附近，将富马酸转化为易溶于水
的钠盐进行检测。 离心后，倒出上层清液待测。
葡萄糖、木糖、富马酸含量测定：采用 Ａｇｉｌｅｎｔ
１２００型高效液相色谱仪，Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７
糖柱，以 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ＳＯ４ 为流动相，流速为 ０􀆰 ６
ｍＬ ／ ｍｉｎ，柱温 ５５ ℃，示差折光检测器，进样量 １０ μＬ。
酶解得率计算见式（１）。
酶解得率 ＝ 葡萄糖质量
× ０􀆰 ９
底物中纤维素质量
× １００％ （１）
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 自水解预处理板栗栗苞
以板栗栗苞为木质纤维原料，采用自水解方法
预处理栗苞，研究温度对自水解预处理栗苞成分的
影响，结果如表 １所示。
表 １　 温度对自水解预处理栗苞的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ
ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｓｈｅｌｌ ｂｙ ａｕｔｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
自水解
温度 ／ ℃
ｗ （纤维素） ／
％
ｗ （半纤维素） ／
％
ｗ （木质素） ／
％
原料 ２０􀆰 ９４±０􀆰 ３３ １９􀆰 ４９±０􀆰 １９ ４３􀆰 １７±０􀆰 ３５
１８０ ２２􀆰 ７７±０􀆰 ０８ １５􀆰 １６±０􀆰 ０４ ４６􀆰 ５６±０􀆰 ０６
２００ ２５􀆰 ３４±０􀆰 ７９ ２􀆰 ９６±０􀆰 ０８ ５３􀆰 ２１±０􀆰 ２４
２２０ ３１􀆰 ４４±０􀆰 ４５ ２􀆰 ０５±０􀆰 ０１ ５９􀆰 ４６±０􀆰 ０２
从表 １ 中可以看出，栗苞原料中木质素含量较
高，明显高于玉米秸秆和稻秆中约 ２０％的木质素含
量；同时，纤维素和半纤维素含量合计约 ４０％，也低
于玉米秸秆和稻秆中约 ５０％～６０％的含量［１１－１２］。 随
着自水解预处理温度的增加，木质素含量呈现上升
趋势，当温度达到 ２２０ ℃ 时，木质素含量达到
５９􀆰 ４６％；纤维素含量也随温度的增加而增加到
３１􀆰 ４４％。 这是由于温度的升高，半纤维素水解程度
增加，当温度从 １８０ ℃升高至 ２２０ ℃，半纤维素含量
迅速降为 ２􀆰 ０５％，半纤维素降解率为 ９４􀆰 ６６％。 半
纤维素成分的损失，推高了纤维素与木质素的含
量。 同时，在 ２２０ ℃条件下自水解预处理，固形物回
收率可达 ５０􀆰 ７６％，预水解液中还原糖质量浓度为
４􀆰 ４２ ｇ ／ Ｌ，主要含有木糖和葡萄糖。 因此，选择温度
２２０ ℃用于自水解预处理栗苞。
２􀆰 ２　 纤维素酶水解预处理板栗栗苞
以自水解预处理的板栗栗苞为底物，分别添加
２０、３０、４０、５０及 ６０ ＦＰＩＵ（以 １ ｇ 纤维素计）的纤维
素酶，研究纤维素酶添加量对酶水解预处理栗苞的
影响，结果如图 １所示。
图 １　 纤维素酶添加量对酶解预处理板栗栗苞的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｓｈｅｌｌ
从图 １可以看出，纤维素酶添加量在 ２０～６０ ＦＰＩＵ
的范围内，随着纤维素酶添加量的升高，葡萄糖浓度和
酶解得率也随之增加。 当纤维素酶添加量超过 ５０
ＦＰＩＵ时，酶解得率大于 ９５％。 进一步增加纤维素酶添
加量，酶解得率只有小幅度增加。 较高的自水解预处
理温度，降解较多的半纤维素，疏解原料的紧密结构，
便于纤维素酶与底物结合，提高酶水解效果［１２］。
以 ５０ ＦＰＩＵ的纤维素酶添加量，水解 ５０ ｇ ／ Ｌ 的
预处理板栗栗苞，获得酶解液，并采用真空浓缩获
得浓缩的酶解液，成分如表 ２所示。
表 ２　 酶解液及浓缩酶解液的成分
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ
ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｆｒｏｍ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｓｈｅｌｌ
ｇ·Ｌ－１
水解产物 酶解液 浓缩的酶解液
ρ （葡萄糖） ９􀆰 ６３±０􀆰 ２７ ４５􀆰 ７１±０􀆰 ４２
ρ （纤维二糖） ０􀆰 ０７±０􀆰 ００ ０􀆰 ６８±０􀆰 ０３
ρ （木糖） ０􀆰 ２８±０􀆰 ０２ １􀆰 ４６±０􀆰 ０６
ρ （甲酸） ０􀆰 ０４１±０􀆰 ００６ ０􀆰 ０７８±０􀆰 ００７
ρ （乙酸） ０􀆰 ０６６±０􀆰 ００１ ０􀆰 １９±０􀆰 ０１
ρ （５ 羟甲基糠醛） ０􀆰 ０２７±０􀆰 ００６ ０􀆰 ０８６±０􀆰 ００４
ρ （乙酰丙酸） ＜０􀆰 ００１ ＜０􀆰 ０１
ρ （糠醛） ＜０􀆰 ００１ ＜０􀆰 ０１
３　 第 ４期 李　 鑫等：米根霉两段式利用板栗栗苞生产富马酸
　 　 浓缩的纤维素酶水解液，可提高酶解液中可发
酵糖浓度，进而有利于提高后续发酵产物的浓度。
从表 ２中可知，葡萄糖质量浓度从 ９􀆰 ６３ ｇ ／ Ｌ升高到
４５􀆰 ７１ ｇ ／ Ｌ。 纤维二糖和木糖在浓缩液中的质量浓
度分别为 ０􀆰 ６８和 １􀆰 ４６ ｇ ／ Ｌ。 与此同时，浓缩过程并
未显著增加发酵抑制物的浓度，如甲酸、乙酸、５ 羟
甲基糠醛、糠醛和乙酰丙酸，不会抑制后续的米根
霉发酵产富马酸。
２􀆰 ３　 米根霉菌体的增殖
自水解预处理栗苞过程生成以含有木糖为主
的预水解液，弃之带来环境污染问题，如能利用，可
有效降低生产成本。 Ｘｕ等［１３］以木质纤维原料预处
理过程生成的低利用度木糖为碳源，增殖米根霉，
取得良好效果。 本文以预水解液与木糖组成增殖
培养基的碳源，米根霉利用此碳源增殖米根霉菌
体，结果如图 ２所示。
图 ２　 增殖培养基中木糖对米根霉增殖的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｘｙｌｏｓｅ ｉｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ
ｏｎ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｇｒｏｗｔｈ
由图 ２ 可知，增殖培养基中木糖浓度的变化对
木糖利用率和菌体生物量影响显著。 当木糖质量
浓度为 ３０ ｇ ／ Ｌ 时，菌体生物量达到最大值为 ４􀆰 ５
ｇ ／ Ｌ。 提高木糖浓度时，米根霉的木糖利用率迅速
下降，可能由于米根霉对木糖代谢缓慢，需要延长
发酵时间才能有效利用全部的木糖［１４］。 窦畅等［１５］
研究发现，米根霉以木糖为碳源进行发酵，菌体延
滞期较葡萄糖更长，但增殖的菌体生物量明显高于
以葡萄糖为碳源时增殖的菌体生物量。 与葡萄糖
对比，米根霉更易利用木糖增殖菌体生物量。 因
此，以预水解液与木糖的混合碳源培养米根霉，增
殖培养基中木糖质量浓度以 ３０ ｇ ／ Ｌ为宜。
２􀆰 ４　 米根霉利用浓缩酶解液发酵产富马酸
以增殖的米根霉为发酵菌种，利用浓缩的栗苞
酶解液发酵产富马酸，并与纯糖发酵结果对比，结
果如图 ３所示。 由图 ３可知：纯糖发酵中，葡萄糖浓
度迅速下降，发酵 ４８ ｈ 时，富马酸质量浓度达到最
大值（２０􀆰 １７ ｇ ／ Ｌ），糖酸转化率 ０􀆰 ４１ ｇ ／ ｇ。 酶解液发
酵中，发酵伊始，酶解液中葡萄糖浓度呈现下降趋
势，这是由于以预水解增殖米根霉菌体，使米根霉
菌种适应了木质纤维素的碳源体系，降低了菌种因
适应恶劣碳源而出现的较长延滞期。 发酵 １２ ～ ３６
ｈ，葡萄糖浓度迅速下降，而此阶段富马酸浓度并未
显著增加。 这是由于米根霉是非生长耦联型的产
酸机制，富马酸的分泌均在菌体生长完成之后［１］。
当发酵 ３６ ｈ后，富马酸浓度逐渐增加，进入米根霉
发酵产酸期。 当发酵 ９６ ｈ，富马酸质量浓度达到
１５􀆰 ７８ ｇ ／ Ｌ，糖酸转化率为 ０􀆰 ３４ ｇ ／ ｇ。 Ｘｕ 等［１３］先以
玉米秸秆酸水解液（富含木糖）增殖米根霉，再利用
酸预处理玉米秸秆的酶解液为碳源发酵产富马酸，
糖酸转化率为 ０􀆰 ３５ ｇ ／ ｇ。 本研究的糖酸转化率接近
０􀆰 ３５ ｇ ／ ｇ，说明以板栗栗苞为原料，通过自水解预处
理疏解木质纤维结构，米根霉可有效利用栗苞酶解
碳源发酵产富马酸。 同时，酶解后剩余的酶解渣含
有高含量的木质素，如能进一步深加工再利用，可
提高板栗栗苞的全利用价值。
图 ３　 米根霉利用自水解预处理栗苞酶解液
和纯糖发酵产富马酸
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ
Ｒ． ｏｒｙｚａｅ ｕｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ
ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｓｈｅｌｌ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓｅ
３　 结论
以米根霉为发酵菌种，通过两段式发酵工艺，
利用自水解预处理的板栗栗苞生产富马酸。 采用
２２０ ℃自水解预处理栗苞，可显著疏解栗苞紧密的
木质纤维结构，半纤维素的降解率达到 ９４􀆰 ６６％，预
水解液中总还原糖质量浓度达到 ４􀆰 ４２ ｇ ／ Ｌ。 当底物
为 ５０ ｇ ／ Ｌ、纤维素酶添加量为 ５０ ＦＰＩＵ（以 １ ｇ 纤维
素计）时，酶水解 ７２ ｈ，纤维素的酶解得率达到 ９５％
（下转第 １１页）
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
［１１］　 ＫＵＭＡＲＩ Ｓ， ＰＡＮＥＳＡＲ Ｐ Ｓ， ＢＥＲＡ Ｍ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｈｙｓｉｃｏ⁃ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ
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［１２］ 　 ＮＥＤＯＶＩＣ＇ Ｖ Ａ，ＯＢＲＡＤＯＶＩＣ＇ Ｂ，ＬＥＳＫＯŠＥＫ⁃Ｃˇ ＵＫＡＬＯＶＩＣ＇ Ｉ，ｅｔ
ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｇｉｎａｔｅ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ
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ｆｏｒｍｉｎｇ ｏｎ Ｃａ⁃ａｌｇｉｎａｔｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｉｌａｓｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
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［１６］ 　 ＳＨＩ Ｘ，ＭＩＡＯ Ｙ，ＣＨＥＮ Ｊ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｆｒｅｅｚｅ
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［１７］ 　 ＳＥＲＩＯ Ｍ Ｄ，ＴＥＳＳＥＲ Ｒ，ＳＡＮＴＡＣＥＳＡＲＩＡ Ｅ．Ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｍａｓｓ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｏｄｅｌ ｔｏ ｓｉｍｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂａｋｅｒ􀆳ｓ ｙｅａｓｔ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ［Ｊ］ ．Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｊ，２００１，８２，３４７⁃３５４．
［１８］ 　 ＨＡＹＥＳ Ｓ Ａ，ＰＯＷＥＲ Ｊ，ＲＹＤＥＲ Ｄ Ｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ
ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｒｅｗｉｎｇ ［ Ｊ］ ． Ｂｒｅｗ Ｄｉｇ， １９９１， ６６：
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（责任编辑　 管珺）
􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌
（上接第 ４页）
以上。 以预水解液混合糖液为菌种培养碳源，可使
米根霉生物量有效增殖，进而采用栗苞酶解液作为
发酵碳源，富马酸质量浓度达到 １５􀆰 ７８ ｇ ／ Ｌ，糖酸转
化率为 ０􀆰 ３４ ｇ ／ ｇ，证明板栗栗苞生物质作为发酵碳
源具有可行性。
参考文献：
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ｗａｓｔｅ ｗｈｅａｔ ｓｔｒａｗ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｅｎｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｃｏ⁃
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［１３］ 　 ＸＵ Ｑ，ＬＩ Ｓ，ＦＵ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ｔｗｏ⁃ｓｔａｇｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｎ ｓｔｒａｗ ｂｙ
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｆｏｒ ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ
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［１４］ 　 ＶＩＡＬＬＹ Ｇ， ＭＡＲＣＨＡＬ Ｒ， ＧＵＩＬＢＥＲＴ Ｎ． Ｌ （ ＋ ） Ｌａｃｔａｔｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｂｙ
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＵＭＩＰ ４． ７７ ［ Ｊ］ ． Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，
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（责任编辑　 荀志金）
１１　 第 ４期 尤业兵等：海藻酸钙凝胶颗粒固定化抗冻酵母 ＡＦＹ １的机制分析及条件优化