全 文 ：第 １３卷第 ２期
２０１５年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０２􀆰 ００７
收稿日期：２０１４－０４－０２
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０９２１０４）；国家自然科学基金重点项目（４１２３０９６２）；国家海洋公益专项（２０１３０５０１８）；
广东海洋经济创新发展区域示范项目（ＧＤ２０１２ Ｄ０１ ００２）；中国科学院重点部署项目（ＫＳＣＸ２ ＥＷ Ｂ １３）
作者简介：李丽珍（１９８９—），女，广东汕头人，硕士研究生，研究方向：海洋生物学；张 偲（联系人），研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈｓｉｍｄ＠ ｓｃｓｉｏ．ａｃ．ｃｎ
深海放线菌生淀粉酶基因的克隆表达
及酶学特性研究
李丽珍１，２，杨　 键１，田新朋１，麦志茂１，２，苏宏飞１，２，龙丽娟１，２，张　 偲１，２
（１􀆰 中国科学院 南海海洋研究所 热带海洋生物资源与生态重点实验室，广东省海洋药物重点实验室，
广东 广州 ５１０３０１；２􀆰 中国科学院大学，北京 １０００４９）
摘　 要：从深海放线菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ􀆰 ＳＣＳＩＯ ０３０３２ 基因组中扩增到 １ 条含淀粉结合域的水解糖苷 １３ 家族基因
ａｍｙ０３２，该基因编码氨基酸与已知蛋白一致性最高为 ６７％。 将 ａｍｙ０３２插入表达载体 ｐＥＴ３２ａ启动子下游，构建重
组载体 ｐＥＴ ａｍｙ。 重组质粒导入大肠杆菌 Ｒｏｓｓｅｔａ （ＤＥ３）菌株中，ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析结果显示目的基因成功实现异
源表达。 Ｎｉ ＮＴＡ对重组酶进行纯化，并对其酶学性质进行表征。 结果表明：重组淀粉酶 ＡＭＹ０３２ 的最适作用温
度为 ５０ ℃，最适 ｐＨ 为 ８􀆰 ０，以可溶性淀粉为底物时的比酶活为 （２７６ ± ５７） Ｕ ／ ｍｇ，Ｋｍ为 ０􀆰 ０２ ｇ ／ Ｌ， Ｖｍａｘ为 ７０
ｍｇ ／ （Ｌ·ｍｉｎ）。 Ｃａ２ ＋能提高该酶的催化活性，Ｎｉ２＋、Ｃｕ２ ＋、Ｚｎ２ ＋和 Ｍｎ２ ＋对该酶有抑制作用。 ＡＭＹ０３２对生玉米淀粉和
生大米淀粉具有水解活性，其比酶活分别为（４９±１２） Ｕ ／ ｍｇ 和（３９±１１） Ｕ ／ ｍｇ；扫描电镜结果显示 ＡＭＹ０３２ 使生玉
米淀粉的表面产生明显凹陷。
关键词：深海放线菌；基因组挖掘；有机物降解；淀粉结合域；克隆表达
中图分类号：Ｑ９３；ＴＱ９２５􀆰 １　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０２－００３５－０６
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｗ ａｍｙｌａｓｅ
ｇｅｎｅ ｆｒｏｍｄｅｅｐ⁃ｓｅａ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
ＬＩ Ｌｉｚｈｅｎ１，２，ＹＡＮＧ Ｊｉａｎ１，ＴＩＡＮ Ｘｉｎｐｅｎｇ１，ＭＡＩ Ｚｈｉｍａｏ１，２，
ＳＵＮ Ｈｏｎｇｆｅｉ１，２，ＬＯＮＧ Ｌｉｊｕａｎ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｓｉ１，２
（１􀆰 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ，ＣＡＳ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍａｒｉｎｅ
Ｂｉｏ⁃ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｓｅａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｃｅａｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０３０１，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １３ ｇｅｎｅ ａｍｙ０３２， ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｗｈｉｃｈ
ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ６７％ ｗｉｔｈ ｋｎｏｗｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ，ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｄｅｅｐ ｓｅａ ｓｔｒａｉｎ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＳＣＳＩＯ ０３０３２． Ｔｈｅ ｍａｔｕｒｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ３２ａ ｕｎｄｅｒ Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ （ ＤＥ３） ｃｅｌｌｓ， ａｎｄ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ． Ｅｎｚｙｍｅ ＡＭＹ０３２ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ
ｎｉｃｋｅｌ⁃ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ５０
℃，ａｎｄ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ８􀆰 ０． Ｗｉｔｈ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ （２７６±５７） Ｕ ／ ｍｇ，Ｋｍ ｗａｓ
０􀆰 ０２ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｗａｓ ７０ ｍｇ ／ （Ｌ·ｍｉｎ）． Ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｙ
Ｃａ２＋ ａｎｄ ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ ｂｙ Ｎｉ２＋，Ｃｕ２＋，Ｚｎ２＋ ａｎｄ Ｍｎ２＋ ． ＡＭＹ０３２ ｃｏｕｌｄ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ ｒａｗ ｃｏｒｎ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｒａｗ ｒｉｃｅ
ｓｔａｒｃｈ，ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ （４９ ± １２） Ｕ ／ ｍｇ ａｎｄ （３９ ± １１） Ｕ ／ ｍｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｈｏｗｅｄ ＡＭＹ０３２ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｄｅｎｔｓ ｏｎ ｒａｗ ｃｏｒｎ ｓｔａｒｃｈ ｓｕｒｆａｃｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｅｅｐ⁃ｓｅａ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ；ｇｅｎｏｍｅ ｍｉｎｉｎｇ；ｏｒｇａｎｉｃ ｍａｔｔｅｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ； ｓｔａｒｃｈ⁃ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；
ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　 　 生淀粉是一种结构复杂而致密的有机大分子颗
粒，其外层有水化层包裹，一般淀粉酶难以进入生淀
粉内部对其进行水解，所以生淀粉的糖化往往需要通
过高温蒸煮来破坏生淀粉颗粒的水化层结构［１］。 生
淀粉酶对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒表现出强水
解活性［２］，可将传统的淀粉糊化、液化、糖化工艺合并
为一步直接糖化［３］。 若将生淀粉酶应用于无蒸煮的
酒精发酵，总耗能可节约３０％～４０％［４］，因此生淀粉降
解酶的研究一直受到高度关注。
具有生淀粉降解活性的酶通常具有 ３ 个结构
域［５］：催化域 （ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ，ＣＤ）、淀粉结合域
（ｓｔａｒｃｈ⁃ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＳＢＤ）和一段连接区域。 淀
粉结合域（ＳＢＤ）对于生淀粉的酶解至关重要，一方
面它使酶吸附到淀粉颗粒上从而有利于酶的水解
作用，另一方面它本身就会破坏淀粉颗粒的结构从
而促进酶解［６］。 有研究发现，没有淀粉结合区域的
葡萄糖淀粉酶对可溶性淀粉的水解速率不变，而对
生淀粉颗粒的水解能力非常低［７］。 目前为止，绝大
多数生淀粉酶的来源是陆地微生物［８］，也有少量海
洋细菌的 α 淀粉酶被报道具有生淀粉降解活性，
分别来自 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ􀆰 ＡＬＳＨＬ３［９］和 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｑｕｉｍａｒｉｓ
ＭＫＳＣ ６􀆰 ２［１０］。
以海洋动植物的有机体为主的大分子有机物
（包括碳水化合物、蛋白质和脂类）源源不断地向沉
积物中沉降，为沉积物中的异养微生物提供了充足
的营养来源。 出于摄食的需求，这些微生物往往首
先要分泌出一系列水解酶类将颗粒有机物水解为
可吸收的小分子物质。 因而海洋沉积环境来源的
微生物具有生产高活性有机物水解酶的潜力。
笔者从 １ 株深海放线菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ􀆰 ＳＣＳＩＯ
０３０３２的全基因组序列中挖掘出 １ 条具有 ＣＢＭ２０
家族淀粉结合域的新型 α 淀粉酶基因 ａｍｙ０３２，其
编码的蛋白具有潜在水解生淀粉的能力，将该基因
进行异源表达，并表征其酶学特性，以期为其工业
化应用奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
海洋放线菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ􀆰 ＳＣＳＩＯ ０３０３２（分离于
３ ４１２ ｍ 深的印度洋沉积物）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｓｅｔａ
（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α，保藏于热带海洋生物资
源与生态重点实验室；表达载体 ｐＥＴ３２ａ，Ｎｏｖａｇｅｎ 公
司；ＬＡ ｔａｑ酶、ｐＭＤ１８ Ｔ载体、限制性内切酶，ＴａＫａＲａ
公司；胶回收试剂盒，ＯＭＥＧＡ公司。 ３，５ 二硝基水杨
酸（ＤＮＳ）等化学试剂均为市售分析纯。
１􀆰 ２ 　 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ􀆰 ＳＣＳＩＯ ０３０３２ 基因组 ＤＮＡ
的提取
　 　 有关 ＤＮＡ的提取方法参照文献［１１］进行。
１􀆰 ３　 α 淀粉酶基因 ａｍｙ０３２的克隆
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ􀆰 ＳＣＳＩＯ ０３０３２ 的淀粉酶基因序
列已经通过基因组测序获得，使用生物信息学软件
Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ进行引物设计，获得上游引物 ５′ ＡＴＡＴ⁃
ＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡＧ⁃
Ｇ ３′和下游引物 ５′ ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡ⁃
ＧＡＣＧＴＣＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧ ３′。 使用所设计的上下
游引物，以 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ􀆰 ＳＣＳＩＯ ０３０３２基因组 ＤＮＡ
为模板 ＰＣＲ扩增 α 淀粉酶基因 ａｍｙ０３２，用限制性
内切酶 ＢａｍＨⅠ和 ＸｈｏⅠ酶切 α 淀粉酶基因
ａｍｙ０３２后，与经 ＢａｍＨⅠ和 ＸｈｏⅠ酶切的表达载体
ｐＥＴ３２ａ进行连接。 将连接产物转化至大肠杆菌
ＤＨ５α中，涂布到含 １００ μｇ ／ ｍＬ氨苄青霉素的 ＬＢ培
养基平板上筛选克隆。 进一步提取质粒 ＤＮＡ，双酶
切验证正确后命名重组质粒为 ｐＥＴ ａｍｙ。
１􀆰 ４　 重组菌株的培养和诱导
将重组质粒 ｐＥＴ ａｍｙ转化至大肠杆菌 Ｒｏｓｓｅｔａ
（ＤＥ３）中，接种至 ５０ ｍＬ 含氨苄青霉素的 ＬＢ 培养
基中，３７ ℃振荡培养，待 ＯＤ６００为 ０􀆰 ６ 时，加入 ＩＰＴＧ
使其终浓度为 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，２８ ℃诱导 １０ ｈ。 ９ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，收集菌体，用 １０ ｍＬ 浓度为 １００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲液重悬菌体，超声破胞 １０
６３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
ｍｉｎ。 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 的转速离心 １０ ｍｉｎ，上清即为
ＡＭＹ０３２的粗酶液。
１􀆰 ５　 α 淀粉酶的分离纯化
粗酶液过镍柱，用 ｐＨ 为 ８􀆰 ０ 的 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的咪
唑溶液平衡柱子，加入酶液后再用 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 和 ２０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的咪唑溶液洗掉杂蛋白， 最后用 ５００
ｍｍｏｌ ／ Ｌ的咪唑溶液洗脱目的蛋白，收集到的洗脱液
为纯化后的酶液，用 １２％的聚丙烯酰胺凝胶电泳
（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）进行检测。
１􀆰 ６　 α 淀粉酶 ＡＭＹ０３２酶活的测定
取 ５０ μＬ稀释一定倍数的纯化重组酶 ＡＭＹ０３２，
加入到 ４５０ μＬ ０􀆰 ０１ ｇ ／ Ｌ 的淀粉溶液 （ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
ｐＨ８􀆰 ０）中，５０ ℃水浴 １０ ｍｉｎ 后，加入 ５００ μＬＤＮＳ 溶
液。 沸水中反应 ５ ｍｉｎ，室温冷却，分光光度计测量在
５４５ ｎｍ下的吸光值。 吸光值与不同含量的葡萄糖吸
光度标准曲线图做比较计算酶活。 一个酶活力单位
（Ｕ）定义为在上述反应条件下，每分钟转化等价于 １
μｍｏｌ葡萄糖的还原糖所需的酶量。
１􀆰 ７　 酶学性质研究
１􀆰 ７􀆰 １　 温度对酶活性的影响
在反应温度分别为 ２０、３０、４０、５０、６０和 ７０ ℃的
条件下，测定不同温度条件下的酶活。 以酶活最高
为 １００％，其余为相对酶活，确定酶的最适反应温
度。 每组设置 ３个重复试验。
１􀆰 ７􀆰 ２　 ｐＨ对酶活性的影响
用 ｐＨ 分别为 ４􀆰 ０、５􀆰 ０、６􀆰 ０、７􀆰 ０、８􀆰 ０、９􀆰 ０ 和
１１􀆰 ０的缓冲液配制不同 ｐＨ 的 ０􀆰 ０１ ｇ ／ Ｌ 可溶性淀
粉溶液，测定相应的酶活力。 以酶活最高为 １００％，
其余为相对酶活，确定酶的最适反应 ｐＨ。 每组设置
３个重复试验。
１􀆰 ７􀆰 ３　 金属离子对酶活性的影响
以不加金属离子为对照，分别在酶液中加入 ５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 Ｃａ２＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、Ｂａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ ＋、Ｍｎ２＋、
Ｚｎ２＋和 Ｃｕ２＋处理，再加入 １％质量分数的可溶性淀粉
反应，测定酶活。 每组设置 ３个重复试验。
１􀆰 ７􀆰 ４　 降解生淀粉能力的比较
取 ５０ μＬ稀释一定倍数的纯化重组酶 ＡＭＹ０３２，
分别与 ０􀆰 ０１ ｇ ／ Ｌ生玉米淀粉、生大米粉、生红薯粉和
生木薯粉混合后，于 ５０ ℃摇床、１００ ｒ ／ ｍｉｎ 反应 ２０
ｍｉｎ，测定上清液中还原糖的量，计算酶的比酶活，并
与可溶性淀粉对比。 每组设置 ３个重复试验。
１􀆰 ８　 扫描电镜表征
０􀆰 ０１ ｇ ／ Ｌ的生淀粉添加 ５０ Ｕ 的 ＡＭＹ０３２ 降解
３０ ｍｉｎ后，离心，沉淀后用无水乙醇洗涤 ３ 次，自然
风干。 使用 Ｉｏｎ Ｓｐｕｔｔｅｒ Ｅ １０１０ 型离子溅射仪
（Ｈｉｔａｃｈｉ公司）在 ５􀆰 ０ ｋＶ和 ２０ ｍＡ的条件下对淀粉
颗粒喷 ４０ ｓ，使颗粒表面镀 Ｐｔ。 采用 Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ ４８００
型扫描电镜（Ｈｉｔａｃｈｉ公司）观察和拍照。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 α 淀粉酶基因 ａｍｙ０３２ 的核苷酸序列分析以
及编码产物 ＡＭＹ０３２的氨基酸序列分析
　 　 用 ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ􀆰 ｎｃｂｉ􀆰 ｎｌｍ􀆰 ｎｉｈ􀆰 ｇｏｖ ／ ）上的
软件如 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ、ＢＬＡＳＴ 对 α 淀粉酶 ＤＮＡ 序列
进行分析发现，α 淀粉酶基因 ａｍｙ０３２ 的开放阅读
框由 １ ７３７个脱氧核苷酸组成。 其中起始密码子为
ＧＴＧ，终止密码子为 ＴＧＡ，测序结果提交 ＧｅｎＢａｎｋ，
基因登录号为 ＫＪ５７７５４８。 α 淀粉酶基因 ａｍｙ０３２
编码 １ 个含 ５７９ 个氨基酸的蛋白质。 使用 ＢＬＡＳＴ
搜索 ＧｅｎＢａｎｋ数据库，与 ＡＭＹ０３２ 催化功能域相似
性最高的为灰黄链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）的
假定水解糖苷酶蛋白，其氨基酸一致性为 ６７％（图
１）。 用组件结构研究工具 Ｐｆａｍ 分析来源于海洋放
线菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ􀆰 ＳＣＳＩＯ ０３０３２ 的 α 淀粉酶
ＡＭＹ０３２的组件结构，结果显示：自 Ｎ 端的 １ ～ ３９ 位
氨基酸为信号肽，自 Ｎ 端的 ７１ ～ ３４５ 位氨基酸为家
族 １３水解糖苷酶的催化功能域，自 Ｎ端第 ３９７～４６７
位氨基酸为 α 淀粉酶的 Ｃ 端 β 折叠域，自 Ｎ 端
４８３～５６９位氨基酸为 ＣＢＭ２０ 淀粉结合功能域。 淀
粉结合域在真菌生淀粉酶中非常常见，大多数真菌
生淀粉酶的淀粉结合域都位于羧基端，但是米根霉
的糖化酶的 ＳＢＤ 是位于氨基端。 真菌来源的糖化
酶的 ＳＢＤ包括了大约 １００个氨基酸残基，这个区域
可能处于催化区域的后面，也可能是处在一个糖基
化连接区域的后面。
２􀆰 ２　 α 淀粉酶基因 ａｍｙ０３２ 在大肠杆菌中的表达
及重组酶的纯化
　 　 笔者前期尝试使用 ｐＥＴ２８ａ 和 ｐＥＴ２２ｂ 对基因
ａｍｙ０３２进行表达，表达产物均以无活性的包涵体形
式存在，ｐＥＴ３２ａ表达载体在多克隆位点的上游添加
３１５ ｂｐ 的 Ｔｒｘ 标签用于辅助蛋白折叠。 重组质粒
ｐＥＴ ａｍｙ导入大肠杆菌后，重组细胞裂解液表现出
淀粉酶活性。 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 电泳结果表明 α 淀粉酶
基因 ａｍｙ０３２在 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｒｏｓｓｅｔａ （ＤＥ３）中得到
表达，在约 ７􀆰 ５×１０４附近出现了明显条带，与预测的蛋
白大小相符（包括 Ｔｒｘ 标签 １􀆰 ０×１０４ 在内）。 粗酶液
７３　 第 ２期 李丽珍等：深海放线菌生淀粉酶基因的克隆表达及酶学特性研究
图 １　 ＡＭＹ０３２与同源的 α 淀粉酶的氨基酸序列比对
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＡＭＹ０３２ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｍｙｌａｓｅ
经镍柱亲和层析纯化后得到单一的电泳条带（图 ２），
纯度达 ９５％以上，可用于酶学性质分析。
１—标准蛋白；２—无 ＩＰＴＧ诱导 ｐＥＴ ａｍｙ在 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｒｏｓｓｅｔａ （ＤＥ３）
表达粗提取酶液；３—ＩＰＴＧ诱导 ｐＥＴ ａｍｙ在
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｒｏｓｓｅｔａ （ＤＥ３） 表达粗提提取酶液；
４—Ｎｉ ＮＴＡ亲和层析提取的 ＡＭＹ０３２
图 ２　 重组菌株表达 α 淀粉酶的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析结果
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｍｙ０３２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
２􀆰 ３　 酶学性质研究结果
考察温度对 ＡＭＹ０３２ 酶活力的影响，结果见图
３。 由图 ３可知：温度为 ５０ ℃时，酶活力最大。 当温
度大于 ５０ ℃时，酶活力下降较快。 温度达到 ７０ ℃
时，该酶仅存有 ２０％酶活力。 由此可知，该酶的最
适反应温度为 ５０ ℃。
图 ３　 反应温度对 ＡＭＹ０３２酶活的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＡＭＹ０３２
考察 ｐＨ对 ＡＭＹ０３２ 酶活力影响，结果见图 ４。
由图 ４可知：当 ｐＨ为 ８􀆰 ０时，酶活力最高；当 ｐＨ大
于 １０􀆰 ０时，酶活力仅有 １７％。 由此可发现，该酶反
应的最适 ｐＨ为 ８􀆰 ０。
考察金属离子对 ＡＭＹ０３２ 酶活力的影响，结
果见表 １。 由表 １ 可知：Ｃａ２ ＋对生淀粉酶有促进作
用，Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋和 Ｍｎ２＋对该酶有抑制作用，用
金属离子 Ｎｉ２＋处理酶液后，相对酶活只剩 １８％；
Ｃｕ２＋处理酶液后，相对酶活为 ３４％；Ｚｎ２＋处理酶液
８３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
图 ４　 ｐＨ对 ＡＭＹ０３２酶活的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＡＭＹ０３２
后，相对酶活仅剩 １４％；Ｍｎ２＋处理酶液后，酶活
为 ２４％。
表 １　 金属离子对 ＡＭＹ０３２酶活的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＡＭＹ０３２
金属离子 相对酶活 ／ ％ 金属离子 相对酶活 ／ ％
空白对照 １００ Ｎａ＋ ９９
Ｃａ２＋ １０２ Ｃｕ２＋ ３４
Ｋ＋ ９８ Ｚｎ２＋ １４
Ｎｉ２＋ １８ Ｍｎ２＋ ２４
Ｍｇ２＋ ８５ Ｂａ２＋ ９０
图 ６　 ＡＭＹ０３２水解生淀粉的 ＳＥＭ照片
Ｆｉｇ􀆰 ６　 ＳＥＭ ｉｍａｇｅｓ ｏｆ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ａｎｄ ｔｒｅａｔｅｄ ｒａｗ ｃｏｒｎ ｓｔａｒｃｈ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｗｉｔｈ ＡＭＹ０３２ ｂｙ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
以可溶性淀粉为底物，在 ｐＨ８􀆰 ０、温度 ５０ ℃的
条件下取不同质量浓度（ρＳ）的可溶性淀粉，测得反
应速率（Ｖ），得到 １ ／ Ｖ 与 １ ／ ρＳ的关系，结果见图 ５。
由图 ５双倒数线结果计算重组淀粉酶 ＡＭＹ０３２对可
溶性淀粉的 Ｋｍ值为 ０􀆰 ０２ ｇ ／ Ｌ，最大反应速率（Ｖｍａｘ）
为 ７０􀆰 １８ ｍｇ ／ （Ｌ·ｍｉｎ）。
２􀆰 ４　 ＡＭＹ０３２对生淀粉的水解
以不同的生淀粉为底物，测定 ＡＭＹ０３２ 对不同
生淀粉的降解能力，结果见表 ２。 由表 ２ 可知：生玉
米淀粉和生大米粉对酶解作用敏感，其比酶活分别
是（４９±１２）和（３９±１１） Ｕ ／ ｍｇ，但与陆地来源的生淀
图 ５　 淀粉酶 ＡＭＹ０３２ Ｋｍ值的测定
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｌｉｎｅｗｅａｒ⁃Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔｓ ｏｆ ＡＭＹ０３２
粉酶比较，ＡＭＹ０３２ 对生淀粉的水解率还需要提高
而与海洋来源的生淀粉酶 ＡｍｙＰ ［１７］ （ ３９􀆰 ６ ± １􀆰 ４）
Ｕ ／ ｍｇ相比，ＡＭＹ０３２ 具有良好的水解生淀粉能力。
而生红薯粉和生木薯粉对酶解作用不敏感。
表 ２　 ＡＭＹ０３２对不同生淀粉的降解活性
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＡＭＹ０３２ ｔｏ
ｖａｒｉｏｕｓ ｒａｗ ｓｔａｒｃｈ
底物 比酶活 ／ （Ｕ·ｍｇ－１）
可溶性淀粉 ２７６±５７
生玉米淀粉 ４９±１２
生大米粉 ３９±１１
生红薯粉 —
生木薯粉 —
使用扫描电镜观察了 ＡＭＹ０３２ 降解生淀粉前
后淀粉颗粒的变化情况，以未加入生淀粉酶为对照
组，结果见图 ６。 由图 ６ 可知：在 ５０ ℃反应 ２０ ｍｉｎ
后淀粉颗粒表面致密光滑（图 ６（ ａ）），而反应组中
经过重组淀粉酶 ＡＭＹ０３２ 处理后的生玉米淀粉颗
粒表面出现许多细密的孔洞 （图 ６ （ ｂ）），说明
ＡＭＹ０３２能有效破坏生玉米淀粉颗粒表面结构并释
放还原糖。 目前，很多来自陆地的具有生淀粉降解
９３　 第 ２期 李丽珍等：深海放线菌生淀粉酶基因的克隆表达及酶学特性研究
能力的 α 淀粉酶被广泛的研究，庞宗文等［１３］报道
从土壤中分离到 ４ 株具有生淀粉分解酶活性的根
霉，其中 Ｒｈｉｉｚｏｕｓ ｓｐ􀆰 ２ 和 Ｒｈｉｉｚｏｕｓ ｓｐ􀆰 ３ 的生淀粉分
解酶活性最高，分别为每克干曲 ５２０ Ｕ和 ４０５ Ｕ。 郭
爱莲等［１４］报道从自然界分离到 １ 株高酶活的生淀
粉糖化酶菌株黑曲霉 Ｓｘ，在最适产酶条件下酶活达
到 ３８２ Ｕ ／ ｇ。 丁立孝等［１５］报道从 ２３ 份土样中筛选
出 １０５株野生型霉菌，其中有 １０株具有较高的糖化
生淀粉的能力。 ＡＭＹ０３２对不同生淀粉的降解能力
存在差异，主要是因为不同植物来源的天然生淀粉
对生淀粉酶的敏感性差异很大，淀粉颗粒的大小、
表面特性和内部结构都成为影响因素［１６］。 一般来
说，谷物来源的淀粉较其他来源的淀粉容易被
降解［１７］。
３　 结论
克隆到来源于印度洋 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ􀆰 ＳＣＳＩＯ
０３０３２的 α 淀粉酶基因，并检测到纯化的 α 淀粉
酶具有生淀粉的降解能力，测定最适温度为 ５０ ℃，
最适 ｐＨ 为 ８􀆰 ０。 ＡＭＹ０３２ 对生玉米淀粉具有水解
活性，其比酶活为（４９±１２） Ｕ ／ ｍｇ，ＡＭＹ０３２ 的成熟
肽中有非常重要的两部分，一是自 Ｎ 端的第 ７１ ～
３４５位氨基酸为家族 １３水解糖苷酶的催化功能域，
二是自 Ｎ端第 ４８３～５６９位氨基酸为 ＣＢＭ２０ 淀粉结
合功能域。
基于氨基酸相似性，ＣＢＭ 分成了 ４２ 个家族，在
ＣＡＺｙ的分类中，ＣＢＭ中有六类是 ＳＢＤ家族，分别是
ＣＢＭ２０、ＣＢＭ２１、ＣＢＭ２５、ＣＢＭ２６、ＣＢＭ３４ 和 ＣＢＭ４１。
笔者研究的生淀粉酶 ＡＭＹ０３２ 的羧基端含有约 １００
个氨基酸的 ＣＢＭ２０类淀粉结合域，这段淀粉结合域
很可能对 ＡＭＹ０３２水解生淀粉的能力有重要贡献，
因而有必要对羧基端的氨基酸功能进行深入研究。
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ｓｔａｒｃｈｅｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｂｙ ａｌｐｈａ⁃ａｍｙｌａｓｅｓ ａｎｄ
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（责任编辑　 荀志金）
０４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷