全 文 ：第23卷 第6期
2011年6月
Vol. 23, No. 6
Jun., 2011
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2011)06-0605-07
N-糖基化位点鉴定方法和非经典N-糖基化序列
周　蕾，顾建新*
(复旦大学上海医学院，卫生部糖复合物重点实验室，上海 200032)
摘　要：蛋白质的 N-糖基化修饰是生物体调控蛋白质在组织和细胞中的定位、功能、活性、寿命和多样性
的一种普遍的翻译后方式。N-糖基化位点是理解糖链功能的重要前提之一。应用新的糖蛋白、糖肽富集技
术和质谱技术，科学家们在不同组织中完成了对 N-糖基化位点的鉴定。此外，不同于经典三联子的 N-糖
基化序列的发现使人们对 N-糖基化过程的认识向纵深发展。
关键词：N-糖基化；糖基化位点；非经典序列
中图分类号：Q513.3 文献标志码：A
N-glycosylation sites analysis and nonconsensus N-glycosylated sequences
ZHOU Lei, GU Jian-Xin*
(Key Laboratory of Glycoconjugate Research, Ministry of Health; Shanghai Medical College, Fudan university, Shanghai
200032, China)
Abstract: N-glycosylation of proteins is the most common post-tranlational modification, strongly influencing
many of their location, function, activity, life span and diversity. Our knowledge to N-glycosylation sites is one of
the most important prerequisites for detailed functional understanding. Using new methods based on glycoproteins/
glycopeptides enrichment and mass spectrum techniques, scientists have been able to identify glycosylated sites in
different tissues. Besides, the discovery of novel sequence patterns for N-glycosylation will help to understand the
process of N-glycosylation better in future.
Key words: N-glycosylation; glycosylation sites; nonconsensus sequences
收稿日期：2011-02-28
基金项目：国家自然科学基金项目 ( 3 0 9 3 0 0 2 5，
31010103906)
*通信作者：E-mail: jxgu@shmu.edu.cn
糖基化 (Glycosylation)是指蛋白质或脂质在酶
的作用下被连接上糖链的过程。作为生物体内最为
重要的蛋白质翻译后修饰形式之一，糖基化调控了
蛋白质在组织和细胞中的定位、功能、活性、寿命
和多样性 [1-2]。细胞内超过 50%的蛋白质都修饰有
糖链，它们参与了包括细胞识别、细胞分化、发育、
信号转导、免疫应答等在内的各种重要的生命活动。
在多种疾病，如肿瘤、神经退行性疾病、心血管病、
代谢性疾病、免疫性疾病及感染性疾病的发生发展
中均伴随着蛋白质糖基化异常的发生 [3-4]。因此，针
对糖链形成、糖链结构和糖链功能的糖生物学研究
已成为当前生命科学不可忽视的领域。
区别于非酶糖化 (Glycation)过程，糖基化过程
中糖链的连接需要在糖基转移酶的作用下完成，同
时还具有位点特异的性质。根据结合位点和结构的
差异，糖链分为以下几种类型：(1)连接于天冬酰
胺 (Asparagine, Asn)残基酰胺氮的 N-连接糖链；(2)
连接于丝氨酸 (Serine, Ser)、苏氨酸 (Threonine, Thr)
残基羟基氧的 O-连接糖链；(3)与磷酸丝氨酸上的
磷酸连接的糖链；(4)连接于色氨酸 (Tryptophan,
Trp)残基上碳的 C-连接糖链 (很少见 )；(5)糖基
磷脂酰肌醇化。其中，N-连接糖链 (或称N-糖基化 )
在真核生物中广为存在，也是研究最为深入的一种
糖基化方式。
早在二十世纪六七十年代，N-连接糖链的生
生命科学 第23卷606
物合成过程就被阐明，这一过程在内质网中进行，
最初是将一个 14糖的脂连接前体寡糖添加到新生
肽链的天冬酰胺上。在真核细胞中，启动 N-连接
糖链合成的供体结构几乎是一致的，包括 3个葡萄
糖、9个甘露糖和 2个 N-乙酰氨基葡萄糖分子
(Glac3Man9GlcNAc2)，而由于高尔基体中糖苷酶和
糖基转移酶的作用，最终可以产生高甘露糖型、复
合型和杂合型三个主要类别的 N-连接糖链。这些
糖苷酶和糖基转移酶有限定的专一性，要求它们在
规定的顺序下发挥作用。而特定糖蛋白上出现的糖
链结构，主要取决于合成该糖蛋白细胞中所表达的
糖基转移酶。早期对 N-糖基化修饰肽链的研究表
明，接纳体天冬酰胺周围所需的最小序列是 Asn-X-
Thr/Ser，这里 X是除了脯氨酸 (Proline, Pro)之外的
任何氨基酸。
不同于核酸和蛋白质，糖链的生物合成具有非
模板性和结构的微观不均一性，一种给定的糖蛋白
可以连接有多种不同的糖链形式而形成多种糖形。
这一性质使糖蛋白具有了更多的分支结构、连接方
式和空间构象，携带了更多的生物信息，行使着更
为复杂的功能；然而，这种特性也给糖蛋白的分离
和分析带来了重重困难。近年来，随着各种技术的
兴起和发展，尤其是分离纯化技术、质谱技术、生
物芯片技术的推进，糖链的富集和鉴定方法日趋成
熟，针对糖基化位点、糖链结构开展各项研究成为
可能。
1　N-糖基化位点分析方法
尽管 N-糖基化修饰有着重要的生物学功能和
临床意义，我们当前对生物体内 N-糖链信息却还
知之甚少。建立糖链结构和功能间的联系 (功能糖
组学 )，检测疾病诊断和预后相关的糖基化变化，
阐明病原微生物感染过程的机制是当今糖生物学研
究的热点问题 [5-7]。总的来说，对糖基化的分析可
以从以下几个方面来考量：(1) 研究整体糖蛋白的
糖链；(2) 研究糖肽；(3) 研究化学方法或酶法释放
的糖链结构 (图 1)[8]。此外，在选择进行糖基化分
析的方法之前，还需要考虑以下一些因素：(1) 所
需的信息量；(2) 优先考虑的是数据的质量还是数
量；(3)有多少样品量可以提供 [8]。在 N-糖基化相
关的信息中，发生 N-糖基化的位点是我们理解其
糖链功能的基础。除了传统生物化学中应用点突变
等方法对糖基化位点进行研究，生物质谱技术也在
N-糖基化位点的鉴定中发挥了重要作用。
传统糖蛋白鉴定方法中，研究者往往通过凝胶
电泳将糖蛋白混合物分离开来，应用酶联糖链特异
抗体或凝集素通过化学发光法或过碘酸反应
(periodic acid Schiff, PAS)染色来检测。糖蛋白随后
经由多步色谱柱纯化，再应用自动 Edman测序来
测定糖基化位点 [9]。尽管生物质谱技术的应用提高
了分析的效率，应用这种方法大部分糖蛋白还是需
要进行逐一分析 [10]。2006年，Kaji等 [11]综合前人
HPAec-PAD，含脉冲安培计的高效离子交换色谱；Mecc，毛细管胶束电动色谱；cIeF，毛细管等电聚焦；cZe，毛细管区带
电泳；MALDI-MS，基质辅助激光解吸电离质谱；ce-lIF，激光诱发荧光毛细电泳；HILIC，亲水作用色谱；WAX，弱阴离
子交换；rP，反相；eSI-MS/MS，电喷雾离子阱串联质谱；MALDI-toF，基质辅助激光解析电离化/飞行时间质谱；cID，碰
撞诱导离解；etD，电子转移解离；ecD，电子获取解离。
图1 糖蛋白、糖肽和糖链研究的主要方法[8]
周　蕾，等：N-糖基化位点鉴定方法和非经典N-糖基化序列第6期 607
的方法，提出了应用于大规模糖蛋白位点鉴定的方
法——IGOT (isotope-coded glycosylation site-specific
tagging)。如图 2所示，该方法由以下步骤组成：(1)
通过凝集素亲和层析，抓取蛋白酶水解后的糖肽；(2)
通过疏水亲和层析纯化蛋白酶水解后的糖肽；(3) N-
糖苷酶介导的糖基化位点的 18O 掺入；(4) 通过液相
色谱与质谱耦联的蛋白质组学技术，鉴定被 18O 标
记的肽段。应用这一方法，研究人员检测了秀丽隐
杆线虫和小鼠肝脏的粗提取物，在一周时间内就
可以检测到数百至几千种糖蛋白，并获得其糖基
化位点 [12]。随后的研究也陆续从组学的角度从不
同组织中发现了数百种糖基化位点，例如，2009年
Wollscheid等 [13]检测了免疫系统中细胞表面的糖
蛋白 N-糖基化位点；Gundry等 [14]检测了鼠胚胎
成纤维细胞中的糖蛋白的 N-糖基化位点；人血浆、
血清和唾液腺中糖蛋白的 N-糖基化位点也都被检
测 [15-16]。
2010年，Zielinska等 [17]根据前人建立的“过
滤辅助样品制备 (FASP)”方法 [18]发展了新的糖肽
富集方法，可以更为高效地捕集包括膜蛋白在内的
糖蛋白 (图 3)。研究人员应用这一方法分析了鼠的
4种组织和血浆，发现了 2 352种糖蛋白上的 6 367
个 N-糖基化位点，这是迄今为止，对 N-糖基化位
点的分析中数据量最大的。
2　N-糖基化位点研究
2.1　经典N-糖基化位点研究
前人对 N-连接糖链的研究发现，在蛋白质的
一级结构中，糖基化的天冬酰胺残基几乎固定不变
地出现在三联子，即 Asn-X-Ser或 Asn-X-Thr序列
中，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸 [19-20]。
寡糖基转移酶 (OST)复合物和多萜醇结合前体聚糖
供体的结构和性质解释了 N-糖基化的发生对序列
C端氨基酸残基的要求。对糖基化序列中 Asn随后
的 +2位氨基酸的点突变研究表明氨基酸中氢受体
(hydrogen acceptor)的存在对将多萜醇上的 Glac3
Man9GlcNAc2连接到 Asn的亲核取代反应是必需
的 [21,22]。研究人员对 N-糖基化基序进一步研究，
将 Asn+2位氨基酸置换为 Thr类似物。结果表明，
OST复合物既不能容忍 +2位上 Thr甲基基团的改
图2 通过IGOT-LC-MS/MS大规模鉴定N-糖基化位点的方法[11]
根据FASP操作方法处理全组织SDS-裂解液(a,b); 在过滤设备单元中加入可溶的凝集素富集糖肽(c); 经离心去除未与凝集素结
合的肽，同时用糖苷酶水解结合的肽(d); 从过滤装置上洗脱(e)。
图3 样品制备和N-糖基化肽段富集(N-Glyco-FASP)，标准30K过滤设备作为反应环境[17]
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变，也不能容忍电荷的参入 [23-24]。Asn+2位上如果
是Thr，那么该序列发生N-糖基化的概率会更大 [25-26]。
此外，+1位上的氨基酸不是 Pro也是 N-糖基化发
生的必要条件，这是由于 Pro的环形结构会造成肽
链骨架的刚性增加造成的 [27]。研究发现，在 OST
的作用下，三联子序列的二级结构会发生改变，+1
位的氨基酸的位置会远离 Asn侧链氨基复合物和
+2位 Ser/Thr侧链的羟基。当三联子序列 N端或 C
端存在半胱氨酸 (Cysteine, Cys)时，由于二硫键的
形成，使得构象的刚性增加，从而使 N-糖链发生
的概率降低 [28]。
近年来，研究人员针对蛋白质数据库中已经确
定发生 N-糖基化修饰的 Asn附近的氨基酸展开了
研究，结果发现，Asn紧邻的前一位氨基酸是芳香
族氨基酸或疏水氨基酸的可能性较大，而 +1位和
+3位分别是小疏水性氨基酸和大疏水性氨基酸的可
能性较大。除了 +1位完全没有和 +3位可能性较小
之外，Asn的邻近序列中常会发现 Pro的存在。从
结构的角度来看，连有糖链的 Asn多出现在肽链转
角或弯曲处 [26,29]；进一步的研究发现，N-糖基化修
饰发生与否，往往依赖于 Asn侧链和 +2位 Ser/Thr
侧链的羟基间的距离，两者相距约 0.73Å时，最有
可能在 Asn上连接上糖链 [30]。
尽管二级结构是考量三联子序列中 Asn是否会
发生 N-糖基化的的因素，但值得注意的是，在修
饰发生的时候，蛋白质的结构尚未形成。在粗面内
质网腔中，OST复合物会和核糖体 60S亚基及转运
通道蛋白 Sec61形成三元复合物 [31-32]。当新生肽链
从核糖体多肽转移酶位 (P位 )上释放时，N-糖链
会在内质网网腔侧连接到 Asn上 [33]。新生肽链要
穿过P位和OST复合物之间的Sec61蛋白转运通道，
至少需要 65到 75个氨基酸残基的长度。这一相对
较短的长度使得蛋白质的糖基化修饰实际上是一个
共翻译过程，更确切地说是一个共转运过程 [34-36]。
翻译过程和 N-糖基化修饰过程的同时发生，表明
蛋白质的折叠并不影响某一特定位点上 N-糖链的
连接。事实上，前人的研究所反映的 N-糖基化肽
链的结构内涵，对理解糖基化基序在进化中的保守
性有重要意义 [26]；尽管如此，结构并非驱使糖基化
过程发生的原因。
2.2　散在报道的非经典N-糖基化序列
Asn-X-Cys序列是最早被认识的非经典 Asn-X-
Ser/Thr基序的糖基化序列，最初发现于血浆蛋白 C
和 von Willerbrand因子 [37-38]。在随后的研究中，陆
续有一些存在 N-糖基化修饰 Asn-X-Cys序列的蛋
白质被报道，包括人丝氨酸蛋白酶前体 α、表皮生
长因子受体、CD69蛋白、cathepsin B-like counter-
defense蛋白等 [38-42]。Bause和 Legler[21]通过合成肽
段的实验，推测 Cys上的巯基基团 (sulfhydryl group)
可以替代 Ser或 Thr上的羟基基团。尽管如此，这
一序列在模式生物中却很少见。Miletich和 Broze[38]
推测 Asn-X-Cys序列只有在 Cys残基尚未与其它
Cys形成二硫键时才有发生糖基化的可能，因为一
旦二硫键形成，则没有可以参与实现糖基化过程的
巯基。
近年来，随着糖生物学分析技术，尤其是生物
质谱技术的迅速发展，人们对 N-糖基化位点的研
究逐渐向纵深发展 [8,17,43]。除了经典的三联子序列
和 Asn-X-Cys序列，一些新的糖基化位点也逐渐被
报道。2009年，在波多黎各举行的第 20届国际糖
复合物会议上，顾建新等通过分子生物学手段提出
在真核系统获得的重组人热休克蛋白 60(Hsp60)上
存在非经典的 N-糖基化修饰位点。同年， Valliere-
Douglass等 [44]通过高效液相色谱和质谱分析等手
段，首次验证并报道了人的单克隆抗体以及从病人
血清中获得的抗体 IgG1和 IgG2的 CH1恒定结构域
上存在新的非经典 N-糖基化序列 TVSWN162 SGAL。
2010年，Valliere-Douglass等 [45]对重组人源性抗体
上发生的 N-糖基化修饰展开了进一步的研究。通
过酶解、凝集素富集、高敏感性质谱分析等技术手
段，发现在重组人 IgG2分子 VL结构域上存在连接
糖链的谷氨酰胺 (Gln)，存在于序列 QGT中的 106
位 Gln上连接有两天线的岩藻糖。除了糖基化的
Gln之外，还有 4个 Asn位点：Asn-162、Asn-360、
Asn-164和 Asn-35发生了糖基化修饰，有趣的是，
这些 Asn也并不在经典的三联子序列 Asn-X-Ser/
Thr中。作者通过进一步的研究发现，这些 Asn残
基存在于“反向三联子序列”(Ser/Thr)-X-Asn中，
而这可能与蛋白质的空间构象有关。这些结果表明，
与我们以往的认知不同，N-糖基化过程可能会受到
更多、更复杂的因素调控。
2.3　糖组学研究中的非经典N-糖基化序列
正如前文提到的，2010年，德国马克斯普朗
克生物化学研究所的科学家利用一种新的方法，识
别出了在不同组织中的 6 000余个糖基化蛋白位点，
为更好地了解生命过程建立了重要的基本原理，相
关研究结果发表于 Cell杂志 [17]。研究人员以过滤
技术为基础，获得了从复杂生物样品中提取糖蛋白
周　蕾，等：N-糖基化位点鉴定方法和非经典N-糖基化序列第6期 609
的方法，并将这种方法与高分辨率的质谱分析应用
相结合，在小鼠的组织样品中获得了 6 367个 N-糖
基化蛋白位点。相对于非糖基化蛋白而言，在脊椎
动物中，这些糖蛋白具有更为高度的保守性。同时，
研究人员发现蛋白质上的 N -糖基化位点 (至今未
知 )在阿尔茨海默氏症的发生和发展过程中发挥着
重要作用。
值得一提的是，研究人员在这一研究过程中，
对 N-糖基化位点也有了新认识。研究发现，N-糖
基化修饰会偏向于发生在蛋白质表面的环状和转角
结构处，这一点与磷酸化和乙酰化修饰类似 [46-47]。
然而，与磷酸化和乙酰化不同的是，N-糖基化修饰
也会发生在 β转角处，这表明糖分子连接的共翻译
过程比翻译后被激酶催化的磷酸化等过程更为稳定
和严格。
除了这种结构上的限制，96.5%的糖基化 Asn
都严格符合 Asn-X-Ser/Thr基序 (X为 Pro之外的任
何氨基酸 )，对糖基化基序进一步分析显示了更为
严格的规律，即 Asn+3位的氨基酸也不能是 Pro，
这一现象曾也在秀丽线虫中被报道过 [12]。正如前文
中提到的非经典 N-糖基化序列，如 Asn-X-Cys在
之前的研究中有散在的报道。研究发现 Asn-X-Cys
在小鼠的组织中分布广泛，但是丰度很低，只占到
所有位点的 1.3%。此外，研究还发现，2.2%的 N-
糖基化位点既不是经典的三联子序列，也不是 Asn-
X-Cys；这些序列在 Asn+2富含缬氨酸 (Valine, Val)
或在 +1位富含甘氨酸 (Glycine, Gly)(图 4)。糖基化
的 Asn-Gly和 Asn-X-Val的分布都有统计学意义，
同时，研究人员也通过 western blotting等方法对部
分位点作了进一步的验证。这一研究结果有力地证
明了非经典的 N-糖基化位点的广泛存在，为深入
理解 N-糖基化的特性和发生机制提供了依据。
3　结语
作为一种生物信息分子，N-糖链参与了几乎
所有的生命过程，糖链的改变与疾病尤其是肿瘤、
自身免疫性疾病、感染等重大疾病的发生、发展紧
密相关。针对 N-糖链的研究有助于深入认识生命
现象的本质，阐明疾病发生机制，以及为疾病的早
期诊断和治疗提供指导。对 N-糖基化位点的认识
是认识 N-糖链功能的重要前提，随着色谱技术和
质谱技术的发展，大规模的 N-糖基化位点分析成
为可能。非经典 N-糖基化基序的发现在某种意义
上更新了我们对 N-糖基化的认识，为我们认识和
了解 N-糖基化的本质和发生过程打开了新的一页。
[参　考　文　献]
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图4 经典及非经典N-糖基化序列
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