全 文 ：第23卷 第9期
2011年9月
Vol. 23, No. 9
Sep., 2011
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2011)09-0921-10
合成病毒：对流感病毒研究的贡献
孙明伟1,2，路希山1,3，高　福1,2,3,4,5*
(1 中国科学院微生物研究所，中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101；
2 中国科学技术大学生命科学学院，合肥 230027；3 中国农业大学动物医学院，北京 100094；
4 中国科学院北京生命科学研究院，北京 100101； 5 中国疾病预防控制中心，北京 102206)
摘　要：流感病毒是一种单股负链分节段 RNA病毒。完全以质粒为基础的反向遗传学技术的建立和发展
解决了利用 cDNA克隆人工合成流感病毒的难题和技术障碍，并逐渐成为研究流感病毒及生产流感疫苗的
重要基础和手段。重点综述了流感病毒反向遗传技术 20多年来的发展过程，以及以质粒为基础的反向遗传
操作系统在对流感病毒的生命周期、致病性的研究和生产疫苗等方面的巨大贡献。
关键词：流感病毒；反向遗传技术；病毒拯救；感染性克隆；流感疫苗
中图分类号：R373; O621.3 文献标志码：A
The contribution of synthetic virus to the study of influenza
SUN Ming-Wei1, 2, LU Xi-Shan1, 3, GAO George Fu 1, 2, 3, 4, 5*
(1 CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy
of Sciences, Beijing 100101, China; 2 College of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei
230027, China; 3 College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100094, China; 4 Beijing
Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 5 Chinese Center for Disease Control
and Prevention, Beijing 102206, China)
Abstract: Influenza virus is a member of Orthomyxoviridae and contains a segmented RNA genome of negative-
sense. The artificial generation of influenza viruses from cloned cDNA was long considered an insurmountable
obstacle. This changed with the establishment and development of plasmid-based reverse genetics technique that
has now become a fundamental part of influenza virus research and the generation of influenza vaccines. In this
review, we describe the background for this advance, the systems that are available for the generation of influenza
viruses, and the significant contributions for the understanding of the virus and disease during the past decades.
Key words: influenza virus; reverse genetics; rescue of virus; infectious clone; influenza vaccines
收稿日期：2011-08-22
基金项目：国家自然科学基金委员会创新研究群体科
学基金项目(81021003)
*通信作者：E-mail: gaof@im.ac.cn
2010年 5月，美国 Science杂志上的一篇文章
报道了首例人造细胞的诞生：J. Craig Venter等在体
外人工合成了蕈状支原体 (Mycoplasma mycoides)的
基因组，并将其转输到一个山羊支原体细胞内，使
组合后的细胞 (Synthia)表现出前者的生命特性。这
个人造基因组全长 1.08 Mb，是目前世界上最大的
人工合成的 DNA组织；基因组转输后的嵌合体细
胞是第一个完全由化学合成基因组控制并能自我复
制的人造细胞 [1]。该研究成果完成了合成生物学领
域的一个里程碑式的创举，同时也让合成生物学再
一次赢得了全世界的目光。
合成生物学 (synthetic biology)是一门建立在系
统生物学、生物信息学等学科基础上，并以基因组
学技术为核心的现代生物科学 [2]。许多学者认为合
成生物学成为一门真正的学科开始于 21世纪初。
但是，早在 19世纪人们就开始应用各种方法合成
尿素、核苷酸和氨基酸等有机物了。所以，合成生
生命科学 第23卷922
物学发展到今天能够人工合成细胞个体，已经有将
近 200年的历史了 [3]。但如果谈到人工合成完整生
命体，那么这还是从生物学家们对于病毒人工合成
的探索开始的。
病毒是由核酸分子 (DNA或 RNA)与蛋白质构
成的核酸－蛋白质复合体。病毒虽然具备了复制和
遗传等生命活动的最基本特征，但是它们不具备细
胞的形态结构，它们的主要生命活动必须借助宿
主细胞才能体现，因而是不“完全”的生命体。
各种病毒性疾病的恐怖和危害早已人所共知。在
历史上，人类也多次遭受到病毒性疾病暴发所带
来的灾难。至今，诸如麻疹病毒 (measles virus)、
艾滋病毒 (又叫人类免疫缺陷病毒，HIV)、重症
急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)以及流感病
毒 (influenza virus)等仍然威胁着全世界人类的生存
和健康。对于不同种类病毒的研究不仅是众多病毒
学家和免疫学家的主要任务，同时也是许多合成生
物学研究者的关注对象和兴趣所在。由于病毒结构
简单、增殖力强，并且具有自然界最小的基因组，
因而如果能够实现对某些病毒的人工合成制造，不
仅是合成生物学技术的突破，更对于理解该病毒的
分子机制和致病机理具有重要的意义。在此基础之
上，若能够对这些最小的生命体施以生物工程改造
则很可能创造出能够为人类所利用的经济价值。因
而，人工合成病毒一直是生物学界的一大目标与挑
战。
可喜的是，随着生物工程和基因组学技术的快
速发展，目前已经有一些不同种类的病毒相继在体
外合成出来。其中最值得一提的是在 2002年，纽
约州立大学的 Cello等 [4]第一次完全在无细胞环境
中合成了脊髓灰质炎病毒 (poliovirus)。脊髓灰质炎
病毒是小核糖核酸病毒科的一员，由 Vp1、Vp2、
Vp3和 Vp4四种核衣壳多肽各 60个拷贝外加一条
长度约 7 500 nt的单股正链 RNA基因组组成。研
究者利用化学方法合成了与脊髓灰质炎病毒基因组
RNA互补的 cDNA——F1、F2、F3三段 DNA片段，
分别连接在 pUC18或 pGEM-T Easy质粒中，通过
常规的酶切与连接，将三个片段拼接成 5端含有噬
菌体 T7 RNA聚合酶启动子的全长 cDNA片段。含
有病毒全长 cDNA的载体在体外 T7 RNA聚合酶的
作用下转录成病毒的 RNA，并且在无细胞提取液
中翻译和复制，最终重新装配成具有侵染能力的脊
髓灰质炎病毒。虽然该人工合成病毒的毒力只相当
于天然病毒的 1/1000~1/10000，但是将它注射到小
鼠体内仍然可使其脊椎麻痹而死亡。这一工作开创
了以无生命的化合物完全体外合成感染性病毒
的先河。之后在 2003年， Smith和 Venter等 [5]又人
工合成了噬菌体 φX174的基因组。该病毒基因组全
长 5 386 bp，共有 11个基因，研究者仅用了 14 d
就用化学合成的寡核苷酸拼接成了完整的噬菌体基
因组。将合成的基因组 DNA注入宿主细胞时，其
侵染性与天然的 φX174噬菌体无异 [6]。2008年，
Becker等 [7]设计合成了重组的蝙蝠体内 SARS样冠
状病毒 (Bat-ScoV)基因组，该基因组中受体结合结
构域 (RBD)被替换为之前大流行的 SARS冠状病毒
(SARS-CoV)的 RBD，从而成功感染了培养的人呼
吸道上皮细胞和小鼠。这一 29.7 kb的 RNA序列是
当时合成的最大的可以自我复制的基因组。
今日的成果并非一日之功。殊不知，如今所能
实现病毒，甚至细胞的大片段基因组的体外合成几
乎都得益于反向遗传学技术的发展。追溯人类合成
病毒的历史，也是源自 20世纪 80年代对于流感病
毒等的反向遗传技术的研究。事实上迄今为止，人
工合成病毒的最大应用仍然要属反向遗传技术在流
感病毒拯救中的贡献。
1　流感病毒反向遗传技术的建立与发展
流行性感冒病毒，简称流感病毒，包括人流感
病毒和动物流感病毒。它属正黏病毒科 (Orthomyxo-
viridae)，流感病毒属，是一种有囊膜的单股负链分
节段 RNA病毒。其基因组 RNA一般分为 8个片段，
可 编 码 12 种 功 能 蛋 白 (PB2、PB1、PB1-F2、
PB1-N40、PA、HA、NA、NP、M1、M2、NS1、
NS2)。流感病毒按照病毒核蛋白和基质蛋白的不同
可分为 A、B、C三种类型。其中 A型流感病毒
(influenza A virus)最为常见，其抗原性也最容易发
生变异，可导致传染性极强的呼吸系统疾病；而 B
型流感病毒对人类致病性较低；C型流感病毒仅会
引起轻微的上呼吸道感染。因而这后两种类型的流
感病毒很少造成流行。我们通常所说的流感病毒主
要是指 A型流感病毒，它能够感染人类和多种动物。
历史上的几次世界范围的大流行都是因 A型流感病
毒引起的，而流感在畜牧业的猪、马、家禽中的暴
发则带来巨大的经济损失 [8]。
血凝素 (HA)和神经氨酸酶 (NA)是流感病毒
粒子的两个表面糖蛋白。根据 HA和 NA的抗原性
差异可将 A型流感病毒分为各种不同的亚型。迄今
为止，已经有 16种 HA和 9种 NA亚型被鉴定。
孙明伟，等：合成病毒：对流感病毒研究的贡献第9期 923
流感病毒的不同 HA和 NA相互组合形成新的亚型
或旧亚型的重现从而引起流感 (大 )流行。流感病
毒粒子内部是膜相关基质蛋白 (M1)和另外 8个病
毒核蛋白复合体。其中每个核蛋白复合体都包括一
段病毒 RNA和病毒聚合酶亚基 PA、PB2、PB1以
及核蛋白 NP。另外，流感病毒还编码一个干扰素
拮抗物 (NS1)、一个核输出蛋白 (NEP，又叫 NS2)、
一个离子通道蛋白 (M2)、一个具有促凋亡功能的
PB1-F2以及一个新发现的 PB1-N40蛋白 [9]。它们
在病毒感染的早期和后期执行功能。流感病毒的各
个 RNA片段需要被核蛋白 NP包裹，并与 3个聚
合酶亚基 (PB2、PB1、PA)结合在一起形成核糖核
蛋白复合物 (ribonucleoprotein，RNP)才具有侵染活
性。病毒感染时，病毒粒子通过 HA与宿主细胞表
面的特异性 HA受体结合，通过受体介导的内吞和
膜融合进入细胞并释放出 RNPs。RNPs进入细胞核
后开始病毒基因组的复制和转录，每个病毒 RNA
片段独立组成一个转录单位，分别转录出 mRNA
和互补正链 RNA(cRNA)。mRNA翻译合成各种病
毒蛋白，cRNA则复制生成病毒的子代 RNA。之后
病毒蛋白和子代 RNA在细胞膜上组装成完整的病
毒粒子，释放到胞外，继而完成下一个感染周期。
早在 1978年，科学家就利用反向遗传操作成
功地在大肠杆菌中拯救了第一例 RNA病毒 (Qβ噬
菌体 )[10]。之后，依靠感染性 cDNA克隆技术，狂
犬病病毒、麻疹病毒、仙台病毒、新城疫病毒等负
链不分段 RNA病毒也相继被成功拯救 [11-12]。但是
人工合成流感病毒却由于在技术上存在许多障碍而
没有拯救成功：首先，流感病毒分节段的基因组有
8个 RNA片段 (A型和 B型流感病毒有 8个片段，
C型有 7个片段 )，若要人工合成流感病毒则需要
提供全部的 RNA片段；其二，不同于其他的 RNA
病毒，流感病毒的复制发生在感染细胞的细胞核内，
因此要将人工设计的基因片段在细胞核内合成或是
合成后运送到核内；第三，流感病毒基因组是负义
链 RNA。也就是说，其病毒 RNA不具备信使 RNA
的功能，不能作为模版直接翻译成蛋白质。而且，
感染周期的启动需要完整的病毒核衣壳，RNA只
有以核衣壳结构的方式存在才能作为病毒 RNA聚
合酶的功能模板。所以裸露的流感病毒 RNA不具
有侵染性，只有病毒的 RNA被病毒聚合酶复合物
(PB2/PB1/PA)和核蛋白 NP识别并复制，否则流感
病毒不会进行包装增殖。因此，这 4个重要功能蛋
白要和流感病毒的 8个 RNA片段共同产生并结合；
此外，流感病毒 RNA不包括 5帽子结构和 3多聚
腺苷酸尾巴，因此人工合成的病毒基因片段必须有
一个能够预先形成 5和 3末端而不需要细胞酶修
饰的转录系统。许多年来，正是由于这些要求的综
合限制，使得流感病毒的人工合成几乎成为了一个
不可逾越的难关。
在实验室内体外合成流感病毒的探索始于 20
世纪 80年代。由于流感病毒各个 RNA片断必须与
病毒蛋白结合在一起形成 RNPs才有活性，因此
RNPs对于流感病毒的人工合成是至关重要的。1981
年，Plotch等 [13]首次从变性的流感病毒中分离得到
了有复制功能的 RNPs，为后来合成流感病毒的反
向遗传技术奠定了基础。为了获得含有人工合成
RNPs的病毒粒子，一种以 cDNA转录合成病毒
RNA(vRNA)和蛋白质并结合辅助病毒为基础的操
作系统逐渐发展起来。于是在 1989年，Palese研究
组建立了一个可以向病毒基因组中导入单个人工合
成病毒 RNA的系统 [14]。他们通过体外克隆 cDNA
人工合成 vRNA，并将其中的 NS基因置换为氯霉
素乙酰转移酶基因 (CAT)，再与纯化的流感病毒聚
合酶复合物 (PB2、PB1、PA)及核蛋白 NP在体外
孵育，从而得到重组的病毒 RNPs，然后将该重组
的 RNP与辅助病毒 (helper virus，亦为流感病毒 )
共同转染真核细胞。在宿主细胞内，病毒的聚合酶
复合物、核蛋白 NP及另外 7条病毒 RNA片段均
由辅助病毒提供，从而将合成的 RNA重组到子代
病毒粒子中。这就是历史上第一个流感病毒的反向
遗传系统，称为 RNPs转染法。次年，该研究组又
应用此方法首次将特定位点突变引入重组的流感病
毒中 [15]。然而，这一系统仍然不能实现流感病毒的
从头合成，并且需要依赖于辅助病毒。由于在子代
病毒中大多数仍然是辅助病毒，重组病毒的筛选成
为了限制环节，因而该系统的重组效率很低。
1994年，Neumann等 [16]又建立了一种依赖于
真核细胞 RNA聚合酶 I(pol I)的转染系统。他们将
病毒 RNA互补的 cDNA克隆到鼠源 pol I启动子下
游，构建了在真核细胞内表达病毒 RNA的转染质
粒。pol I位于细胞核内负责转录核糖体 RNA(与病
毒 RNA相似 )，是所有 RNA聚合酶中唯一不使转
录的 RNA加上 5帽子和 3 poly(A)尾的聚合酶。
研究表明插入到 pol I启动子和终止子序列之间的
外源 cDNA可以被该酶转录。因此，利用 pol I能
够转录出流感病毒的完整基因组并保证 RNA片段
正确的 5和 3末端。虽然仍然依赖于辅助病毒和
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有效的筛选系统，但是这种方法却使病毒拯救摆脱
了体外蛋白质的纯化和 RNPs的形成。遗憾的是，
研究者们没能充分挖掘 pol I系统的利用潜力，因
而没有得到广泛的认同和应用。1996年，Pleschka
和 Palese[17]又将上述系统发展为可利用质粒载体在
细胞内表达并重构 RNP的方法，改用人源 pol I启
动子构建出能够高效转录 vRNA的 5质粒反向遗传
系统。在其中一个质粒 (pUC19载体 )上克隆一段
CAT报告基因，并受一个截短的人源 pol I启动子
和丁型肝炎病毒核酶终止子的调控；其余 4个质粒
(pHMG载体 )分别编码流感病毒的 PB1、PB2、PA
和 NP蛋白。将这 5个质粒共转染 293细胞 (人肾
上皮细胞系 )。该系统能够自身启动病毒的转录和
复制。虽然这个系统仍然不能脱离辅助病毒而包装
出完整的流感病毒，但是应用该系统已经可以针对
病毒的某一基因进行研究了，从而在流感病毒反向
遗传系统的构建道路上迈出了重要的一步，为 RNA
病毒的人工合成带来了曙光。
1999年 3月，Neumann和 Kawaoka等 [18]合作
在 5质粒系统工作基础上将 H1N1流感病毒 A/
WSN/33或 A/PR/8/34的 8个 vRNA互补片段分别
构建到 8个 cDNA克隆载体中，并用鼠源的 pol I
终止子代替丁型肝炎病毒核酶终止子。同时，又将
编码流感病毒的 9个重要蛋白 (PB1、PB2、PA、
NP、HA、NA、M1、M2和 NS2)的基因分别克隆
到 9个真核表达载体中，如此总共 17个质粒共同
转染 293T细胞，结果在每毫升培养上清中获得了
107个以上的病毒粒子。此外，研究者也尝试将表
达病毒蛋白的转染质粒减少到 4个，即只转染表达
3种聚合酶亚基 (PB2/PB1/PA)和核蛋白 NP的 4种
质粒，这样的共计 12(8+4)质粒系统亦可达到同样
的效果 [18]。虽然，十多个不同的质粒同时转染细胞
曾被认为是不可能的，但是事实上这种方法很快被
证明是非常有效的。无独有偶，同年 7月，Fodor
和 Palese等 [19]也完成了类似的工作，同样应用 12
质粒转染系统，只是依旧延用了丁型肝炎病毒核酶
终止子来保证转录后的 vRNA正确的 3末端。12
质粒的反向遗传系统操作简单，不再依靠辅助病毒
和筛选系统而只需构建 cDNA克隆及普通的细胞转
染便可成功合成具有感染性的流感病毒。该系统实
现了真正意义上的流感病毒拯救，很快便广泛地应
用到了流感病毒研究的各个领域。
基于质粒转染的反向遗传系统的高效运用十分
依赖于细胞的转染效率，然而数量较多的质粒同时
进入细胞共表达的方式又会显著影响病毒拯救的成
功率，并且在构建和转染上也会带来不便，尤其在
转染效率较低的细胞中，转染质粒的数量更是成了
整个系统的制约因素。因而为减少共转染质粒的数
量，2000年 Hoffmann和 Kawaoka等 [20]在 12质粒
转染系统的基础上进行了改进，构建了 pol I-pol II
双向表达系统：将合成病毒 RNA的 cDNA的反义
链克隆到人源 pol I启动子和鼠源 pol I终止子之间；
将 cDNA的正义链 (即 mRNA)克隆到人淋巴细胞
性脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV)pol II启动子和牛生长
激素 (BGH)poly(A)信号 (相当于 pol II终止子 )之
间。这样病毒的 vRNA和蛋白质便共用同一模板合
成，从而将转染质粒的数量减少到了 8个。应用这
样一个 8质粒系统，研究者成功拯救了 A/WSN/33
(H1N1)和 A/Teal/HK/W312/97(H6N1)流感病毒，在
转染 293T和 MDCK(犬肾细胞系 )细胞 72 h后获
得了 2×105~2×107个 /mL感染性病毒。之后，Hoffmann
等 [21]还尝试将双向载体的 pol I的启动子和终止序
列位置调换，从而变成一个 pol I/pol II同启动子的
8质粒单向表达系统，但是其拯救效率相比双向系
统要低。而且无论单向或双向的 8质粒系统，由于
使用同一模板合成 vRNA和表达蛋白质，所以因片
段缺失等造成的致死性突变将导致病毒拯救的失
败 [22]。这一点在表达外源基因或突变位点较多的情
况下，l2质粒系统要优于 8质粒系统。不过，12质
粒系统和 8质粒系统都是较为成熟的流感病毒反向
遗传系统，也是至今为止实验室内最常采用的流感
病毒拯救策略。
数量不断增长的人、禽、猪、马、犬类等的流
感病毒分离株几乎涵盖 A型流感病毒的全部亚型，
而这些毒株都普遍适用 pol I系统 (8质粒或 12质粒 )
进行病毒拯救。在多方学者的协力探索下，流感病
毒的反向遗传系统也在不断发生着改进和完善。为
了使该系统更加有效地应用于病毒致病机理的研究
和疫苗的研制，考虑到即使 8个质粒的构建和转染
仍然不够简洁，2005年，Neumann及 Kawaoka等 [23]
又将用于合成 8个 vRNA的 pol I转录单元或用于
合成 mRNA的 pol II转录单元分别构建到一个质粒
上，即一个质粒转录病毒所有的 vRNA(也可将转
录HA和NA的vRNA的片段单独构建为一个质粒 )，
一个质粒表达聚合酶亚基 PB1/PB2/PA，一个质粒
表达 NP蛋白。这样一个 3质粒或 4质粒系统共转
染 Vero(非洲绿猴肾细胞系 )细胞获得了大量增殖
的病毒。这种方法解决了在有限的哺乳动物细胞系
孙明伟，等：合成病毒：对流感病毒研究的贡献第9期 925
(如MDCK、Vero)中质粒转染效率低的限制，进一
步提高了转染效率和病毒拯救滴度，也为疫苗的更
新提供了更为便捷的工具。另外，值得一提的是，
当研究者只将转录流感病毒 8个 vRNA的单个质粒
转染 293T细胞，也令人惊奇地获得了较高的重组
病毒滴度 (6.3×104~3.7×107个 /mL)。这一出乎意料
的结果，为研究者对病毒 RNA片段的人工整合操
作提供了重要启示。单质粒的反向遗传系统也是将
来病毒合成与拯救技术发展的必然趋势。
很快，RNA病毒反向遗传系统也陆续在 B型
和C型流感病毒的研究中建立起来 [24-26]。在 2006年，
依赖噬菌体 T7 RNA聚合酶的流感病毒拯救也取得
了成功 [27]。该方法曾广泛用于在感染细胞的细胞质
中复制的负链 RNA病毒的合成。将流感病毒的
cDNA片段插入到 T7 RNA聚合酶启动子和终止子
(及丁型肝炎核酶序列 )之间；而由一个共转染的
蛋白质表达质粒提供 T7 RNA聚合酶。作用于细胞
核内的 T7 RNA聚合酶用于流感病毒的合成显示出
更高的效率，适用于多种细胞系为基础的流感病毒
理论研究和疫苗开发。
2　反向遗传学与流感病毒研究
经典遗传学源于 19世纪孟德尔的豌豆试验，它
通过研究生物的表型、性状来推测其遗传物质组成、
分布与传递规律等，从而研究生命过程的发生与发
展规律。而与经典遗传学的从性状表型到基因特征
的研究思路相反，反向遗传学 (reverse genetics)则是
在已知生物体全部基因组序列的基础上，通过现代
生物技术手段，对特定核苷酸序列进行突变、基因
插入和缺失、基因置换等加工和修饰，构建含生物
体必要元件的重组或修饰基因组，让其装配出具有
生命活性的个体，从而研究生物体基因组的结构与
功能，以及人工修饰和改造对生物性状的影响等。
而 RNA病毒的反向遗传操作技术正是在了解病毒
基因组及复制特点等的基础上，在病毒 cDNA水平
上进行体外人工操作，构建感染性分子克隆，并在
满足病毒正常复制和包装的必要系统下完成病毒的
人工从头合成的。这种病毒的反向遗传操作为合成
生物学技术手段之一，实现了病毒的“复活”，因
而也被称作病毒拯救 (rescue of virus)。
通过反向遗传技术，从 cDNA克隆拯救出具有
侵染性的负链 RNA病毒是 20世纪分子病毒学领域
最振奋人心的突破之一，它揭开了对病毒基因组进
行人工操作和详细了解病毒结构及其致病机制的历
史篇章。而在刚刚步入的 21世纪，反向遗传技术
的最显著应用便是成功拯救了已经绝迹的 1918年
西班牙流感病毒。
人类史上最具毁灭性的流感大暴发发生在
1918至 1919年间，当时全球 17亿人中有约 10亿
人感染。普通流感病毒的致死率仅为 0.1%，而这
种亚型的流感病毒致死率却高达 2.5%~5%，造成
全世界 2 000万 ~5 000万人死亡 [28]。由于当时西
班牙最先报道了此病并约有 800万人感染，因而
也被称作“西班牙流感”。这种病在当时几乎没有
感染性病原体被分离，使得以后的研究人员一直
无法解开这种病毒的致命之谜。然而，直到 2001年，
Taubenberger等陆续从福尔马林和石蜡保存的“西
班牙流感”患者遗体组织，以及一个埋藏在阿拉斯
加永久冻土下的一个患病女死者遗体中分离出了流
感病毒的全部 RNA片段 [29-35]。他们首先通过 RT-
PCR扩增出了西班牙流感病毒 NS基因片段 (编码
非结构蛋白 NS1)，并用反向遗传学方法与 A/WSN/33
(H1N1)或 A/PR/8/34(H1N1)等鼠适应性流感病毒株
重组。重组后的病毒感染 MDCK细胞情况良好，
但是在小鼠体内没有发挥 NS蛋白的干扰素抑制作
用。这表明 NS基因可能对 1918流感病毒的高致病
性不具决定影响 [31]。该小组之后的一些研究表明
1918流感病毒的 HA和 NA基因对于该病毒的致病
力具有至关重要的作用 [36-37]。单就 1918流感病毒
的 HA基因来说，拥有该基因的重组病毒的致病性
会显著增加 [38]，从而证明了流感病毒表面糖蛋白在
病毒病原性及侵染宿主过程中的关键作用。
病毒学家们对于“复活”1918西班牙流感病
毒的愿望，经过多年的探索和努力，终于在 2005
得以彻底实现。Tumpey和 Taubenberger等 [39]用反
向遗传技术从 1918流感病毒的 8个基因片段重新
合成了完整的病毒粒子。研究发现，与现在流行的
H1N1人流感病毒相比，人工拯救的 1918流感病毒
在小鼠和鸡胚中表现出高度的致死性 [39-40]，在非人
灵长类感染试验中也同样证实了这一点 [41]。另外，
1918流感病毒与 H5N1禽流感病毒不同，它可以在
人群中广泛地传播。Kobasa等 [41]在之后的研究中
发现在合成的 1918流感病毒感染灵长类动物后，
宿主表现出抗病毒免疫反应失调及免疫保护不足等
现象，表明该病毒有调节宿主免疫反应的特性，感
染者非典型的固有免疫反应可能是 1918大流感高
致死性的原因之一。
提到 H5N1禽流感病毒的研究，基于反向遗传
生命科学 第23卷926
技术的病毒合成方法同样功不可没。自1996年以来，
高致病性 H5N1亚型的禽流感病毒对东南亚的家禽
种群造成了近乎毁灭性的疫情，给受影响的国家造
成了巨大的经济损失。然而与此同时，H5N1亚型
流感病毒对人类的真正威胁在于这种病毒一旦感染
人将会造成致死率超过 50%的呼吸系统疾病 [42-44]。
1997年，香港发生了 H5N1流感病毒感染人事件后
不久，美国、荷兰和英国的 3个实验室分别独立从
死者的分泌物中分离到 H5N1亚型的流感病毒 (A/
HongKong/156/97)[45]。根据该亚型的病毒在小鼠中
致病性，将分离毒株分为高致病性 [代表株 A/Hong
Kong/483/97(HK483)]和低致病性 [代表株 A/Hong
Kong/486/97(HK486)]两个毒力组 [46-47]。两种类型
的毒株也都被应用反向遗传方法重新合成出来。研
究者以 HK483为骨架，用 HK486的 8个基因中的
任意一个基因置换入 HK483；或反过来以 HK486
为骨架，以 HK483的基因依次进行置换，构建一
系列的基因重组病毒粒子，并用重组病毒感染小鼠
发现：HK486中的 PB2基因被 HK483的置换后，
可对小鼠形成高致病性；反之，则病毒毒力下降 [48]。
也就是说，在 HA具有多碱性氨基酸裂解序列的前
提下，PB2蛋白的 627位氨基酸的改变 (谷氨酸
Glu→赖氨酸 Lys)可以使 H5N1流感病毒对小鼠的
毒力产生从弱到强的变化。这些结果从分子水平上
揭示了 1997香港流感的致病机制。如此，应用反
向遗传 8质粒系统对毒株之间单个基因片段的相互
置换揭示了 PB2基因在 H5N1流感病毒在哺乳动物
致病性中的关键作用。还有一些反向遗传学研究进
一步证明流感病毒聚合酶复合体在病毒致病性中的
作用。例如，动物模型试验证明，聚合酶基因负责
H5N1禽流感病毒在人群中的致病性 [49]；PB2蛋白
的第 701位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺即可
使 H5N1病毒的毒力显著提高，而反向突变则使病
毒在小鼠中的毒力减弱 [50]。另外，反向遗传学研究
还发现了 NS1等病毒蛋白在 H5N1病毒致病性中的
作用。NS1蛋白是干扰素拮抗物，在抑制宿主细胞
的干扰素反应并保证正常病毒包装中发挥重要的作
用 [51]。H5N1禽流感病毒的 NS1蛋白的 92位是一
个谷氨酸 (Glu)，而其他亚型的流感病毒在这一位
点上几乎都是天冬氨酸 (Asp)。也正是 92位的 Glu
赋予了 NS1蛋白对干扰素 (IFN)和肿瘤坏死因子
(TNF-α)等抗病毒分子强烈的抑制作用。在将重组
了 H5N1的 NS基因的 H1N1流感病毒感染猪时，
出现了比野生 H1N1流感更强且更长时间的病毒血
症、发热以及体重减轻现象 [52]，从而部分解释了
H5N1流感病毒在人群中的高致病力机制。
流感病毒的细胞受体识别是由病毒表面的糖蛋
白血凝素 (hemagglutinin，HA)介导的。不同流感
病毒亚型的受体特异性以及宿主细胞上受体分布的
差异也导致了病毒间宿主范围的不同。比如，人流
感病毒与禽流感病毒识别的受体就有所差别：人流
感病毒 (如 H1N1亚型 )主要识别并结合的受体是
末端为唾液酸 α2,6连接半乳糖的唾液酸寡糖
(SAα2,6Gal)，主要存在于人的上呼吸道中；禽流感
病毒几乎都识别并结合末端为唾液酸 α2,3连接半
乳糖的唾液酸寡糖 (SAα2,3Gal)，主要存在于水禽
的呼吸道及消化道中 [8, 53-56]。因此，病毒宿主的种
属特异性使得 H5N1高致病禽流感病毒在人与人之
间的传播能力有限，这也是它不会在人群造成流感
大流行的原因之一。事实上，HA介导的流感病毒
受体识别是由 HA蛋白上的关键位点的氨基酸差异
决定的 [57]。2006年，Kawaoka等 [58]的一项反向遗
传学研究发现，在 HA蛋白中两个独立位点的突变
(Asn182→ Lys和 Gln192→ Arg)分别都可使 H5N1
禽流感病毒转为识别人类类型受体 (SAα2,6Gal)。
此外，研究者采用反向遗传技术结合 X射线晶体
学分析的方法更好地揭示了流感病毒受体识别特异
性及宿主致病性的奥秘。SAα2,3Gal类禽流感受体
存在于人类下呼吸道上皮细胞、肺泡和肺巨噬细胞
上 [59-60]。因此，H5N1等禽流感病毒感染只有达到
一定的量后才能深入这些部位。类似的进展也发生
在 1918流感病毒的研究中，Tumpey等 [61]也发现
在改变了 1918 H1N1流感病毒的 HA蛋白上的两个
氨基酸 (Asp225 → Gly，Asp190→ Glu)之后，导
致了病毒识别人类类型受体的能力增强。突变后的
病毒其受体结合的偏好性从 SAα2,6Gal改变成了
SAα2,3Gal。这些位点的突变让流感病毒的组织感
染范围由上呼吸道扩大到也能感染下呼吸道，同时
仍可保持其在上呼吸道的杀伤力和复制效率。这些
成果使人们对流感病毒感染特性的认识又推进了一
步。
神经氨酸酶 (neuraminidase，NA)是分布于流
感病毒囊膜表面的另一种糖蛋白，它具有抗原性，
可以催化唾液酸水解，因而又称唾液酸酶。与在
感染初期行使功能的 HA蛋白相反，NA蛋白主要
负责在病毒感染末期移去细胞受体末端与 HA结
合的唾液酸，协助成熟流感病毒脱离宿主细胞并
释放和迁移 [62]。所以，NA能防止病毒的聚集，
孙明伟，等：合成病毒：对流感病毒研究的贡献第9期 927
在流感病毒的感染周期中同样扮演了十分重要的
角色。NA的催化中心位于 NA头部的唾液酸结合
位点。目前，一些神经氨酸酶抑制型药物如扎那米
韦 (zanamivir)、奥塞米韦 (oseltamivir)等，就是根
据 NA及其底物的结构特点而设计合成的底物类似
物，通过竞争性结合病毒 NA保守的唾液酸结合位
点，抑制 NA的正常功能，发挥抗病毒疗效的 [63]。
2004年，加拿大的研究人员利用反向遗传系统分别
将 H1N1亚型的流感病毒 NA蛋白的两个氨基酸位
点突变 (His274→ Tyr，Glu119→ Gln)，拯救出两
株该亚型病毒的 NA突变株。但同时，Arg292→ Lys
和 Glu1l9→ Gly/Val/Ala/Asp的突变导致病毒不能
正常合成。空斑抑制试验及 NA抑制试验表明，与
野生型病毒相比，His274Tyr突变株对 oseltamivir的
抵抗力明显增强，但对 zanamivir仍然较敏感。而
Glu119Gln突变株只在 NA抑制试验中低水平抵抗
两种抑制剂 [64]。之后又发现 N1蛋白 Glu227Asp突
变能使流感病毒有效抵抗 zanamivir的抑制作用 [65]。
在对 H3N2亚型流感病毒 (A/Wuhan/359/95)引入
N2蛋白 Glu276Asp突变后，也会降低拯救出的病
毒对 oseltamivir和 zanamivir的敏感性 [66]。最新研
究还发现，研究者利用反向遗传方法将一株具有少
许飞沫传播能力的猪流感病毒 sw915(H1N2)的 NA
基因替换为 2009年大流行的甲型 H1N1流感病毒
的 NA基因后，虽然没有增加病毒的复制效率，但
是却显著地提高了其通过呼吸道飞沫传播的能力。
研究者得出结论，2009甲型 H1N1流感病毒的 NA
酶活性明显高于其他猪流感病毒，且表面糖蛋白
HA和 NA之间微妙的平衡可使流感病毒具备在人
与人间经飞沫传播的能力 [67]。以上这些具有重要意
义的研究进展都昭示着反向遗传技术在流感病毒研
究中的能力与贡献。
另一方面，在控制流感病毒的流行和暴发中，
免疫疫苗的接种一直是最行之有效的预防措施。反
向遗传技术的应用在病毒疫苗的开发和改进中也同
样是不可或缺的一部分。灭活病毒及减毒活疫苗都
已发展为流感疫苗的主要类型。每年，世界卫生组
织 (WHO)都会筛选出流感病毒在人群中流行的代
表株，用以生产流感疫苗。而反向遗传技术的问世
和发展为生产合适的病毒疫苗提供了条件与思路。
目前，流感灭活疫苗通常的研制原理是在另外 6条
病毒基因不变的情况下，将最近流行毒株的 HA与
NA基因与之重组并在鸡胚中生长。重组病毒纯化
后，经过甲醛或丙内酯处理形成全病毒制剂，或经
过乙醇或去垢剂处理而形成裂解疫苗，通过皮下或
肌肉注射刺激机体产生中和抗体。反向遗传学方法
在疫苗的生产中体现出许多优势。首先，与传统疫
苗株筛选方法相比，这种方法直接而合理。对于某
些获准的疫苗生产，要从大量具有不相关基因的重
组病毒中筛选出所要的疫苗株，其过程会十分繁琐。
而反向遗传学可以从人工设计的质粒中合成流感病
毒，正是解决这一问题的理想工具。其二，反向遗
传学使疫苗株的生产不再局限于鸡胚繁殖。以细胞
系培养为基础的流感疫苗正在迅速发展。与前者相
比，该系统可控性更强且生产周期短。而且一些如
H5N1等的高致病性禽流感疫苗在传代中可能会杀
死鸡胚，造成有限的病毒增殖。细胞系疫苗生产恰
好弥补了这一点。已有一些研究显示，在 MDCK
和 Vero等细胞系中生产的流感疫苗，其纯度和免
疫原性亦不亚于鸡胚生产的疫苗 [68-71]。另外，基于
细胞系的疫苗生产还可以消除那些非细胞系分离毒
株可能带来的污染或者其他病原体。其三，通过对
质粒进行人工操作，可以改造 HA、NA和其他影
响病毒毒力的基因，降低了疫苗生产者的安全风险
及生产成本；去除致病因子及免疫干扰因素，帮助
疫苗株更有效地产生中和抗体。
3　结语
反向遗传学操作从 20世纪 80年代创始到现在
20多年的时间内经历了不断改进而趋于完善的过
程，为流感病毒等的研究提供了更为方便快速的
手段和工具。反向遗传操作也作为合成生物学技
术手段的一种，让从基因到表型的研究设计思路
成为了现实并应用于实际。反向遗传技术的产生
和发展极大地推动了研究者对流感病毒的认识和
研究，使流感病毒的生命周期、组织嗜性、致病
机理、宿主特异性及疫苗研制等方面研究都取得
了突破性进展 [22]。这些进展与认识将在未来预测
新生突发流感病毒的流行性和致病性中发挥重要的
作用。而且，反向遗传技术已经不仅仅局限于应用
在流感疫苗生产以及流感大流行预测中，它同样在
其他类型的病毒研究中大显身手。可以说，没有反
向遗传学技术也不会有今天的这些成果。但在另一
方面，随着反向遗传技术和生物合成技术的日渐发
展，以及对病毒等微生物从基因到结构认识的不断
积累，在不久的将来人们很可能掌握人工制造高致
病性病原微生物的能力。这些危险的产物倘若从实
验室中无意或有意地流出，后果将不堪设想。因而，
生命科学 第23卷928
有关生物安全及生物防护等的评估和监管措施也是
十分必要的，这些也都需要同生物技术的发展相辅
并行。尽管如此，生物合成技术的发展和应用给科
学及社会所能带来的裨益人所共见。在合理的监督
和周密的设计下，我们期待合成病毒能在能源、环
境、公共健康领域为人类做出更大的贡献。
[参　考　文　献]
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