免费文献传递   相关文献

Simplified analysis and purification of paclitaxel and cephalomannine

分析紫杉醇与三尖杉宁碱的简易方法



全 文 :第 13卷第 2期
2015年 3月
生  物  加  工  过  程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol􀆰 13 No􀆰 2
Mar􀆰 2015
doi:10􀆰 3969 / j􀆰 issn􀆰 1672-3678􀆰 2015􀆰 02􀆰 016
收稿日期:2013-12-10
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)(2013CB733504);国家高技术研究发展计划(863计划)(2012AA021203)
作者简介:黄  艳(1987—),女,江苏灌南人,硕士研究生,研究方向:生物化工;郑  涛(联系人),教授,E⁃mail:hellozheng@ gmail.com
分析紫杉醇与三尖杉宁碱的简易方法
黄  艳1,刘晓宁1,方  芳1,徐  艳1,魏荣卿1,郑  涛2
(1􀆰 南京工业大学 生物与制药工程学院,江苏 南京 211800;
2􀆰 南京工业大学 生物能源研究所,江苏 南京 211800)
摘  要:以粒径单分散聚苯乙烯反相色谱填料为色谱柱固定相,即采用 MKF DK RP 型分析柱(300 mm×7􀆰 8
mm,8 μm),流动相为乙腈 水溶液,流速为 1􀆰 0 mL / min,检测波长为 229 nm,建立了一种分析紫杉醇与三尖杉宁碱
的简易方法。 结果表明,本方法可使紫杉醇与三尖杉宁碱达到有效分离,且紫杉醇的检测浓度在0􀆰 062 5 ~ 2􀆰 0
mg / mL范围内线性关系良好( r= 0􀆰 999 9)。 本方法简单,重复性好。
关键词:聚苯乙烯反相色谱填料;紫杉醇;三尖杉宁碱
中图分类号:O652􀆰 63        文献标志码:A        文章编号:1672-3678(2015)02-0081-05
Simplified analysis and purification of paclitaxel and cephalomannine
HUANG Yan1,LIU Xiaoning1,FANG Fang1,XU Yan1,WEI Qongqing1,ZHENG Tao2,
(1􀆰 College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China;
2􀆰 BioEnergy Institute,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)
Abstract:A simple analytical and purification method for paclitaxel and cephalomannine was developed
using the MKF⁃DK⁃RP analytical column (300 mm×7􀆰 8 mm,8 μm particle size) with monodisperse
polystyrene reverse⁃phase chromatography. The mobile phase was acetonitrile⁃water at a flow rate of 1􀆰 0
mL / min. The detection wavelength was 229 nm􀆰 Paclitaxel and cephalomannine could be effectively
purified.It could quantitatively analyze and purify paclitaxel in the range between 0􀆰 062 5 and 2􀆰 0
mg / mL( r= 0􀆰 999 9). The optimized process is easy to operate,and reproducible.
Keywords:polystyrene reverse⁃phase chromatography packing;Paclitaxel;Cephalomannine
    紫杉醇(paclitaxel,商品名 Taxol)是一种具有抗
癌生物活性的抗肿瘤药物,属于三环二萜类化合
物。 该化合物最早是 Wani 等[1] 从短叶红豆杉
(Taxus brevifolia)的树皮中分离得到。 它具有独特
的抗癌作用[2],对卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌以及
白血病、黑色素瘤等恶性肿瘤都具有良好的疗
效[3-4]。 近年来,它已成为肿瘤治疗领域中的热点
新药并得到了广泛关注,其市场需求量与日
俱增[5]。
紫杉醇作为一种天然产物,在原料中的含量低
微,平均含量约为 0􀆰 015%(质量分数)。 为此,人们
探索和研究了红豆杉植物的栽培、紫杉醇的化学合
成[6]、红豆杉植物的组织和细胞培养[7]以及微生物
发酵[8]等技术。 在上述方法中,通过植物的组织和
细胞培养或微生物发酵来获取紫杉醇,它们耗时
短、产量大且发酵液成分简单、易于紫杉醇的分离
提取等。 但是,在从培养的植物细胞以及微生物发
酵液中获得紫杉醇,需涉及紫杉醇与紫杉烷类化合
物的分离纯化问题,尤其是与三尖杉宁碱(仅 C 13
侧链末端的酰基基团)差 2 个碳原子的分离,难度
较大[9-12]。 因此,开发出一种高效、快捷、经济、实用
的提取纯化方法,对紫杉醇的产量和质量有着积极
的意义。
针对紫杉醇与三尖杉宁碱类紫杉烷类化合物
的分析分离,国内外虽有相关报道,但大多数都采
用的是以硅胶[13-15]基质为色谱柱的高效液相色谱
法(HPLC),而硅胶的不可逆吸附使样品损失较大,
且硅胶固定相只能使用一次,操作不便,价格昂贵。
刘开录等[16]报道了一种用多孔型聚苯乙烯 二乙烯
基苯高分子微球作固定相反相分离纯化紫杉醇的
工艺,即先将紫杉烷类化合物富集在固体吸附剂
上,再使用有机溶剂的水溶液进行洗脱,分步收集
馏分,浓缩后再次进行柱分离。 该工艺虽克服了正
相色谱法中硅胶填料对样品的不可逆吸附而造成
的回收率低以及柱寿命短等缺点,但该方法工艺过
程繁琐,且分离条件未进行优化。
本研究中,笔者选用粒径均匀且耐压、耐酸碱
的聚苯乙烯大孔吸附树脂填料装填的色谱柱,对含
有三尖杉宁碱和紫杉醇的发酵液进行洗脱条件优
化及分离纯化后的紫杉醇进行定量分析,并考察各
流动相条件对分析效果的影响。
1  实验部分
1􀆰 1  仪器与试剂
高效液相色谱仪:美国戴安高效液相色谱系
统,配备 P680 HPLC泵、UVD 170U 可变波长紫外
检测器,AT 330 柱温箱、8125 型进样装置;MKF
DK RP 型色谱柱(300 mm×7􀆰 8 mm,8 μm,南京麦
科菲高效分离载体有限公司)。
发酵液(紫杉醇含量为 33􀆰 3%、三尖杉宁碱含
量为 39􀆰 2%(以质量分数计)),南京麦科菲高效分
离载体有限公司;紫杉醇标准品(纯度为 93􀆰 7%)、
三尖杉宁碱标准品(纯度为 82􀆰 6%)、甲醇、乙腈(色
谱纯),美国 TEDIA公司;乙醇(分析纯),国药集团
化学试剂有限公司);超纯水,自制。
1􀆰 2  溶液的配制
标准品储备液  精密称取 20􀆰 0 mg紫杉醇和三
尖杉宁碱标准品置于 10 mL 容量瓶中,用甲醇溶液
定容。 得到 2􀆰 0 mg / mL 的紫杉醇和三尖杉宁碱标
准品混合液,用甲醇溶液分别稀释成浓度为 2􀆰 0、
1􀆰 0、0􀆰 5、0􀆰 25、0􀆰 125和 0􀆰 062 5 mg / mL的一系列的
标准工作溶液,绘制标准曲线。
供试品 1  移取发酵液 0􀆰 5 mL至 20 mL的容
量瓶中,以甲醇溶液定容至 20 mL,用 0􀆰 45 μm的有
机滤膜过滤,待测(现用现配)。
供试品 2   精密称取三尖杉宁碱标准品 10
mg,以甲醇溶液定容至 10 mL,用 0􀆰 45 μm的有机滤
膜过滤,待测(现用现配)。
供试品 3  精密称取紫杉醇标准品 10 mg,以
甲醇溶液定容至 10 mL,用 0􀆰 45 μm 的有机滤膜过
滤,待测(现用现配)。
1􀆰 3  色谱条件
流动相为 A(超纯水)、B(乙醇)、C(乙腈),流
速为 1􀆰 0 mL / min,进样量为 20 μL,检测温度为室
温;检测波长为 229 nm。
2  结果与讨论
2􀆰 1  流动相的选择
以供试品 1为研究对象,考察流动相种类及比
例对紫杉醇和三尖杉宁碱分离纯化的影响。 由文
献可知,可用甲醇 水[17]、乙醇 水[18]或乙腈 水[19]
体系对紫杉醇与三尖杉宁碱进行色谱分析。 笔者
分别对该 3种流动相体系作了系统适应性实验,有
机相浓度均为 60%,结果见图 1。
图 1  不同流动相体系下样品的高效液相色谱图
Fig􀆰 1  The test sample under different mobile phase
systems by chromatograms of HPLC
由图 1可知:甲醇 水作为洗脱溶剂,样品在 60
min还未出峰;乙醇 水体系的分析周期约为 60
min,分离度为 1􀆰 26;乙腈 水体系的分析周期最短
(25 min),且分离度最好(1􀆰 67)。 目前,文献中多
以硅胶 C18[20-22]分离纯化紫杉醇与三尖杉宁碱,但
其分离度仅以 1􀆰 2为标准来衡量。
采用该乙腈 水色谱条件,用紫杉醇和三尖杉宁
28 生  物  加  工  过  程    第 13卷 
碱的标准品对照定性,并对紫杉醇和三尖杉宁碱进
行检测。 供试品 1、供试品 2(三尖杉宁碱标准
品)和供试品 3(紫杉醇标准品)的液相色谱图见
图 2。
图 2  供试品 1至 3样品的高效液相色谱
Fig􀆰 2  The test samples of 1⁃3 by chromatograms
of HPLC
由图 2可知,在该色谱洗脱条件下,三尖杉宁碱
和紫杉醇的保留时间分别为 19􀆰 64 min 和 22􀆰 34
min。 与药典中的检测方法相比,药典中采用梯度洗
脱法,不仅洗脱程序复杂,且三尖杉宁碱和紫杉醇
的保留时间分别为 25􀆰 64 min 和 27􀆰 44 min,分析周
期长且分离度(1􀆰 46)差。 故乙腈 水色谱条件可用
于后文紫杉醇纯品的检测。
2􀆰 2  标准曲线和线性范围
精密吸取不同质量浓度(2􀆰 0、1􀆰 0、0􀆰 5、0􀆰 25、
0􀆰 125和 0􀆰 062 5 mg / mL)的紫杉醇和三尖杉宁碱溶
液,采用 2􀆰 1 节乙腈 水色谱条件,进行检测。 以紫
杉醇和三尖杉宁碱的峰面积为纵坐标,浓度为横坐
标,绘制紫杉醇和三尖杉宁碱的标准曲线并进行线
性回归计算,得到回归方程和线性相关系数,结果
见表 1。 由表 1 可知,紫杉醇和三尖杉宁碱标准品
在 0􀆰 062 5~2􀆰 0 mg / mL范围内呈良好线性关系。
表 1  紫杉醇和三尖杉宁碱的线性范围、回归方程
和线性相关系数
Table 1  Linear ranges,regression equation and correlation
coefficient of paxlitaxel and cephalom
化合物 线性范围 /(mg·mL-1) 回归方程
线性相
关系数
紫杉醇 0􀆰 062 5~2􀆰 0 Y= 498􀆰 75x+3􀆰 181 0􀆰 999 9
三尖杉宁碱 0􀆰 062 5~2􀆰 0 Y= 414􀆰 17x+1􀆰 637 9 0􀆰 999 8
2􀆰 3  样品在乙腈 水体系中的洗脱规律探讨
以乙腈 水为流动相,对紫杉醇和三尖杉宁碱混
合样进行色谱分析,通过改变流动相中有机相与水
的比例实现紫杉醇与三尖杉宁碱的有效分离,并探
索其中流动相与 2 种物质洗脱速率和分离度的
规律。
2􀆰 3􀆰 1  乙腈洗脱浓度范围的确定
分别以 40%、45%、55%和 60% (乙腈体积分
数)的乙腈 水为流动相,对供试品 1 进行等度洗
脱。 由结果可知,在 40%~60%乙腈浓度范围内,供
试品 1都能被洗脱出来,说明该浓度范围的乙腈
水体系流动相能实现紫杉醇和三尖杉宁碱的洗脱;
随着洗脱溶液中乙腈的含量增加,样品出峰趋快,
分离度却变差,不能达到物质分离要求。 因此,仅
依赖于等度洗脱尚不能实现紫杉醇和三尖杉宁碱
的有效分离。 为此,接下来在 40% ~ 60%乙腈浓度
范围内进行梯度洗脱优化,以期实现紫杉醇与三尖
杉宁碱的更佳分离。
2􀆰 3􀆰 2  乙腈梯度洗脱条件优化
采用分段梯度洗脱法,分别对各阶段的洗脱时
间和浓度进行优化,以实现紫杉醇与三尖杉宁碱的
有效分离。 将分离条件模式分为“前段”,即前段高
浓度将样品较快地冲入色谱柱内;“中段”,即中段
低浓度以延迟紫杉醇的出峰时间,提高分离度;“后
段”,即后段高浓度将紫杉醇快速洗脱出来,以缩短
分析周期。 样品洗脱结果见图 3和表 2。
图 3  乙腈梯度洗脱条件下的高效液相色谱
Fig􀆰 3  HPLC chromatograms of sample
由梯度洗脱条件 1 和 2 比较可知,前段的洗脱
条件相同,延长梯度变化(60% ~ 50%)洗脱时间,条
件 1比 2出峰时间晚,说明流动相洗脱浓度越低,出
峰时间越晚;条件 1 和 2 中紫杉醇出峰时间相差不
大,但条件 1中的三尖杉宁碱出峰较晚,说明前段的
乙腈洗脱浓度主要影响三尖杉宁碱的出峰时间;与
条件 1相比,条件 2中的 40%乙腈等度洗脱时间长,
分离度得到改善,但三尖杉宁碱峰型拖尾严重,说
38  第 2期 黄  艳等:分析紫杉醇与三尖杉宁碱的简易方法
明中段 40%乙腈洗脱时间不宜过长。 由梯度洗脱
条件 1和 3比较可知,延长前段(3 ~ 5 min)洗脱时
间,条件 3 的梯度条件变化简单,即采用 24 min 将
乙腈浓度由 45%升至 60%的线性洗脱,出峰时间提
前,分离度提高,说明中段洗脱采用线性梯度洗脱
更有利于紫杉醇和三尖杉宁碱的分离。 由梯度洗
脱条件 3和 4比较可知,前段洗脱条件相同,而条件
4中的线性洗脱,乙腈浓度由 40%升至 60%,出峰时
间稍晚,但分离度提高,说明线性梯度洗脱,乙腈浓
度由 40%升至 60%,能够实现紫杉醇和三尖杉宁碱
的有效分离。
表 2  乙腈梯度洗脱的分离参数
Table 2  Separation parameters of different gradient elution of acetonitrile
序号 梯度洗脱条件
分离参数
保留时间 / min
三尖杉宁碱 紫杉醇
分离度
1 0~3 min,60%C;3~8 min,60%~40%C;8~23 min,40%C;23~30 min,40%~60%C 41􀆰 28 52􀆰 41 1􀆰 52
2 0~3 min,60%C;3~13 min,60%~40%C;13~40 min,40%C;40~50 min,40~60%C 35􀆰 58 48􀆰 77 1􀆰 46
3 0~5 min,60%C;5~6 min,60%~45%C;6~30 min,45~60%C;30~60 min,60%C 20􀆰 39 25􀆰 56 1􀆰 82
4 0~5 min,60%C;5~6 min,60%~40%C;6~36 min,40~60%C;36~60 min,60%C 28􀆰 82 34􀆰 37 2􀆰 08
2􀆰 4  紫杉醇的含量分析
收集梯度洗脱条件 4 下的紫杉醇峰物质样品
(记为紫杉醇纯品),将其浓缩后在 2􀆰 1 节乙腈 水
色谱条件下进行含量分析,结果见图 4。
图 4  供试品 1和紫杉醇纯品的高效液相色谱
Fig􀆰 4  HPLC chromatograms of the test
sample⁃1 and paclitaxel
由图 4可知,经紫杉醇标准浓度曲线的定量,供
试品 1中紫杉醇的纯度为 33􀆰 32%,纯化后得到的
紫杉醇纯品的纯度为 98􀆰 65%,即除去了原料液中
几乎全部的色素和绝大部分杂质。 说明样品经乙
腈 水流动相分段梯度洗脱后,三尖杉宁碱与紫杉醇
达到了有效分离,且经定量分析,紫杉醇的回收率
可达到 86%。 该法可为今后紫杉醇的工业化生产
提供有力的实验和理论依据。
3  结论
采用聚苯乙烯基质色谱柱(MKF DK RP),
以乙腈 水为流动相,对含有紫杉醇和三尖杉宁碱的
发酵液样品进行洗脱条件优化并将分离纯化后的
紫杉醇进行含量分析。 经过对样品的洗脱条件优
化后,采用分段梯度洗脱法,可将紫杉醇与三尖杉
宁碱有效分离,且经标准浓度曲线的定量,得到纯
度为 98􀆰 65%的紫杉醇纯品,除去了原料液中几乎
全部的色素和绝大部分杂质,这给紫杉醇的分离纯
化向工业化方向发展提供了有力的理论和实验依
据,具有重要的参考价值。
参考文献:
[ 1 ]   Wani M C,Taylor H L,Wall M E,et al.Plant antitumor agents:
VI. isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and
antitumor agent from Taxus brevifolia[J] .J Am Chem Soc,1971,
93(9):2325⁃2327.
[ 2 ]   杨磊,樊红.紫杉类抗肿瘤药物的临床应用进展[J] .中国医院
用药评价与分析,2004,61(1):105⁃113.
[ 3 ]   Guo W,Johnson J L,Khan S. Paclitaxel quantification in mouse
plasma and tissues containing liposome⁃entrapped paclitaxel by
liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry:application to a
pharmacokinetics study [ J ] . Anal Biochem, 2005, 336 ( 2 ):
213⁃220.
48 生  物  加  工  过  程    第 13卷 
[ 4 ]  Navia⁃Osorio A, Garden H, Cusidó R M, et al. Taxol􀳏 and
baccatin III production in suspension cultures of Taxus baccata
and Taxus wallichiana in an airlift bioreactor[J] .J Plant Physiol,
2002,159(1):97⁃102
[ 5 ]   施树云,钟世安,周春山.高效液相色谱测定湖南红豆杉中紫
杉醇的含量[J] .药物分析杂志,2004,24(5):552⁃553
[ 6 ]   Mendoza A,Ishihara Y,Baran P S.Scalable enantioselective total
synthesis of taxanes[J] .Nature Chem,2012,4:21⁃25.
[ 7 ]   Zhong J J.Plant cell culture for production of paclitaxel and other
taxanes[J] .J Biosci Bioeng,2002,94(6):591⁃599.
[ 8 ]   Ji Y,Bi J N,Yan B,et al.Taxol⁃producing fungi:a new approach
to industrial production of taxol[ J] .Chin J Biotechnol,2006,22
(1):1⁃6.
[ 9 ]   Zhang J,Yang C F,Yuan K. Simultaneous determination of 10⁃
deacetylbaccatin,cephalomannine and taxol in different parts of
Taxus media with different growth years by UPLC [ J ] . Appl
Mechan Mat,2012,108(12):326⁃330.
[10]   Kang S H,Kim J H,Mun S.Optimal design of a tandem simulated
moving bed process for separation of paclitaxel, 13⁃
dehydroxybaccatin III, and 10⁃deacetylpaclitaxel [ J ] . Process
Biochem,2010,45(9):1468⁃1476.
[11]   Dong H R, Lou L N, Bi P Y, et al. Determination of taxol,
cephalomannine and 7⁃epi⁃taxol in Taxus by PRP⁃6 solid phase
extraction and high performance liquid chromatography[ J] .Anal
Lett,2005,38(6):929⁃937.
[12]   Sim H A,Lee J Y,Kim J H. Evaluation of a high surface area
acetone / pentane precipitation process for the purification of
paclitaxel from plant cell cultures[ J] . Sep Purif Technol,2012,
89(22):112⁃116.
[13]   李志良,骆雪兰,谢维权,等.从中国红豆杉细胞培养物中分
离鉴定紫杉醇 [ J] .天然产物研究与开发, 2003, 15 ( 5):
433⁃440.
[14]   雒丽娜,董慧茹,张建军,等.正相色谱和反相色谱法分离提
纯东北红豆杉中紫杉醇和三尖杉宁碱[ J] .分析科学学报,
2003,19(5):517⁃521.
[15]   李智,韩静,吴娅征,等.RP HPLC 凝胶分离法测定紫杉醇
纳米微乳的包封率[J] .药物分析杂志,2008,28(5):772⁃775.
[16]   刘开录,杨雪峰.制备液相色谱法分离提取紫杉醇及其类似
物:中国,1140170A[P].2011⁃07⁃06.
[17]   赵芳,耿征,刘谦光,等.用反相高效液相色谱法测定南方红
豆杉组织培养产物中的紫杉醇[ J] .分析化学,1997,25(8):
941⁃943.
[18]   Mun S,Linda Wang N H.Optimization of productivity in solvent
gradient simulated moving bed for paclitaxel purification [ J] .
Process Biochem,2008,43(12):1407⁃1418.
[19]   张静,廖海兵,金永春,等.UPLC法同时测定曼地亚红豆杉中
3个有效成分的含量 [ J] .药物分析杂志, 2011, 31 ( 11):
2073⁃2077.
[20]   张志强,王云山,田桂莲,等.C18 硅胶的原位合成及其作为常
压层析介质在紫杉醇分离纯化中的应用[ J] .化学反应工程
与工艺,2000,16(3):281⁃285.
[21]   Watchueng J,Kamnaing P,Gao J M,et al.Efficient purification of
paclitaxel from yews using high⁃performance displacement
chromatography technique[ J] . J Chromatogr A,2011,218(20):
2929⁃2935.
[22]   Wang Chuangui, Wu Jianyong, Mei Xingguo. Enhancement of
Taxol production and excretion in Taxus chinensis cell culture by
fungal elicitation and medium renewal [ J ] . Appl Microbiol
Biotechnol,2001,55:404⁃410.
(责任编辑  荀志金)
58  第 2期 黄  艳等:分析紫杉醇与三尖杉宁碱的简易方法