全 文 :第 13卷第 2期
2015年 3月
生 物 加 工 过 程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol 13 No 2
Mar 2015
doi:10 3969 / j issn 1672-3678 2015 02 016
收稿日期:2013-12-10
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)(2013CB733504);国家高技术研究发展计划(863计划)(2012AA021203)
作者简介:黄 艳(1987—),女,江苏灌南人,硕士研究生,研究方向:生物化工;郑 涛(联系人),教授,E⁃mail:hellozheng@ gmail.com
分析紫杉醇与三尖杉宁碱的简易方法
黄 艳1,刘晓宁1,方 芳1,徐 艳1,魏荣卿1,郑 涛2
(1 南京工业大学 生物与制药工程学院,江苏 南京 211800;
2 南京工业大学 生物能源研究所,江苏 南京 211800)
摘 要:以粒径单分散聚苯乙烯反相色谱填料为色谱柱固定相,即采用 MKF DK RP 型分析柱(300 mm×7 8
mm,8 μm),流动相为乙腈 水溶液,流速为 1 0 mL / min,检测波长为 229 nm,建立了一种分析紫杉醇与三尖杉宁碱
的简易方法。 结果表明,本方法可使紫杉醇与三尖杉宁碱达到有效分离,且紫杉醇的检测浓度在0 062 5 ~ 2 0
mg / mL范围内线性关系良好( r= 0 999 9)。 本方法简单,重复性好。
关键词:聚苯乙烯反相色谱填料;紫杉醇;三尖杉宁碱
中图分类号:O652 63 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2015)02-0081-05
Simplified analysis and purification of paclitaxel and cephalomannine
HUANG Yan1,LIU Xiaoning1,FANG Fang1,XU Yan1,WEI Qongqing1,ZHENG Tao2,
(1 College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China;
2 BioEnergy Institute,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)
Abstract:A simple analytical and purification method for paclitaxel and cephalomannine was developed
using the MKF⁃DK⁃RP analytical column (300 mm×7 8 mm,8 μm particle size) with monodisperse
polystyrene reverse⁃phase chromatography. The mobile phase was acetonitrile⁃water at a flow rate of 1 0
mL / min. The detection wavelength was 229 nm Paclitaxel and cephalomannine could be effectively
purified.It could quantitatively analyze and purify paclitaxel in the range between 0 062 5 and 2 0
mg / mL( r= 0 999 9). The optimized process is easy to operate,and reproducible.
Keywords:polystyrene reverse⁃phase chromatography packing;Paclitaxel;Cephalomannine
紫杉醇(paclitaxel,商品名 Taxol)是一种具有抗
癌生物活性的抗肿瘤药物,属于三环二萜类化合
物。 该化合物最早是 Wani 等[1] 从短叶红豆杉
(Taxus brevifolia)的树皮中分离得到。 它具有独特
的抗癌作用[2],对卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌以及
白血病、黑色素瘤等恶性肿瘤都具有良好的疗
效[3-4]。 近年来,它已成为肿瘤治疗领域中的热点
新药并得到了广泛关注,其市场需求量与日
俱增[5]。
紫杉醇作为一种天然产物,在原料中的含量低
微,平均含量约为 0 015%(质量分数)。 为此,人们
探索和研究了红豆杉植物的栽培、紫杉醇的化学合
成[6]、红豆杉植物的组织和细胞培养[7]以及微生物
发酵[8]等技术。 在上述方法中,通过植物的组织和
细胞培养或微生物发酵来获取紫杉醇,它们耗时
短、产量大且发酵液成分简单、易于紫杉醇的分离
提取等。 但是,在从培养的植物细胞以及微生物发
酵液中获得紫杉醇,需涉及紫杉醇与紫杉烷类化合
物的分离纯化问题,尤其是与三尖杉宁碱(仅 C 13
侧链末端的酰基基团)差 2 个碳原子的分离,难度
较大[9-12]。 因此,开发出一种高效、快捷、经济、实用
的提取纯化方法,对紫杉醇的产量和质量有着积极
的意义。
针对紫杉醇与三尖杉宁碱类紫杉烷类化合物
的分析分离,国内外虽有相关报道,但大多数都采
用的是以硅胶[13-15]基质为色谱柱的高效液相色谱
法(HPLC),而硅胶的不可逆吸附使样品损失较大,
且硅胶固定相只能使用一次,操作不便,价格昂贵。
刘开录等[16]报道了一种用多孔型聚苯乙烯 二乙烯
基苯高分子微球作固定相反相分离纯化紫杉醇的
工艺,即先将紫杉烷类化合物富集在固体吸附剂
上,再使用有机溶剂的水溶液进行洗脱,分步收集
馏分,浓缩后再次进行柱分离。 该工艺虽克服了正
相色谱法中硅胶填料对样品的不可逆吸附而造成
的回收率低以及柱寿命短等缺点,但该方法工艺过
程繁琐,且分离条件未进行优化。
本研究中,笔者选用粒径均匀且耐压、耐酸碱
的聚苯乙烯大孔吸附树脂填料装填的色谱柱,对含
有三尖杉宁碱和紫杉醇的发酵液进行洗脱条件优
化及分离纯化后的紫杉醇进行定量分析,并考察各
流动相条件对分析效果的影响。
1 实验部分
1 1 仪器与试剂
高效液相色谱仪:美国戴安高效液相色谱系
统,配备 P680 HPLC泵、UVD 170U 可变波长紫外
检测器,AT 330 柱温箱、8125 型进样装置;MKF
DK RP 型色谱柱(300 mm×7 8 mm,8 μm,南京麦
科菲高效分离载体有限公司)。
发酵液(紫杉醇含量为 33 3%、三尖杉宁碱含
量为 39 2%(以质量分数计)),南京麦科菲高效分
离载体有限公司;紫杉醇标准品(纯度为 93 7%)、
三尖杉宁碱标准品(纯度为 82 6%)、甲醇、乙腈(色
谱纯),美国 TEDIA公司;乙醇(分析纯),国药集团
化学试剂有限公司);超纯水,自制。
1 2 溶液的配制
标准品储备液 精密称取 20 0 mg紫杉醇和三
尖杉宁碱标准品置于 10 mL 容量瓶中,用甲醇溶液
定容。 得到 2 0 mg / mL 的紫杉醇和三尖杉宁碱标
准品混合液,用甲醇溶液分别稀释成浓度为 2 0、
1 0、0 5、0 25、0 125和 0 062 5 mg / mL的一系列的
标准工作溶液,绘制标准曲线。
供试品 1 移取发酵液 0 5 mL至 20 mL的容
量瓶中,以甲醇溶液定容至 20 mL,用 0 45 μm的有
机滤膜过滤,待测(现用现配)。
供试品 2 精密称取三尖杉宁碱标准品 10
mg,以甲醇溶液定容至 10 mL,用 0 45 μm的有机滤
膜过滤,待测(现用现配)。
供试品 3 精密称取紫杉醇标准品 10 mg,以
甲醇溶液定容至 10 mL,用 0 45 μm 的有机滤膜过
滤,待测(现用现配)。
1 3 色谱条件
流动相为 A(超纯水)、B(乙醇)、C(乙腈),流
速为 1 0 mL / min,进样量为 20 μL,检测温度为室
温;检测波长为 229 nm。
2 结果与讨论
2 1 流动相的选择
以供试品 1为研究对象,考察流动相种类及比
例对紫杉醇和三尖杉宁碱分离纯化的影响。 由文
献可知,可用甲醇 水[17]、乙醇 水[18]或乙腈 水[19]
体系对紫杉醇与三尖杉宁碱进行色谱分析。 笔者
分别对该 3种流动相体系作了系统适应性实验,有
机相浓度均为 60%,结果见图 1。
图 1 不同流动相体系下样品的高效液相色谱图
Fig 1 The test sample under different mobile phase
systems by chromatograms of HPLC
由图 1可知:甲醇 水作为洗脱溶剂,样品在 60
min还未出峰;乙醇 水体系的分析周期约为 60
min,分离度为 1 26;乙腈 水体系的分析周期最短
(25 min),且分离度最好(1 67)。 目前,文献中多
以硅胶 C18[20-22]分离纯化紫杉醇与三尖杉宁碱,但
其分离度仅以 1 2为标准来衡量。
采用该乙腈 水色谱条件,用紫杉醇和三尖杉宁
28 生 物 加 工 过 程 第 13卷
碱的标准品对照定性,并对紫杉醇和三尖杉宁碱进
行检测。 供试品 1、供试品 2(三尖杉宁碱标准
品)和供试品 3(紫杉醇标准品)的液相色谱图见
图 2。
图 2 供试品 1至 3样品的高效液相色谱
Fig 2 The test samples of 1⁃3 by chromatograms
of HPLC
由图 2可知,在该色谱洗脱条件下,三尖杉宁碱
和紫杉醇的保留时间分别为 19 64 min 和 22 34
min。 与药典中的检测方法相比,药典中采用梯度洗
脱法,不仅洗脱程序复杂,且三尖杉宁碱和紫杉醇
的保留时间分别为 25 64 min 和 27 44 min,分析周
期长且分离度(1 46)差。 故乙腈 水色谱条件可用
于后文紫杉醇纯品的检测。
2 2 标准曲线和线性范围
精密吸取不同质量浓度(2 0、1 0、0 5、0 25、
0 125和 0 062 5 mg / mL)的紫杉醇和三尖杉宁碱溶
液,采用 2 1 节乙腈 水色谱条件,进行检测。 以紫
杉醇和三尖杉宁碱的峰面积为纵坐标,浓度为横坐
标,绘制紫杉醇和三尖杉宁碱的标准曲线并进行线
性回归计算,得到回归方程和线性相关系数,结果
见表 1。 由表 1 可知,紫杉醇和三尖杉宁碱标准品
在 0 062 5~2 0 mg / mL范围内呈良好线性关系。
表 1 紫杉醇和三尖杉宁碱的线性范围、回归方程
和线性相关系数
Table 1 Linear ranges,regression equation and correlation
coefficient of paxlitaxel and cephalom
化合物 线性范围 /(mg·mL-1) 回归方程
线性相
关系数
紫杉醇 0 062 5~2 0 Y= 498 75x+3 181 0 999 9
三尖杉宁碱 0 062 5~2 0 Y= 414 17x+1 637 9 0 999 8
2 3 样品在乙腈 水体系中的洗脱规律探讨
以乙腈 水为流动相,对紫杉醇和三尖杉宁碱混
合样进行色谱分析,通过改变流动相中有机相与水
的比例实现紫杉醇与三尖杉宁碱的有效分离,并探
索其中流动相与 2 种物质洗脱速率和分离度的
规律。
2 3 1 乙腈洗脱浓度范围的确定
分别以 40%、45%、55%和 60% (乙腈体积分
数)的乙腈 水为流动相,对供试品 1 进行等度洗
脱。 由结果可知,在 40%~60%乙腈浓度范围内,供
试品 1都能被洗脱出来,说明该浓度范围的乙腈
水体系流动相能实现紫杉醇和三尖杉宁碱的洗脱;
随着洗脱溶液中乙腈的含量增加,样品出峰趋快,
分离度却变差,不能达到物质分离要求。 因此,仅
依赖于等度洗脱尚不能实现紫杉醇和三尖杉宁碱
的有效分离。 为此,接下来在 40% ~ 60%乙腈浓度
范围内进行梯度洗脱优化,以期实现紫杉醇与三尖
杉宁碱的更佳分离。
2 3 2 乙腈梯度洗脱条件优化
采用分段梯度洗脱法,分别对各阶段的洗脱时
间和浓度进行优化,以实现紫杉醇与三尖杉宁碱的
有效分离。 将分离条件模式分为“前段”,即前段高
浓度将样品较快地冲入色谱柱内;“中段”,即中段
低浓度以延迟紫杉醇的出峰时间,提高分离度;“后
段”,即后段高浓度将紫杉醇快速洗脱出来,以缩短
分析周期。 样品洗脱结果见图 3和表 2。
图 3 乙腈梯度洗脱条件下的高效液相色谱
Fig 3 HPLC chromatograms of sample
由梯度洗脱条件 1 和 2 比较可知,前段的洗脱
条件相同,延长梯度变化(60% ~ 50%)洗脱时间,条
件 1比 2出峰时间晚,说明流动相洗脱浓度越低,出
峰时间越晚;条件 1 和 2 中紫杉醇出峰时间相差不
大,但条件 1中的三尖杉宁碱出峰较晚,说明前段的
乙腈洗脱浓度主要影响三尖杉宁碱的出峰时间;与
条件 1相比,条件 2中的 40%乙腈等度洗脱时间长,
分离度得到改善,但三尖杉宁碱峰型拖尾严重,说
38 第 2期 黄 艳等:分析紫杉醇与三尖杉宁碱的简易方法
明中段 40%乙腈洗脱时间不宜过长。 由梯度洗脱
条件 1和 3比较可知,延长前段(3 ~ 5 min)洗脱时
间,条件 3 的梯度条件变化简单,即采用 24 min 将
乙腈浓度由 45%升至 60%的线性洗脱,出峰时间提
前,分离度提高,说明中段洗脱采用线性梯度洗脱
更有利于紫杉醇和三尖杉宁碱的分离。 由梯度洗
脱条件 3和 4比较可知,前段洗脱条件相同,而条件
4中的线性洗脱,乙腈浓度由 40%升至 60%,出峰时
间稍晚,但分离度提高,说明线性梯度洗脱,乙腈浓
度由 40%升至 60%,能够实现紫杉醇和三尖杉宁碱
的有效分离。
表 2 乙腈梯度洗脱的分离参数
Table 2 Separation parameters of different gradient elution of acetonitrile
序号 梯度洗脱条件
分离参数
保留时间 / min
三尖杉宁碱 紫杉醇
分离度
1 0~3 min,60%C;3~8 min,60%~40%C;8~23 min,40%C;23~30 min,40%~60%C 41 28 52 41 1 52
2 0~3 min,60%C;3~13 min,60%~40%C;13~40 min,40%C;40~50 min,40~60%C 35 58 48 77 1 46
3 0~5 min,60%C;5~6 min,60%~45%C;6~30 min,45~60%C;30~60 min,60%C 20 39 25 56 1 82
4 0~5 min,60%C;5~6 min,60%~40%C;6~36 min,40~60%C;36~60 min,60%C 28 82 34 37 2 08
2 4 紫杉醇的含量分析
收集梯度洗脱条件 4 下的紫杉醇峰物质样品
(记为紫杉醇纯品),将其浓缩后在 2 1 节乙腈 水
色谱条件下进行含量分析,结果见图 4。
图 4 供试品 1和紫杉醇纯品的高效液相色谱
Fig 4 HPLC chromatograms of the test
sample⁃1 and paclitaxel
由图 4可知,经紫杉醇标准浓度曲线的定量,供
试品 1中紫杉醇的纯度为 33 32%,纯化后得到的
紫杉醇纯品的纯度为 98 65%,即除去了原料液中
几乎全部的色素和绝大部分杂质。 说明样品经乙
腈 水流动相分段梯度洗脱后,三尖杉宁碱与紫杉醇
达到了有效分离,且经定量分析,紫杉醇的回收率
可达到 86%。 该法可为今后紫杉醇的工业化生产
提供有力的实验和理论依据。
3 结论
采用聚苯乙烯基质色谱柱(MKF DK RP),
以乙腈 水为流动相,对含有紫杉醇和三尖杉宁碱的
发酵液样品进行洗脱条件优化并将分离纯化后的
紫杉醇进行含量分析。 经过对样品的洗脱条件优
化后,采用分段梯度洗脱法,可将紫杉醇与三尖杉
宁碱有效分离,且经标准浓度曲线的定量,得到纯
度为 98 65%的紫杉醇纯品,除去了原料液中几乎
全部的色素和绝大部分杂质,这给紫杉醇的分离纯
化向工业化方向发展提供了有力的理论和实验依
据,具有重要的参考价值。
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(责任编辑 荀志金)
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