全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 && 月
生"物"加"工"过"程
*cF/3! 8F3#
8FM3$%&%
DFC"&%37#7 ,^3C11L3$ ?#6!3$%&%3%#3%%!
收稿日期"$%&% ?%# ?&!
基金项目"中国科学院科研装备研制项目$UR$%%706%&中国科学院知识创新工程重要方向项目$)]*P$-U[-4-$%
作者简介"徐"玲$&7!%%#女#河北邢台人#博士研究生#研究方向"藻类培养&李华钟$联系人%#教授#Z-J@C/" <;布朗葡萄藻的培养基选择及其产物代谢规律
徐"玲&#$#刘春朝$#李华钟&
$&3江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室#无锡 $&0&$$&
$3中国科学院 过程工程研究所 生化工程国家重点实验室#北京 &%%&7%%
摘"要"通过对布朗葡萄藻分别在*反应器中 *&g!$ X,N和 (!g6f&棕榈酸)油酸和亚麻酸是布朗葡萄藻的主要脂肪酸组成#*比例最高( *烃产量达到最大值 &g%6 X,N#不同生长周期烃的组成保持一致#布朗葡萄藻的烃主要由*

S
(#
和*
0
S
(!
组成&在布
朗葡萄藻生长周期中#不饱和脂肪酸的比例显著上升#培养 &( D达到 #0f以上(
关键词"布朗葡萄藻&烃&代谢
中图分类号"9#0(g$&""""文献标志码".""""文章编号"$ ?#6!$$%&%%%# ?%%0% ?%#
\0G.3I1060:F.2/276&/*+&1&11()7*,(0$5/G.F1I0F5J26.:I0:-5/.1I
PTNCLX
&#$
#NOT*$
#NOSG@-;&
$&3)HKN@:FE@BFEKFIOLDG1BEC@/`CFBHA[GbC$&0&$$#***J1F45:F"QHDCGJ1H/HABCFL FI8(7&*(+(++/-9&#/2$8:9&#/2% _@1A@ECHD FGBCL B@ABFE358:9&#/23*BBCFL35GL1@BGE@BHD I@BK@ACD 2EF2FEBCFL FIJCAEF@/X@/:CFJ@11CL *V`-&&35AEGDHJGJFI&g%6 X,N@IBHE&( D AFEH12FLDCLX/K35AFL1C1BHLBDGECLXB
S
(#
@LD *
0
S
(!
34H1G/B1
1_@1JFEHB<@L #0f @IBHE&( D3
M0K N24G1"8(7&*(+(++/-9&#/2&""微藻是水生植物的一种#其特有的化学组成和
结构决定了它是获得生物柴油和生物质油的优良
原料*&+ ( 利用微藻生产可再生能源具有分布广泛)
生长周期短)生物量大)光合效率高)易培养)可以
保持碳平衡等优点*$+ #因此#利用微藻制备生物燃
料具有广阔的开发利用前景(
布朗葡萄藻$8(7&*(+(++/-9&#/2#又名丛粒藻#
俗称油藻%是一种呈串状集落生的淡水单细胞绿
藻#产烃量占细胞干质量的&(fi!#f*+ #远远高于
其他微生物的产烃量#布朗葡萄藻所产烃的组成和
结构与石油极其相似*0 ?(+ #并且油脂组成中不含 ]
元素#产烃平均热值较高#燃烧时不排放有害有毒
气体#有利于生态环境#因此研究布朗葡萄藻生产
生物燃料具有重要意义(
目前#关于布朗葡萄藻产烃还没有大规模培养
的报道#其主要问题之一在于布朗葡萄藻生长缓
慢#培养时间长( 近几年来#国内研究人员为了缩
短布朗葡萄藻培养时间)提高生长速率#进行了布
朗葡萄藻培养基种类的选择*#+ )培养基营养条件的
优化*6 ?&%+ )环境因子对光合作用的影响*&&+和分批
补料 培 养*&$+ # 这 些 研 究 大 都 处 于 摇 瓶 培 养
阶段*# ?&&+ (
笔者在气升式光照生物反应器中进行布朗葡
萄藻培养基选择的研究#考察合适培养基条件下布
朗葡萄藻产物代谢规律#并对布朗葡萄藻主要代谢
产物的成分进行分析(
D?材料与方法
D=D?菌种及培养基
8(7&*(+(++/-9&#/2#4@AH`为实验室保藏#培
养基为改良的 *V` && 培养基*&+ (
D=B?气升式光照生物反应器
气升式光照生物反应器由罐体)导流筒)气体
分布器组成#罐体主体为耐热耐压的硼硅玻璃筒#
上下由不锈钢法兰连接和固定#反应器可进行高压
蒸气灭菌( 硼硅玻璃筒直径&$ AJ#高$0 AJ#反应器
有效体积$ N#工作体积&g! N( 导流筒为不锈钢材
质#气体分布器置于底部正中央位置#空气和*+
$
定
量混合后经%g$
#
J空气过滤器除菌再通过气体分
布器进入反应器(
D=O?培养方法
藻种培养"$(% JN三角瓶装液量为&%% JN培养
基#以斜面湿藻体进行接种#$$( o&% j)&%% E,JCL
培养 $% D $微藻处于对数生长期%#光暗周期为
&#l!#三角瓶瓶口处光照强度(
#
JF/,$J
$
!1%(
""气升式光照生物反应器培养"将培养至对数生
长期的藻种转接到$ N气升反应器中#使其初始生物
量约为%g$$ X,N$细胞干质量%#光照和温度条件同
藻种培养#每分钟单位发酵液中的通气量 %g& 个体
积$*+
$
体积分数#&f%(
D=P?测试指标
&303&"细胞生长的测定
取&% JN培养液于&% %%% E,JCL离心&% JCL#用
去离子水洗涤后#冷冻干燥#称其干质量(
&303$"叶绿素)8+?

)=+
?
0
质量浓度的测定
叶绿素质量浓度测定"参照文献*&0+#测定并
计算藻液中总叶绿素质量浓度和类胡萝卜素质量
浓度(
""8+
?

质量浓度测定"藻液离心后上清 8+?

的质
量浓度参照文献*&(+测定并计算(
""=+
?
0
质量浓度测定"藻液离心后上清 =+?
0
的
质量浓度参照文献*&#+测定并计算(
&303"烃的提取和分析
称取一定质量的干燥藻粉#加入正己烷超声
&( JCL#( %%% E,JCL离心&( JCL后#收集正己烷提取
液#提取过程重复 $ 次#离心后合并正己烷提取液#
室温下8
$
吹干正己烷#称其质量并计算粗烃质量
分数(
""粗烃经硅胶柱$硅胶粒度(% i6(
#
J#层析柱尺
寸&% JJp&%% JJ#正己烷为流动相%纯化#收集黄
色条带出来之前的所有试样#$( j旋转蒸发掉正己
烷#8
$
吹干#称质量得到纯烃质量分数(
""V*,V* Q] 分析"气相色谱为安捷伦 6!7%.#
检测器为YO\检测器#所得到的纯烃溶于正己烷中#
色谱柱 S= ( $ % Jp%g$( JJ%#进样口温度
$0% j# 检 测 器 温 度 $(% j& 初 始 温 度 &% j
$( JCL%# 然后以 ! j,JCL 的速率升到 $%% j
$ $ JCL %# 再 以 ( j,JCL 的 速 率 升 到 $!% j
$$% JCL%( 质谱条件"电子能量6% Hc#质荷比 )J5
范围 0% i#%%#结果鉴定对比已报道谱图*&6 ?&7+ (
&3030"脂肪酸的提取和分析
称取一定质量的干燥藻粉在&( JN厌氧管中#
加入( JN乙酰氯和甲醇$体积比 &l$%%溶液#抽干管
中空气后冲入8
$
#放置在&%% j水浴中反应& <$避
光%#冷却至% i0% j时在管中加入$ JN正己烷#振
&0"第 # 期 徐"玲等"布朗葡萄藻的培养基选择及其产物代谢规律
荡&% 1#再加入$ JN去离子水使之分层#取上层正己
烷相用无水8@
$
]+
0
干燥#进行V*分析*$%+ (
V*分析"气相色谱为安捷伦 6!7%.#色谱柱
S= &6$% Jp%g$( JJ%#进样口温度$(% j#检测
器温度$(% j&初始温度&!% j $& JCL%#然后以
# j,JCL的速率升到$% j$$( JCL%#YO\检测器#
]CXJ@公司脂肪酸甲酯混合标样为外标(
B?结果与讨论
B=D?O 种培养基对布朗葡萄藻生长及其代谢产物
的影响
""在气升式光照生物反应器中#首先进行了培养
基对布朗葡萄藻生长影响的研究#布朗葡萄藻在
种培养基*变化情况如图 & 所示(
图 D?培养基对布朗葡萄藻生长的影响
Q.;=D?#70:F127I0G.3I12/F-0;42NF-27647*,(0$
""从图 & 可以看出"布朗葡萄藻在 V` && 中的
生长情况最差#前&% D均处于延迟期#生长极其缓
慢#而后才进入对数生长期并在培养$( D后达到最
大值&g%( X,N&在 *V` &&中有所改善#培养周期缩短为$% D#生物量
提高到&g! X,N&在*生长速率明显快于 *的生长速率#培养周期仅为 &( D#生物量高达
&g!$ X,N( 上述结果表明#*朗葡萄藻在气升式光照生物反应器中生长的最适
培养基(
为了进一步研究不同培养基中布朗葡萄藻的
生长情况#测定了生物量达到峰值时培养液中叶绿
素和胡萝卜素的质量浓度#结果如图 $ 所示(
从图 $ 可以看出"不同培养基条件下#布朗葡萄
藻培养液中叶绿素和胡萝卜素质量浓度的变化趋
势与生物量的变化一致#在 *高#*萄藻藻株的最适培养基有所不同#胡章喜等*#+对8:
9&#/26#0 和 8:9&#/26#( 的培养基选择结果表
明#其合适的生长培养基为 *的研究表明#8:9&#/2].V%g!& 和8:9&#/2N`
(6$ 的最适培养基为 V` &&( 因此本文进行葡萄
藻培养基的选择研究是有必要的(
图 B?培养基对培养液中叶绿素和胡萝卜素
质量浓度的影响
Q.;=B?#70:F127I0G.3I12/F-0:2/F0/F27
:-62429-K65/G:542F0/2.G./F-0J42F-
""烃和油脂是布朗葡萄藻培养的重要目的产物#
为此#测定了不同培养基条件下培养获得的藻体的
粗烃质量分数$图 %和脂肪酸组成$表 &%(
图 O?培养基对布朗葡萄藻中粗烃质量分数的影响
Q.;=O?#70:F27:36F340I0G.3I12/-KG42:54J2/
:2/F0/F27647*,(0$
""从图 可以看出"不同的培养基对获得的布朗
葡萄藻藻体的粗烃含量影响显著( 布朗葡萄藻在
*到藻体干质量的 (!g6f&在*粗烃不如*培养结果最差#其粗烃质量分数仅为 #g0f( 实验
在粗烃质量分数测定的基础上对其成分进行了分
$0 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
析#结果显示#不同培养基对布朗葡萄藻烃的组成
没有影响#具体组成成分在下部分实验内容中进行
分析( 从表 & 可以看出"无论在何种培养基中#棕榈
酸)油酸和亚麻酸都是布朗葡萄藻的主要脂肪酸组
成#但其所占比例有所差异( 从不饱和脂肪酸与饱
和脂肪酸比值可见#*和脂肪酸比例较高# V` && 次之#*和脂肪酸比例最低(
表 D?培养基对布朗葡萄藻脂肪酸组成的影响
E5J60D?#70:F127I0G.3I12/75FK 5:.G:2I921.F.2/27
647*,(0$
脂肪酸成分
;$脂肪酸%,f
V` && **#l% $g06 $g$! g(&
*&0l% 0g!7 6g$7 g0%
*&#l% &g## $g# $6g$%
*&#l& g$ g$ &g7#
*&!l% $g#$ &g6! &g0!
*&!l&27A (g($ &6g77 $#g((
*&!l&27B &g0&
*&!l$ #g! &6g&$ $g!7
*&!l &%g&0 &6g#7 g%$
*$%l& &g#7
"注" V` &&)*肪酸的质量比分别为 &g0)&g$6 和 &g!((
""综上可得"*布朗葡萄藻的生长#也有利于其重要代谢产物烃的
合成( 因此#实验选择 *培养基(
B=B?,-3DO 培养基中布朗葡萄藻的代谢规律
在培养基选择的基础上#考察了气升式光照生物
反应器中布朗葡萄藻在*图 0是布朗葡萄藻生长过程中 8和 =的消耗情况(
由图 0可以看出"培养基中的=+?
0
和 8+?

在葡萄藻
的生长过程中逐渐下降#并在&( D后基本消耗完全(
结合图 &可知"*在&( D后达到峰值#表明8和=是葡萄藻生长的重要
营养元素#且生长后期8和 =的缺乏可能成为细胞
进一步生长和繁殖的限制性因素*$&+ (
""烃是布朗葡萄藻培养的主要代谢产物#重点考
察了生长过程中藻体的粗烃质量分数和培养液中
粗烃产量的变化情况#结果见图 ((
图 P?布朗葡萄藻培养过程中S+OU
P
和 $+U
O
的变化
Q.;=P?,-5/;01279-219-5F05/G/.F45F0./F-0
:36F34027647*,(0$
图 R?布朗葡萄藻培养过程中粗烃的代谢规律
Q.;=R?\0F5J26.:I0:-5/.1I27-KG42:54J2/./F-0
:36F34027647*,(0$
""图 ( 表明"在藻体生长期内#其粗烃质量分数逐
渐增大#并在生物量达到峰值时提高到 (!g6f( 相
应的#培养液中的粗烃产量在微藻培养过程随着藻
体生物量和粗烃质量分数的增加逐渐增大#并在
&( D后达到最大值&g%6 X,N&而后由于生物量和粗
烃质量分数的下降而逐渐降低( 在此过程中#实验
对不同生长周期烃的组成进行了分析#发现不同生
长周期烃的组成保持一致#未见显著差异#将烃组
分的气质联用实验结果与文献*&6 ?&7+中的布朗
葡萄藻烃的质谱图加以比对#确定实验所用 `族布
朗葡萄藻的烃主要由 *

S
(#
和 *
0
S
(!
这 $ 种烃组
成#其中*
0
S
(!
至少存在 $ 种同分异构体(
""脂肪酸是布朗葡萄藻的另一重要代谢产物#实验
对布朗葡萄藻主要生长阶段的脂肪酸组成进行了分
析#结果如表 $ 所示( 由表 $ 可以看出"在布朗葡萄
藻生长的初始阶段#培养# D后的布朗葡萄藻所含脂
肪酸中饱和脂肪酸$棕榈酸和硬脂酸%占主要成分#
不饱和脂肪酸含量很少#而且以 &# 个*的硬脂酸所
占比例最高&进入葡萄藻主生长期后#其脂肪酸组成
发生显著变化#棕榈酸和硬脂酸所占比例明显减小#
0"第 # 期 徐"玲等"布朗葡萄藻的培养基选择及其产物代谢规律
出现新的 &!*不饱和脂肪酸组分油酸#亚麻酸质量分
数也显著上升#棕榈酸)油酸和亚麻酸成为藻体脂肪
酸的主要成分&当生物量达到最大值时$&( D%#其脂
肪酸主要成分中油酸所占比例有所下降#亚麻酸所占
比例则有所上升&当进入生长稳定期后#脂肪酸组成
中出现*链更长的不饱和脂肪酸二十碳一烯酸#油酸
所占比例进一步下降( 由此可见"在气升式光照生物
反应器的培养过程中#由于布朗葡萄藻的生长过程中
不饱和脂肪酸的大量合成使得不饱和脂肪酸的比例
显著上升并维持在较高的水平( 本文结果与 )@/@-
A代谢研究的结果类似(
表 B?布朗葡萄藻培养过程中脂肪酸组成的变化
E5J60B?,-5/;012775FK 5:.G:2I921.F.2/./F-0:36F34027647*,(0$
脂肪酸成分
;$脂肪酸%,f
# D 7 D &$ D &( D &! D $0 D
*#l% 0g% g#( g(6 g(& g76 #g(0
*&0l% 0g6$ g# g$ g0% g&6 0g%#
*&#l% (#g#% $#g$ $#g# $6g$% $6g$ $#g&!
*&#l& 6g!& &g# &g!& &g7# $g(& $g66
*&!l% $&g67 &g(& &g(% &g0! &g$0 &g%6
*&!l&27A %g$6 $!g!! $#g(( $0g% $g($
*&!l$ g6$ g$ $g!7 $g76 $g6$
*&!l (g%0 $7g(0 &g%# g%$ g(0 &g!(
*$%l& &g0 &g&
"注"培养 #)7)&$)&()&!)$0 D后不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的比值分别为 %g&)&g!6)&g!#)&g!()&g!&)&g#0(
O?结?论
在气升式光照生物反应器里进行了布朗葡萄
藻培养基的选择及其产物代谢规律的探索( 发现
*成#培养&( D后#其生物量和粗烃质量分数分别为
&g!$ X,N和 (!g6f( *代谢规律的研究表明"8和 =是葡萄藻生长的重要
营养元素#粗烃质量分数随着生物量的增加而逐渐
增大#&( D后粗烃产量达到&g%6 X,N&生长周期中烃
的组成保持一致#所用 `族布朗葡萄藻的烃主要由
*

S
(#
和*
0
S
(!
这 $ 种烃组成#其中*
0
S
(!
至少存在
$ 种同分异构体&在布朗葡萄藻生长周期中#不饱和
脂肪酸的比例显著上升#培养&( D达到 #0f以上#
棕榈酸)油酸和亚麻酸是布朗葡萄藻脂肪酸的主要
组成成分(
参考文献"
*&+"嵇磊#张利雄#姚志龙#等3利用藻类生物质制备生物燃料研究
进展*W+3石油学报"石油加工#$%%6#$$#%"&-(3
WCNHC#R<@LXNCbCFLX#U@FRFI2EFDGACLX:CF-IGH/IEFJJCAEF@/X@H*W+3.AB@=HBEF/HC]CLCA@"
=HBEF/HGJ=EFAH11CLX]HABCFL#$%%6#$$#%"&-(3
*$+"梅洪#张成武#殷大聪#等3利用微藻生产可再生能源研究概况
*W+3武汉植物学研究#$%%!#$#$#%"#(%-##%3
QHCSFLX#R<@LX*FL EHLH_@:/HHLHEXK2EFDGABCFL :KJCAEF@/X@H*W+3W[G<@L F`B
4H1#$%%!#$#$#%"#(%-##%3
*+"QHB;XHE=#N@EXH@G *38(7&*(+(++/-9&#/2"@ECA< 1FGEAHIFEDEFA@E:FL1@LD EH/@BHD HB$%%(###$(%"0!#-07#3
*0+"*@1@DHM@/Z#\CI\#N@EXH@G *3]BGDCH1FL :@BA< @LD AFLBCLGFG1
AG/BGEH1FI8(7&*(+(++/-9&#/2*W+3 C`FBHA$%"$!#-$7(3
*(+"宋一涛3丛粒藻烃类的研究*W+3石油与天然气地质#&77&#&$
$&%"$$-3
]FLXUCB@F3]BGDK&77&#&$ $&%"$$-3
*#+"胡章喜#徐宁#李爱芬#等3布朗葡萄藻在不同培养基中的生长
效应*W+3生态科学#$%%6#$#$0%"$-#3
SG R<@LXbC#PG 8CLX#NC.CIHL#HB@/3ZIHAB1FIDCIHEHLBAG/BGEH
JHDCGJFL B_F8(7&*(+(++/-9&#/2*W+3ZAF/]AC#$%%6#$#$0%"
$-#3
*6+"胡章喜#安民#段舜山#等3不同氮源对布朗葡萄藻生长)总脂
和总烃含量的影响*W+3生态学报#$%%7#$7$#%"$!!-$703
SG R<@LXbC#.L QCL#\G@L ]00 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
1FGEAH1FL B:FL1FI8(7&*(+(++/-9&#/2*W+3.AB@ZAF/FXCA@]CL#$%%7#$7
$#%"$!!-$703
*!+"谢仁荣3几种理化因子对一株野生丛粒藻生长的影响*W+3安
徽农学通报#$%%7#&( $7%"7!-&%&3
PCH4HLEFLX3ZIHAB1FI2XEF_B< FI@_C/D 8(7&*(+(++/-9&#/21BE@CL*W+3.LG`/#$%%7#&($7%"7!-&%&3
*7+"王军#杨素玲#丛威#等3营养条件对产烃葡萄藻生长的影响
*W+3过程工程学报#$%%#$$%"&0&-&0(3
[@LXWGL#U@LX]G/CLX#*FLX[HC#HB@/3ZIHABFILGBECHLBAFLDC-
BCFL1FL B$%%#$$%"&0&-&0(3
*&%+ 许常虹#俞敏娟3成油藻"布朗葡萄藻的研究*W+3水生生物学
报#&7!!#&$$&%"7%-73
PG *<@LX@/X@H#8(7&*(+(++/-9&#/2*W+3.AB@SKDEF:CF/]CL#&7!!#&$$&%"
7%-73
*&&+ 殷大聪#耿亚红#梅洪#等3几种主要环境因子对布朗葡萄藻
$8(7&*(+(++/-9&#/2%光合作用的影响*W+3武汉植物学研究#
$%%!#$#$&%"#0-#73
UCL \@AFLX#VHLXU@HLMCEFLJHLB@/I@ABFE1FL B*W+3W[G<@L F`B4H1#$%%!#$#$&%"#0-#73
*&$+ 王军#杨素玲#丛威#等3产烃葡萄藻在气升式光生物反应器中
的分批补料培养*W+3过程工程学报#$%%#$0%"##-6%3
[@LXWGL#U@LX]G/CLX#*FLX[HC#HB@/3YHD-:@BA< AG/BCM@BCFL FI
8(7&*(+(++/-9&#/2CL @L @CE-/CIB2ZLX#$%%#$0%"##-6%3
*&+ \@K@L@LD@*#]@E@D@4#T1<@4Q#HB@/3.GBFBEF2FI8(7&*(+(++/-9&#/2IFEBF2F/K1@AA<@ECDH1CL M@ECFG1JHDC@*W+3 C`FJ@11` CFHLHEXK#$%%6#
&$&%"!6-73
*&0+ 4@F4.#\@K@L@LD@*# ]@E@D@4#HB@/3ZIHABFI1@/CLCBKFL
XEF_B< FIXEHHL @/X@8(7&*(+(++/-9&#/2@LD CB1AFL1BCBGHLB1*W+3
C`FEH1FGE5HA*&(+ [H@BFI@JJFLC@*W+3.L@/**&#+ *2*&6+ QHB;XHE=#*@1@DHM@/Z#=FGHBQW#HB@/3]BEGABGEH1FI1FJH:FB-
EKFAFAAHLH1":E@LA@/X@8(7&*(+(++/-9&#/2* W+3=$77(-%%$3
*&!+ QHB;XHE=# H`Ea@/FI*#*@1@DHM@/Z#HB@/3./a@DCHLH@LD :FBEKF-
AFAAHLH-2EFDGACLXE@AH1FI_C/D 1BE@CL1FI8(7&*(+(++/-9&#/2
*W+3=*&7+ QHB;XHE=#\@MCD Q#*@1@DHM@/Z3` CF1KLBDEFA@E:FL1CL B1CBH1FI2EFDGABCFL @LD L@BGEHFIBA*$%+ 5E@L SN#SFLX] W#NHH*V3ZM@/G@BCFL FIHbBE@ABCFL JHBEHAFMHEKFII@BK@ACD1IEFJ8(7&*(+(++/-9&#/2N` (6$ @LD B*2,<
+4(+*-7-123=**#!%*W+3 C`FBHA$$%"&!6-&7$3
*$&+ *@1@DHM@/Z#\CI\#N@EXH@G *#HB@/3]BGDCH1FL :@BA< @LD AFLBCL-
GFG1AG/BGEH1FI8(7&*(+(++/-9&#/2/@BCFL BF2BECBCFL*W+3 C`FBHA*$$+ )@/@A8(7&*(+(++/-AG/BGEHD CL @:@BA< JFDH*W+3QCAEF:CF/FXK#$%%%
$%"$(#-$#$3
(0"第 # 期 徐"玲等"布朗葡萄藻的培养基选择及其产物代谢规律