全 文 ：水杨醛保护法鉴定生物合成聚赖氨酸的单体连接方式
朱宏阳!，徐 虹!，葛 婕!，王 军!，"!
（! 南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 "!###$；" 江苏警官学院，南京 "!###$）
摘 要：建立了一种有效、方便的分析和鉴定聚赖氨酸结构的方法。采用水杨醛与游离氨基反应生成席夫碱，用
%&’()将席夫碱 * + %还原成 *,%，在酸性条件下将还原产物水解，用薄层层析法分析了水解产物，根据生成的 %
保护氨基酸不同，鉴定了生物合成的聚赖氨酸的结构为!,型结构。此法也可用于蛋白质或多肽的 %,末端氨基酸的
分析。
关键词：!,聚赖氨酸；游离氨基；结构鉴定；水杨醛；席夫碱
中图分类号：-.)/!0! 文献标识码：1 文章编号：!/2" 3 4/25（"##)）#) 3 ##)! 3 #4
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!,聚赖氨酸（!,JF）是一种可由微生物大量合成的
氨基酸聚合物，它是由必需氨基酸 F,赖氨酸通过酰胺
键连接而成的聚合物［!］。它具有高阳离子成分，安全
性高并有一些特别的物理特性，在化妆品、美容剂、饲
料添加剂、医药材料、农药、食品添加剂、电子材料、高
吸水性材料及基因工程载体材料等方面具有很大的
开发和利用的潜力［" Z )］。目前!,JF 已通过 W[1 认
证，在日本作为食品防腐剂进入商品化生产。由于赖
氨酸有两个,%("基团，其均聚物具有两种异构体，即
",JF和!,JF（见图 !）。",JF 是由 F,赖氨酸",*\\(
和",%("通过酰胺键连接而成的，它和!,JF性质上有
些差异，安全性能没有得到认证。因此，鉴定聚赖氨
酸的酰胺键连接方式十分重要。
蛋白质和多肽的 %末端和氨基酸组成成分的
分析有很多，最常见的方法为 "，),二硝基氟苯 [%W’
法即 G&9:AL法［]］。但是由于 [%W’是有剧毒性，对
! 收稿日期："##),!!,!!
基金项目：：国家十五攻关项目资助（"##)’12!4’#/,"）
作者简介：朱宏阳（!$2$,），男，硕士研究生，主要从事生物高分子微生物学方面的研究。
联系人：徐 虹，#"],54]5244"，^CK_9NCQ0 AIC0 H9
第 "卷第 )期
"##)年 !!月
生 物 加 工 过 程
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万方数据
环境的污染很严重，而且还是管制药品，不易得到。
作者采用水杨醛与游离氨基反应生成席夫碱，用
!"#$%将席夫碱 & ’ !还原成 &(!，在酸性条件下将
还原产物水解，用 )*&分析水解产物，根据生成的 !
保护氨基酸，可鉴定聚赖氨酸的酰胺键连接位置。
该法十分有效和方便。
图 - 聚赖氨酸的结构
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! 材料与方法
-1- 试剂
"(,*标准品购自日本チッソ株式会社；样品 ,*
按照文献［?］方法 !"#$%"&’()$* =:1?(@菌株发酵液进
行提取后得到。
-1A 标准品或样品直接水解的成分分析
将"(,* 标准品或样品装入安瓿管中，加入
? B8; C * $&;，密封，于 -A- D水解 AE F，用薄层层析
分析组成成分。薄层层析条件为：硅胶 ?E 铺板，展
开剂为正丁醇 G冰醋酸 G吡啶 G水 ’ % G - G - G A（体积
比）；显色剂为茚三酮。
-1@ 水杨醛保护、还原和水解
准确称取"(,*标准品或样品 -1H 0，吸取A1@ B*
水杨醛，分别加入装有 AE B* 无水乙醇（分子筛处
理）的圆底烧瓶中，加热回流 A F。反应完毕后，过滤
所得的沉淀，烘干，置于无水乙醇（分子筛处理）中，
添加 % 0 !"#$% 还原，待反应完全后，加入蒸馏水，
回收沉淀，烘干，再按材料与方法 -1A进行水解。
" 结果与讨论
A1- 样品基本组成的分析
,*易溶于水，不溶于乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有
机溶剂。对茚三酮反应呈阳性，用 ? B8; C * $&;水解
后对茚三酮同样呈阳性。将样品按常规的蛋白质水
解方法进行水解，水解液在薄层层析中分析，只有赖
氨酸（+ 9值为 E1-%）一种物质被检出，而没有其它氨
基酸（如图 A），说明该样品为赖氨酸的同型聚合物。
+与 #为聚合物，在层析中不走动，停留在原位，&
与 I为赖氨酸。
+为"(聚赖氨酸标准品，#为样品，
&为"(聚赖氨酸标准品水解液样，I为样品的水解液样。
图 A ?(@菌株产物的薄层层析结果
./01A )*& 89 3F7 :48J563 89 ?(@ =34"/>
A1A 样品结构分析
A1A1- 反应原理
"(,*经水杨醛保护游离(!$A，!"#$% 还原后水
解的反应式如下所示。
"(,*经水杨醛保护游离(!$A，!"#$% 还原后水
解将得到两种保护的赖氨酸，即 ,!，,"(二邻羟基苯
甲基赖氨酸 -、,!(邻羟基苯甲基赖氨酸 A。由于第
一步反应是可逆反应，反应体系中残留聚赖氨酸，因
此还会有赖氨酸 @产生。
若样品为!(,*，用上述方法将生成 -，,"(邻羟
基苯甲基赖氨酸 H和 @。在 )*&分析时 A与 H 的 K9
不同，据此可判断 ,*的酰胺键位置。
A1A1A 薄层层析结果
图 @为"(,*标准品和样品经水杨醛保护游离
氨基并还原后的水解液样薄层层析图。从图中可以
看出水解样均有 @个点组成，把这 @个点挖取，提取
精制后，用红外分析图中标注的 -、A和 @分别为 ,!(
邻羟基苯甲基赖氨酸、,，,(二邻羟基苯甲基赖氨
酸、赖氨酸。
由此证明 ?(@菌株发酵所产的 ,*为"(,*。
·%A· 生物加工过程 第 A卷第 %期
万方数据
!为用水杨醛保护!"#$标准品水解样，%为用水杨醛保护的
样品水解样。其中 &为 !""邻羟基苯甲基赖氨酸，’为 !，!
"二邻羟基苯甲基赖氨酸，(为赖氨酸。
图 ( 样品结构的测定结果
)*+,( -$. /0 1/23234*56’4 4789:7986 18/;9:6; <3 ="( 478>*5
! 讨论
采用水杨醛保护聚赖氨酸中的游离氨基并还原
水解的方法可以快速、方便地鉴定聚赖氨酸酰胺键
连接的位置，此法也可用于分析蛋白质或多肽的 ?"
末端氨基酸。
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万方数据