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Identification for the monomer joint-mode of biosynthesised polylysine by salicylaldehyde protection

水杨醛保护法鉴定生物合成聚赖氨酸的单体连接方式



全 文 :水杨醛保护法鉴定生物合成聚赖氨酸的单体连接方式
朱宏阳!,徐 虹!,葛 婕!,王 军!,"!
(! 南京工业大学 制药与生命科学学院,南京 "!###$;" 江苏警官学院,南京 "!###$)
摘 要:建立了一种有效、方便的分析和鉴定聚赖氨酸结构的方法。采用水杨醛与游离氨基反应生成席夫碱,用
%&’()将席夫碱 * + %还原成 *,%,在酸性条件下将还原产物水解,用薄层层析法分析了水解产物,根据生成的 %
保护氨基酸不同,鉴定了生物合成的聚赖氨酸的结构为!,型结构。此法也可用于蛋白质或多肽的 %,末端氨基酸的
分析。
关键词:!,聚赖氨酸;游离氨基;结构鉴定;水杨醛;席夫碱
中图分类号:-.)/!0! 文献标识码:1 文章编号:!/2" 3 4/25("##))#) 3 ##)! 3 #4
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!,聚赖氨酸(!,JF)是一种可由微生物大量合成的
氨基酸聚合物,它是由必需氨基酸 F,赖氨酸通过酰胺
键连接而成的聚合物[!]。它具有高阳离子成分,安全
性高并有一些特别的物理特性,在化妆品、美容剂、饲
料添加剂、医药材料、农药、食品添加剂、电子材料、高
吸水性材料及基因工程载体材料等方面具有很大的
开发和利用的潜力[" Z )]。目前!,JF 已通过 W[1 认
证,在日本作为食品防腐剂进入商品化生产。由于赖
氨酸有两个,%("基团,其均聚物具有两种异构体,即
",JF和!,JF(见图 !)。",JF 是由 F,赖氨酸",*\\(
和",%("通过酰胺键连接而成的,它和!,JF性质上有
些差异,安全性能没有得到认证。因此,鉴定聚赖氨
酸的酰胺键连接方式十分重要。
蛋白质和多肽的 %末端和氨基酸组成成分的
分析有很多,最常见的方法为 ",),二硝基氟苯 [%W’
法即 G&9:AL法[]]。但是由于 [%W’是有剧毒性,对
! 收稿日期:"##),!!,!!
基金项目::国家十五攻关项目资助("##)’12!4’#/,")
作者简介:朱宏阳(!$2$,),男,硕士研究生,主要从事生物高分子微生物学方面的研究。
联系人:徐 虹,#"],54]5244",^CK_9NCQ0 AIC0 H9
第 "卷第 )期
"##)年 !!月
生 物 加 工 过 程
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·)!·
万方数据
环境的污染很严重,而且还是管制药品,不易得到。
作者采用水杨醛与游离氨基反应生成席夫碱,用
!"#$%将席夫碱 & ’ !还原成 &(!,在酸性条件下将
还原产物水解,用 )*&分析水解产物,根据生成的 !
保护氨基酸,可鉴定聚赖氨酸的酰胺键连接位置。
该法十分有效和方便。
图 - 聚赖氨酸的结构
./01- 234563547 89 :8;<;<=/>7
! 材料与方法
-1- 试剂
"(,*标准品购自日本チッソ株式会社;样品 ,*
按照文献[?]方法 !"#$%"&’()$* =:1?(@菌株发酵液进
行提取后得到。
-1A 标准品或样品直接水解的成分分析
将"(,* 标准品或样品装入安瓿管中,加入
? B8; C * $&;,密封,于 -A- D水解 AE F,用薄层层析
分析组成成分。薄层层析条件为:硅胶 ?E 铺板,展
开剂为正丁醇 G冰醋酸 G吡啶 G水 ’ % G - G - G A(体积
比);显色剂为茚三酮。
-1@ 水杨醛保护、还原和水解
准确称取"(,*标准品或样品 -1H 0,吸取A1@ B*
水杨醛,分别加入装有 AE B* 无水乙醇(分子筛处
理)的圆底烧瓶中,加热回流 A F。反应完毕后,过滤
所得的沉淀,烘干,置于无水乙醇(分子筛处理)中,
添加 % 0 !"#$% 还原,待反应完全后,加入蒸馏水,
回收沉淀,烘干,再按材料与方法 -1A进行水解。
" 结果与讨论
A1- 样品基本组成的分析
,*易溶于水,不溶于乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有
机溶剂。对茚三酮反应呈阳性,用 ? B8; C * $&;水解
后对茚三酮同样呈阳性。将样品按常规的蛋白质水
解方法进行水解,水解液在薄层层析中分析,只有赖
氨酸(+ 9值为 E1-%)一种物质被检出,而没有其它氨
基酸(如图 A),说明该样品为赖氨酸的同型聚合物。
+与 #为聚合物,在层析中不走动,停留在原位,&
与 I为赖氨酸。
+为"(聚赖氨酸标准品,#为样品,
&为"(聚赖氨酸标准品水解液样,I为样品的水解液样。
图 A ?(@菌株产物的薄层层析结果
./01A )*& 89 3F7 :48J563 89 ?(@ =34"/>
A1A 样品结构分析
A1A1- 反应原理
"(,*经水杨醛保护游离(!$A,!"#$% 还原后水
解的反应式如下所示。
"(,*经水杨醛保护游离(!$A,!"#$% 还原后水
解将得到两种保护的赖氨酸,即 ,!,,"(二邻羟基苯
甲基赖氨酸 -、,!(邻羟基苯甲基赖氨酸 A。由于第
一步反应是可逆反应,反应体系中残留聚赖氨酸,因
此还会有赖氨酸 @产生。
若样品为!(,*,用上述方法将生成 -,,"(邻羟
基苯甲基赖氨酸 H和 @。在 )*&分析时 A与 H 的 K9
不同,据此可判断 ,*的酰胺键位置。
A1A1A 薄层层析结果
图 @为"(,*标准品和样品经水杨醛保护游离
氨基并还原后的水解液样薄层层析图。从图中可以
看出水解样均有 @个点组成,把这 @个点挖取,提取
精制后,用红外分析图中标注的 -、A和 @分别为 ,!(
邻羟基苯甲基赖氨酸、,,,(二邻羟基苯甲基赖氨
酸、赖氨酸。
由此证明 ?(@菌株发酵所产的 ,*为"(,*。
·%A· 生物加工过程 第 A卷第 %期
万方数据
!为用水杨醛保护!"#$标准品水解样,%为用水杨醛保护的
样品水解样。其中 &为 !""邻羟基苯甲基赖氨酸,’为 !,!
"二邻羟基苯甲基赖氨酸,(为赖氨酸。
图 ( 样品结构的测定结果
)*+,( -$. /0 1/23234*56’4 4789:7986 18/;9:6; <3 ="( 478>*5
! 讨论
采用水杨醛保护聚赖氨酸中的游离氨基并还原
水解的方法可以快速、方便地鉴定聚赖氨酸酰胺键
连接的位置,此法也可用于分析蛋白质或多肽的 ?"
末端氨基酸。
参考文献:
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