全 文 ：谷氨酸废液培养莱茵衣藻的产氢研究
贾立娜!，张 栩!，谭天伟!，施定基"!
（!#北京化工大学 生命科学与技术学院，北京!$$$"%；"#天津科技大学 海洋科学与工程学院，天津&$$’()）
摘 要：通过在一般培养基中添加尿素、谷氨酸、葡萄糖等有机物，考察了莱茵衣藻混合营养培养的产氢效果。结
果表明，含尿素混合营养培养莱茵衣藻产氢是含铵氮的培养基培养的*倍，无硫含尿素的混合营养培养具有最佳
的产氢效果，是有硫含铵氮的培养基的!$倍。谷氨酸及葡萄糖的添加对其生长和产氢也有促进作用，对莱茵衣藻
生长和产氢促进作用的尿素的最佳添加量为$#"(+／,，谷氨酸的最佳添加量为$#)+／,，葡萄糖的添加量为$#"+／
,。
关键词：莱因衣藻；混合营养培养；产氢；发酵废水
中图分类号：-.!!*#"% 文献标识码：/ 文章编号：!*)"0&*)1（"$$(）$!0$$’(0$’
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由于化石能源的储量已急剧减少，能源问题已
成为制约国民经济发展的瓶颈。另一方面由于化石
能源的应用，导致环境问题日益突出。因此利用生
物可再生原料及太阳能生产的能源，即生物能源，成
为人们关注的焦点。生物能源包括生物质能、生物
液体燃料及利用生物质生产的能源如燃料酒精、生
物柴油、生物质气化及液化燃料，生物质氢等［!］。
其中，氢能清洁可再生，燃烧只产生水和巨大能量，
! 收稿日期："$$’5!"5"$
基金项目：国家%)&项目（"$$&CK)!*$$"）；国家1*&项目（"$$"//(!’$&$）；十五攻关（"$$’K/&’!!K$(）（"$$’K/)!K$15$"）和中国博士
后科学基金（"$$&$&’!$*）；高等学校科技创新工程重大项目培育资金（)$’$!$）
作者简介：贾立娜（!%1$5），女，北京人，硕士研究生，研究方向：生物化工。
联系人：谭天伟（!%*’5），男，博士，教授，研究方向：生物化工，SQ74E：P>P76!Q74E#V=GP#?H=#G6
第&卷第!期
"$$(年"月
生 物 加 工 过 程
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[?V#"$$(
·’(·
万方数据
有可能成为!"世纪重要燃料之一。由于化学方法
制氢要消耗大量的矿物资源，因而利用生物技术进
行氢气生产大受世人关注。
生物制氢主要采用厌氧微生物（包括活性污泥），
光合细菌及藻类。藻类产氢利用太阳能和水，制氢过
程不产生污染，因而具有较大发展优势。自从
#$%&’()［!］在!***年采用去硫法大幅度提高莱茵衣
藻的产氢能力后，人们对莱茵衣藻产氢研究给予了极
大关注。对莱茵衣藻混合营养培养的大量研究结果
表明，它可以利用一些有机碳源（葡萄糖、醋酸钠）和
有机氮源（尿素）［+，,，-］进行混合营养培养。发酵废水
中含有很多不易去除的有机氮磷物质，它们有些是莱
茵衣藻生长可利用的物质，利用废水培养藻类产氢可
以变废为宝，具有极大的社会和经济效益。
味精发酵废液的主要成分，例如葡萄糖，谷氨酸
等［.］可对莱茵衣藻生长、产氢产生影响，本文为探
索味精废水培养莱茵衣藻并且产氢，同时净化废水
的可行性提供一定的理论基础。
! 材料与方法
"(" 藻种纯化培养与培养基
藻种采用野生型莱茵衣藻（!"#$%&’(%()$*+,-).
"$+’/-），培养基（"/）为：01&’：!(,!2，343%：+562，
#278,：,9(:62，;醋酸："(96/，微量元素："6/，用;8<调><值。微
量元素（"**6/）：?4!@AB0)：-2，<+C8+："(",2，#D@
3%!·,*(-2，3G3%·.*("-52。
在培养基中加入"(-H的琼脂粉，制成固体培
养基平板，再将待分离纯化的藻液通过划线方法接
种在平板上，置于培养箱中，!:I培养5J。从平板
上挑取单藻落接入!-*6/三角瓶中（含有"**6/
液体培养基），于光照培养箱中静置培养（光照强度
约"!-!A／（6!·’）=)K）。
混合营养培养基：在上述培养基内添加*(+2／
/尿素。
无硫培养基：将上述培养基内硫酸盐等量变换
为氯化物。
"(! 产氢培养
用青霉素小瓶（96/）与反口塞组成配套培养
瓶，灭菌后移入.(-6/菌悬液，倒置于培养箱内，
首先在!5I暗条件下诱导一定时间后，再在光照培
养箱内!5I光照（"!-!A／（6!·’）=)K）条件培养，
每天定时用微量进样器抽取瓶中气体，进行氢气含
量测定。培养液取出后测藻细胞密度和><值。
"(+ 分析方法
"(+(" 生物量的测定
将一定的浓度藻液按比例稀释+倍，测定其在
5-*D6处的吸光度（5!"分光光度计）。依据标准
曲线计算出藻细胞数。同时可在显微镜下用血球计
数板测定细胞数。
"(+(! 氢气的测定
氢气采用气相色谱（东西电子L3,***)，北京）测
定，分子筛-)，柱长!6，内径+66，以氮气作为载
气。进样体积"**!/，柱温-*I，进样温度.*I，热
导检测温度""*I。用外标法计算氢气浓度和体积。
" 结果与讨论
!(" 尿素的添加对莱茵颐藻产氢的影响
不同类型的培养基对莱茵衣藻的产氢效果是不
同的。实验在暗培养!+M，光照培养!,M后测定氢
气含量。对于一般培养基来说，产氢量较小，只有
+(,"!/（图"）。当在培养基中去除无机硫元素后，
图" 不同培养基类型对莱茵衣藻培养产氢效果的影响
F&2(" AN$OPGN6$J&Q6GDPM$产氢量增加了约5倍，而添加醋酸钠和尿素后，混合
营养培养的产氢效果是一般培养基的约.倍，当在
培养集中同时添加醋酸钠、尿素，去除无机硫元素
后，产氢效果更佳，不仅高出一般培养基的约"*倍，
且比单独去除无机硫元素的产氢样品和添加尿素样
品都高出不少。在培养基中去硫后，破坏了莱茵衣
藻的光合系统SS，使得光合放氧过程受阻，在消耗氧
气到较低的浓度后，莱茵衣藻诱导产生氢酶，进行催
化产氢作用［!］。而在不去硫条件下，由于尿素的存
在提供了充足的氮源，可能使得莱茵衣藻在暗条件
下进行异养营养培养，在此过程不能进行光合放氧，
只能好氧生长，由于培养瓶密封良好，在消耗氧气到
较低浓度后，就有可能莱茵衣藻诱导产生氢酶，可进
行催化产氢作用。在同时去硫及添加醋酸钠和尿素
·,.· 生物加工过程 第+卷第"期
万方数据
时，同时加强了两者的作用，使得氢酶诱导时间缩
短，产氢时间延长，产氢总量增加。
在此实验基础上，考察了去硫培养基中不同含
量尿素对莱茵衣藻培养以及产氢的影响。本实验设
计的尿素质量浓度分别为!，!"#$，!"$，!"%，!"&’／
(，结果见图#和图)。
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—*—!"%’／(；—$—!"&’／(；
图# 不同质量浓度尿素对莱茵衣藻生长的影响
+,’"# -./012.34/50260/61451,262617/8/9’42:17
图) 不同质量浓度尿素对莱茵衣藻培养产氢效果的影响
+,’") -./012.34/50260/61451,262617/;#/<2931,26
尿素质量浓度不同对莱茵衣藻生长曲线的影响
从培养的第二天起就非常明显。!"#$’／(样品的生
长情况始终最好，在第%天细胞密度高达每=($"$&
*>!?0/9，为空白样品细胞密度的>"#>倍。其次是
!"$’／(的样品生长量较大，!"%’／(样品与空白样生
长曲线大致相同。而当尿素质量浓度达到!"&’／(
时，生长为基本停滞状态，不利于莱茵衣藻的生长。
因此尿素的存在，在!’／(到!"%’／(范围内有利于
莱茵衣藻的生长和分裂，此实验为进一步采用尿素为
有机氮源培养莱茵衣藻产氢的可行性提供了依据。
对于尿素影响莱茵衣藻产氢的情况来看，基本与
影响生长的情况相同，添加!"#$’／(尿素所得氢气
产量最大，为)@!(，!"$’／(样品比空白样稍微有所
减少，产氢量最少的为!"%’／(样品，只有$"A@!(。
#"# 谷氨酸的添加对莱茵衣藻产氢的影响
由于味精发酵废水中通常含有的B93质量浓度
为>"!’／(，所以本实验设计的谷氨酸质量浓度梯度
分别为：!、!")、!"%、>"!、>"@’／(（图@）。谷氨酸质量
浓度不同对莱茵衣藻生长曲线的影响从培养的第二
天起就非常明显。!"%’／(样品的生长情况始终最
好，在第%天细胞密度高达每=($"$#*>!?0/9，为空
白样品细胞密度的>"@&倍。>"!、>"@’／(样品生长
曲线大致相同，最终的细胞密度分别为每=(@"%A*
>!?0/9、@"?*>!?0/9。谷氨酸的存在，在实验范围内
有利于莱茵衣藻的生长和分裂，主要可能因为谷氨酸
分子内含碳和氮元素，可作为碳氮源使用。此实验为
采用味精发酵废水培养莱茵衣藻的可行性提供了依
据。
—!—!’／(；—"—!")’／(；—#—!"%’／(；
—*—>’／(；—%—>"@’／(；
图@ 不同浓度谷氨酸对莱茵衣藻培养生长的影响
+,’"@ -./012.B9315=,050,C0260/61451,262617/8/9’42:17
为了考察味精发酵废液的产氢可行性，首先考
察了谷氨酸对莱茵衣藻产氢影响。实验采用添加不
同质量浓度谷氨酸的去硫混合营养培养基之间进行
对比。谷氨酸质量浓度梯度分别为!、!"@、!"%、>、
>"@’／(，实验结果见图$。实验在暗培养#)7，光
照培养#@7后测定氢气含量。
由图$可以看出，添加谷氨酸的样品产氢均大
于空白样品，添加谷氨酸!"@、!"%’／(时，产氢量明
显高于其他样品，最高时分别为?!、$%、%A"&%!(。
添加量为>、>"@’／(的样品产氢量与空白样基本相
同。说明添加适量的谷氨酸对产氢是有促进作用
的，这可能是由于谷氨酸的存在有助于莱茵衣藻的
异氧及混合营养生长消耗氧气，使得具有较好的产
氢效果。在此实验中，最佳谷氨酸添加量为
!"%’／(。与促进生长添加的谷氨酸量相同。
#") 葡萄糖的添加对莱茵衣藻产氢的影响
由于葡萄糖在味精发酵废水中含量较高，同时
#!!$年#月 贾立娜等：谷氨酸废液培养莱茵衣藻的产氢研究 ·@%·
万方数据
它可作为多数微生物生长的碳源，因此，本实验设计
了葡萄糖对莱茵衣藻生长的影响，在一般培养基中
的葡萄糖添加梯度分别为：!、!"#、!"$、!"$%、
!"&%’／(，考察了它们)*的生长情况（如图+）。
图% 不同质量浓度谷氨酸对莱茵衣藻培养产氢效果的影响
,-’"% ./0123/456278-171-*1391092:72-39392;0<#0=3562-39
—!—!’／(；—"—!"#’／(；—#—!"$’／(
—>—!"$%’／(；—$—!"&%’／(；
图+ 不同质量浓度葡萄糖对莱茵衣藻生长的影响
,-’"+ ./0123/’5613?01391092:72-39392;0@05’:3A2;
由图+可以看出，葡萄糖在一定质量浓度内对
莱茵衣藻的生长是有利的，但质量浓度达到
!"&%’／(时，藻细胞浓度明显下降，葡萄糖对莱茵衣
藻生长的最有利浓度为!"#’／(，在第)天藻密度
为每8(%"#B>C!+105，是空白样的C"%倍。在添
加范围为!"$!!"$%’／(时藻细胞密度基本相同。
最终藻细胞密度分别为每8(&"%、&"##>C!+105。
实验又考察了葡萄糖对莱茵衣藻产氢的作用，
实验采用去硫混合营养培养基，在添加的葡萄糖浓
度分别为!、!"C、!"#、!"$、!"&’／(之间进行对比
（图)）。实验在暗培养#$;、光照培养#&;后测定
氢气含量。最大产氢量出现在!"#’／(葡萄糖的样
品中，最大产氢量为C%C"(，其次产氢量较大的有
添加!"$’／(葡萄糖的样品及!"C’／(。添加量较
大的!"&’／(葡萄糖样品产氢量略高于空白样，但基
本相同，为$C"#"(。由此可见，添加适量的葡萄糖
对莱茵衣藻产氢也有促进作用，这可能是由于葡萄
糖的添加相当于添加了部分碳源，有助于莱茵衣藻
的异氧及混合营养生长消耗氧气，由此具有较好的
产氢效果。在此实验中，最佳葡萄糖添加量为!"#
’／(。
图) 不同质量浓度葡萄糖对莱茵衣藻培养产氢效果的影响
,-’") ./0123/’5613?01391092:72-39392;0<#0=3562-39
! 结 论
综上所述，同时去硫和混合营养培养对莱茵衣藻
的产氢的促进作用最大，其中尿素的添加量以
!"#%’／(形成的混合营养培养产氢最佳，可达到
$&"(。谷氨酸及葡萄糖的添加对其生长和产氢也有
促进作用，对莱茵衣藻生长和产氢起促进作用最大的
添加量分别为，谷氨酸!")’／(，培养第)天细胞密度
达每8(%"%#>C!+105，进入产氢#&;后产氢量达
)B"DC"(；葡萄糖!"#’／(，培养第)天细胞密度达每
8(%"#B>C!+105，进入产氢#&;后产氢量达C%C
"(。
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［%］ ,09’@;09，H-1;705QE3;9?"<020:32:3I;-1’:3A2;3/!"#$%&/
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