全 文 ：第 35 卷第 10 期
2015年 5月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.10
May,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金资助项目(40801194); 中山市科技计划项目(2013A3FC0243)
收稿日期:2013鄄06鄄24; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄05鄄30
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: hopeybxu@ 163.com
DOI: 10.5846 / stxb201306241772
温丽华, 许燕滨, 周艳, 阮晶晶, 侯毛宇, 孙浩, 屈毛毛, 袁保红, 郑莉.重金属胁迫对 Pseudomonas alcaligenes LH7 抗生素抗性的影响.生态学
报,2015,35(10):3411鄄3418.
Wen L H, Xu Y B, Zhou Y, Ruan J J, Hou M Y, Sun H, Qu M M, Yuan B H, Zheng L. Effects of heavy metal stress on antibiotics resistance of
Pseudomonas alcaligenes LH7.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3411鄄3418.
重金属胁迫对 Pseudomonas alcaligenes LH7 抗生素抗
性的影响
温丽华1, 许燕滨1,*, 周 摇 艳1, 阮晶晶1, 侯毛宇1, 孙 浩1, 屈毛毛1, 袁保红2,
郑摇 莉1摇
1 广东工业大学环境科学与工程学院, 广州摇 510006
2 广东药学院基础部, 广州摇 510006
摘要:从广州某养猪场废水处理系统中筛选出 1株优势菌 Pseudomonas alcaligenes LH7。 为了研究重金属胁迫对细菌抗生素抗
性响应的影响,采用琼脂稀释法和 K鄄B纸片扩散法,测定了重金属(Cu2+、Zn2+、Cr6+)的最小抑制浓度(MIC),及不同重金属种类
和浓度胁迫下,四种抗生素(红霉素、阿莫西林、头孢拉定、四环素)的抑菌圈直径。 结果表明:菌体对 Cu2+、Zn2+、Cr6+的 MIC 分
别为 125、125、100 mg / L,并且具有四环素、阿莫西林、红霉素和头孢拉定多重抗性。 重金属与抗生素之间的交互作用对细菌的
抗性有显著影响(P<0.05)。 重金属和抗生素间的交互作用随重金属种类和浓度的不同而改变,可分为三类:低浓度重金属与
抗生素共存时表现为协同抗性,高浓度时则表现为协同杀菌,如 Cr6+或 Zn2+与红霉素,Cu2+与头孢拉定;低浓度重金属与抗生素
共存时表现为协同杀菌,高浓度时则表现为协同抗性,如 Cr6+或 Zn2+与阿莫西林;只与共存重金属种类相关的抗性组合有 Cu2+
与四环素或阿莫西林或红霉素,Cr6+与头孢拉定。 环境中重金属离子的共存将改变抗生素污染物的生态危害和环境行为,并最
终影响对应的污染防治技术的开发和应用。
关键词:养猪场废水; Pseudomonas alcaligenes LH7; 重金属胁迫; 抗生素; 协同抗性; 协同杀菌
Effects of heavy metal stress on antibiotics resistance of Pseudomonas alcaligenes
LH7摇
WEN Lihua1, XU Yanbin1,*, ZHOU Yan1, RUAN Jingjing1, HOU Maoyu1, SUN Hao1, QU Maomao1, YUAN
Baohong2, ZHENG Li1
1 School of Environmental Science and Engineering, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China
2 School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
Abstract: To study the effect of heavy metal stress on bacterial antibiotic resistance, a Gram鄄negative bacteria isolated from
swine wastewater in Guangzhou was characterized and identified as Pseudomonas alcaligenes LH7. The minimal inhibition
concentration (MIC) of heavy metals ( Cu2+, Zn2+ and Cr6+ ) and antibiotic susceptibility test were determined by the
methods of Kirby鄄Bauer disk diffusion and agar dilution. Furthermore, with the joint effect of type and concentration of
heavy metals, the inhibition zone diameter of the tested antibiotics ( erythromycin, amoxicillin, cephradine and
tetracycline) was measured by vernier caliper. The results showed that the MICs of Cu2+, Zn2+and Cr6+ were 125 mg / L,125
mg / L and 100 mg / L, respectively. Multiple antibiotic resistance was also observed. The Pseudomonas alcaligenes LH7
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showed resistance to erythromycin, amoxicillin, cephradine and tetracycline. The interaction of antibiotics and heavy metals
significantly affected bacterial resistance (P﹤ 0.05). There were three kinds of cross鄄effects between antibiotics and heavy
metals according to the types and concentrations of heavy metals. Firstly, the effect of heavy metals on antibiotic resistance
could be co鄄resistance at low concentrations but synergic germicidal at high concentrations, such as Cr6+ and erythromycin,
Zn2+ and erythromycin, Cu2+ and cephradine. Secondly, the effect of heavy metals on antibiotic resistance could be synergic
germicidal at low concentrations but co鄄resistance at high concentrations, such as Cr6+ and amoxicillin, Zn2+ and
amoxicillin. Finally, the antibiotic resistance was only associated with the types of heavy metal, such as Cu2+ and
tetracycline or amoxicillin or erythromycin, Cr6+ and cephradine. Co鄄existence of heavy metals in environment will change
the ecological harm and environmental behavior of antibiotics, and affect the development and application of relative
pollution prevention techniques, so this is a field worthy of attention.
Key Words: swine wastewater; Pseudomonas alcaligenes LH7; heavy metal stress; antibiotics; co鄄resistance;
synergic germicidal
在我国每年用作饲料添加剂的抗生素已超过 8000t[1],养殖业通常利用抗生素提高饲料利用率、牲畜的增
重率以及预防和治疗牲畜疾病[2],因为过量添加,大部分抗生素不能被动物吸收,最终以母药的形式随粪便
和尿液排出[3]。 抗生素的滥用、过量使用,甚至人药兽用,使得抗生素的环境危害和生态风险越来越大。 研
究者已从浙江、广西、杭州、北京、济南等多个省市的养殖场畜禽粪便中检测出抗生素[4鄄7]。 此外,市政污水、
河流水、湖泊水、沉积物和土壤,甚至地下水中均检测出抗生素残留[8鄄9]。 抗生素抗性基因作为抗生素污染的
次生污染物,已在包括河流、污水厂排水等多个水体中检测出来[10鄄11],由于其可能通过水平迁移等途径实现
生物间传递,而人们对其具体的环境行为仍有非常多未知的领域,也吸引了越来越多学者的关注。 目前主要
的研究集中在抗生素对环境受体的影响[12]及抗生素在水环境、土壤环境以及污染治理设施中的降解情况研
究等[13鄄16]。
重金属污染由于来源广泛,且具有生物累积性、长期性和不可逆性,一直以来备受关注。 作为两种备受关
注的污染物,重金属和抗生素复合污染的现象也越来越普遍,如畜禽养殖的固废和废水、施用粪肥的土壤环境
等[4,17]。 目前,有关重金属和抗生素复合污染的研究主要集中在重金属和抗生素在环境中的分布、含量上的
分析及对污水处理的影响[17鄄18],而重金属对抗生素抗性的影响未做系统性研究,随着人们从环境中筛选出越
来越多同时具有重金属抗性和抗生素抗性的菌种,如从鱼、虾体内及沉积物中分离的气单胞菌属(Aeromonas
spp.)等[19鄄20],及从南极海水中分离的莫拉氏菌属 ( Moraxella )、产碱杆菌 ( Alcaligens ) 和假单胞菌
(Pseudomonas)等嗜冷菌[21],重金属和抗生素抗性间的相关性也引起了学者的关注,研究发现重金属和抗生
素的联合毒性表现为拮抗作用和相加作用[18]。
养殖废水作为一种典型的重金属和抗生素复合污染环境,其抗生素浓度范围多为 滋g / L 级,有些可达到
1—6mg / L,而重金属以 Cu2+、Zn2+最高,在猪粪中可达几百 mg / kg[4,22鄄23],为了准确了解重金属胁迫对菌体抗
生素抗性的响应特点,本试验从中筛选获得 1 株优势菌 Pseudomonas alcaligenes LH7,研究 3 种典型重金属
(Cu2+、Zn2+、Cr6+)在不同浓度下对菌株抗生素(红霉素、阿莫西林、头孢拉定、四环素)抗性的影响,从而为微
生物法治理重金属和抗生素复合污染提供理论基础。
1摇 材料与方法
1.1摇 实验材料
1.1.1摇 实验菌株
本实验菌株从广州某养猪场废水处理系统中分离获得,为 1株革兰氏阴性杆菌,细杆状,无芽孢,能运动,
菌落呈圆形,无色,光滑不透明,色氨酸脱氢酶、V鄄P 测定、硝酸盐还原、接触酶、氧化酶反应呈阳性,不能利用
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葡萄糖、蔗糖、果糖,经鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes LH7)。 对照菌株为大肠杆菌 K鄄12,质控
菌株为大肠杆菌 ATCC 25922、铜绿假单胞菌 ATCC 27853和大肠杆菌 ATCC 35218。
1.1.2摇 培养基
(1)菌种的活化和培养、菌悬液的制备、抗生素敏感实验分别采用牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白
胨液体培养基、MH琼脂培养基。
(2)试验培养基:分别称取定量的分析纯 CuSO4·5H2O、ZnSO4和 K2Cr2O7,以无菌去离子水定容,再用
0郾 22 滋m膜过滤,配制成浓度为 1伊104 mg / L的重金属标准溶液,作为储备液,用于调节培养基中重金属浓度。
将灭菌(121 益,1.0 MPa)后的 MH琼脂培养基冷却至 50 益左右,加入不同量的重金属储备液,调节重金属浓
度。 摇匀后,倒入培养皿待凝固,用于菌体的重金属 MIC测定及重金属对菌株抗生素抗性影响研究。
1.2摇 实验方法
1.2.1摇 菌悬液制备
挑取冰箱中甘油保存的菌种,接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上,在生化培养箱中 37 益培养 24 h 活化,
从平板上挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养液中,于 37 益恒温振荡器培养 16—18 h 获得种子培养液;按
照 5%的接种量,接种到新鲜培养液中,继续 37 益恒温振荡器培养 16—18 h,获得浓度为 108 CFU / mL的菌悬
液,用于重金属最小抑制浓度 MIC测定及抗生素抗性研究。
1.2.2摇 重金属最小抑制浓度(MIC)确定
采用琼脂稀释法,用涂布棒将 100 滋L 菌悬液涂布到含重金属溶液的试验培养基上,Cu2+、Zn2+、Cr6+的浓
度变化范围为 0—200 mg / L,置于生化培养箱恒温 37 益培养 24 h,观察菌的生长情况。 以大肠杆菌 K鄄 12 为
对照菌株,MIC的终点判断标准为抑制细菌生长的最低浓度。
1.2.3摇 抗生素抗性实验
采用 K鄄B纸片扩散法做抗生素耐药试验,实验规程按美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory
Standards Institute,CLSI)标准进行操作。 由于该菌株为革兰氏阴性菌,本实验选用四种常见并针对革兰氏阴
性菌的抗生素,分别为红霉素(15 滋g /片)、阿莫西林(20 滋g /片)、头孢拉定(30 滋g /片)、四环素(30 滋g /片),
药敏纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司,直径为 6 mm,于-20 益保存。 以大肠杆菌 ATCC 25922,铜绿假
单胞菌 ATCC 27853, 大肠杆菌 ATCC 35218为质控菌株。
1.2.4摇 重金属对抗生素抗性影响实验
本试验设计抗生素浓度一定时,即红霉素(15 滋g /片)、阿莫西林(20 滋g /片)、头孢拉定(30 滋g /片)、四环
素(30 滋g /片),不同浓度的重金属对菌株的抗生素抗性的影响。 移取 100 滋L菌悬液滴加至含重金属的试验
培养基上,涂布均匀。 15 min后,用小镊子夹取药敏纸片贴在涂好菌液的培养基上,每个平板上贴 3 片,每个
实验设置 3个平行样,于 37 益培养箱中培养 16—18 h,测量抑菌圈直径。
1.3摇 统计分析
采用 SPSS 17.0软件,以抗生素种类、重金属种类和重金属浓度为固定因子,抑菌圈直径为因变量,对数
据进行单变量多因素方差分析,显著性水平为 0.05。 抑菌圈直径变化率 k=(b-a) / a (a为未添加重金属时抑
菌圈直径,b为添加重金属后抑菌圈直径)。 采用 Origin 8.1 软件绘制不同浓度 Cu2+、Zn2+、Cr6+对四种抗生素
抗性影响的柱形图。
2摇 结果与分析
2.1摇 重金属最小抑制浓度确定
本研究采用最小二分法确定 Cu2+、Zn2+、Cr6+的最小抑制浓度分别为 125、125、100 mg / L。 根据重金属的
MIC值,重金属和抗生素交叉抗性试验中选取重金属 Cu2+和 Zn2+的浓度梯度为 0、0.1、2、10、50、100 mg / L,
Cr6+的浓度梯度为 0、0.1、2、20、50、80 mg / L。
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2.2摇 药敏结果
根据美国临床和实验室标准协会中药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准,以 R(耐药)、I(中介)、S(敏
感)表示,该菌株对红霉素、阿莫西林、头孢拉定和四环素 4种抗生素的敏感程度见表 1,发现该菌株对阿莫西
林和四环素有抗性,而对头孢拉定敏感。
表 1摇 Pseudomonas alcaligenes LH7的抗生素敏感性
Table 1摇 Susceptibility of Pseudomonas alcaligenes LH7 to antibiotics
抗生素
Antibiotic
纸片含药量
Disk Content /
(滋g /片)
CLSI推荐抑菌圈直径折点 / mm
Zone Diameter Breakpoints,nearest whole
耐药 R
Resistant(R)
中介 I
Intermediate(I)
敏感 S
Susceptible(S)
抑菌圈直径 / mm
Zone Diameter
敏感性判定
Sensitivity
determination
红霉素 Erythromycin 15 臆13 14—22 逸23 15.41 I
阿莫西林 Amoxicillin 20 臆13 14—17 逸18 7.95 R
头孢拉定 Cephradine 30 臆14 15—17 逸18 18.21 S
四环素 Tetracycline 30 臆11 12—14 逸15 6.92 R
2.3摇 重金属对菌体抗生素抗性的影响
2.3.1摇 重金属种类和浓度与抗生素抗性的相关性分析
方差分析发现重金属种类和浓度对抑菌圈直径影响显著(F种类 = 18.370,P种类<0.05;F浓度 = 47.335,P浓度<
0.05)。 另外,抗生素种类伊重金属种类、抗生素种类伊重金属浓度、重金属种类伊重金属浓度之间的二维交互
效应对抑菌圈直径也有极为显著的影响(P<0.05),甚至抗生素种类伊重金属种类伊重金属浓度之间的三维交
互效应对抑菌圈直径也有极为显著的影响(F= 32.605,P<0.05)(表 2)。 这表明对于菌株的抗性影响因素,除
抗生素种类、重金属种类和重金属浓度主因子外,抗生素种类伊重金属种类、抗生素种类伊重金属浓度、重金属
种类伊重金属浓度之间的二维交互效应以及抗生素种类伊重金属种类伊重金属浓度之间的三维交互效应也不
可忽略,重金属和抗生素存在交互作用,即重金属胁迫对细菌抗生素抗性响应有影响。
表 2摇 主效应方差分析
Table 2摇 Tests of Between鄄Subjects effects
方差来源
Source
芋型平方和
Type 芋 Sum of Squares df
均方
Mean Square F P
修正模型 Corrected Model 9785.531 70 139.793 70.460 0.000
截距平方和 Intercept 35001.775 1 35001.775 17641.861 0.000
抗生素种类 Antibiotic 3898.066 3 1299.355 654.911 0.000
重金属种类 Heavy Metals 72.892 2 36.446 18.370 0.000
重金属浓度 Concentration of Heavy Metals 657.394 7 93.913 47.335 0.000
抗生素种类伊重金属种类
Antibiotic伊Heavy Metals 1311.310 6 218.552 110.156 0.000
抗生素种类伊重金属浓度
Antibiotic伊Concentration of Heavy Metals 1541.242 20 77.062 38.841 0.000
重金属种类伊重金属浓度
Heavy Metals伊Concentration of Heavy Metals 309.866 8 38.733 19.523 0.000
抗生素种类伊重金属种类伊重金属浓度
Antibiotic 伊 Heavy Metals 伊 Concentration of
Heavy Metals
1552.510 24 64.688 32.605 0.000
误差 Error 281.731 142 1.984
总偏差平方和 Total 49899.870 213
修正总平方和 Corrected Total 10067.261 212
摇 摇 df自由度;F是 F统计量的值,用来检验模型的显著性;P 为差异性显著的检验值,P<0.05表示差异显著
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2.3.2摇 重金属浓度对抗生素抗性的影响
由图 1—图 3可知,重金属的加入对细菌的抗生素抗性有不同程度的影响。 从抑菌圈直径相对变化率来
看,重金属的加入对菌体四环素抗性的影响最为明显,而对头孢拉定的影响最不明显。 随着共存 Cu2+浓度升
高,四环素抑菌圈直径与空白相比,变化率也不断增大,分别为 115.32%(0.1 mg / L Cu2+),161.56%(2 mg / L
Cu2+),162.14%(10 mg / L Cu2+),171.97%(50 mg / L Cu2+),174.28%(100 mg / L Cu2+),而头孢拉定抑菌圈直径
变化率范围在 -16.80% — +11.26%;Zn2+共存时,菌体四环素抑菌圈直径变化率分别为 170.81%(0.1 mg / L
Zn2+),-100.00%(2 mg / L Zn2+),-100.00%(10 mg / L Zn2+),134.54%(50 mg / L Zn2+),140.03%(100 mg / L
Zn2+),而头孢拉定抑菌圈直径变化率范围很小,在 -9.12% — 34.65%之间; Cr6+共存使得菌体四环素抑菌圈
直径的变化率分别为 -100.00%(0.1 mg / L Cr6+),7.80%(2 mg / L Cr6+),-100.00%(20 mg / L Cr6+),-100.00%
(50 mg / L Cr6+),-100.00%(80 mg / L Cr6+),而头孢拉定抑菌圈直径的变化率明显随着 Cr6+浓度的升高而逐渐
增大,分别为 1.26%(0.1 mg / L Cr6+),15.65%(2 mg / L Cr6+),22.30%(20 mg / L Cr6+),40.91%(50 mg / L Cr6+),
53.32%(80 mg / L Cr6+)。
图 1摇 Cu2+对抗生素抗性的影响
Fig.1摇 Effect of copper on antibiotic resistance 图 2摇 Zn2+对抗生素抗性的影响
Fig.2摇 Effect of zinc on antibiotic resistance
图 3摇 Cr6+对抗生素抗性的影响
Fig.3摇 Effect of chrome on antibiotic resistance
重金属对细菌抗生素抗性的影响主要表现为促进
作用和抑制作用,即重金属和抗生素间的交互作用表现
为协同抗性和协同杀菌,且随重金属种类和浓度的不同
而改变,可将交叉抗性组合分为 3 种类型。 第 1 种,低
浓度的重金属离子与抗生素共存表现为协同抗性,而高
浓度重金属离子与抗生素共存表现为协同杀菌,如 Cr6+
或 Zn2+与红霉素,Cu2+与头孢拉定。 低浓度的 Cr6+或
Zn2+与红霉素共存时,测得的抑菌圈直径均小于空白组
的抑菌圈直径 15.41mm,即低浓度的 Cr6+和 Zn2+使得菌
株红霉素抗性增强,Cr6+或 Zn2+与红霉素之间表现为协
同抗性;而高浓度的 Cr6+或 Zn2+与红霉素共存时,菌株
红霉素抗性减弱,此时 Cr6+或 Zn2+与红霉素之间表现为
协同杀菌。 第 2种,与第 1 种类型相反,即高浓度的重
金属离子与抗生素共存表现为协同抗性,而低浓度重金属离子与抗生素共存表现为协同杀菌,如 Cr6+或 Zn2+
与阿莫西林。 低浓度的 Cr6+或 Zn2+与阿莫西林共存时,测得抑菌圈直径均大于空白组的抑菌圈直径7.95 mm,
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即低浓度 Cr6+或 Zn2+使得 Pseudomonas alcaligenes LH7对阿莫西林的抗性减弱,Cr6+或 Zn2+与阿莫西林之间表
现为协同杀菌;而高浓度的 Cr6+或 Zn2+与阿莫西林共存时,菌株对阿莫西林的抗性增强,此时 Cr6+或 Zn2+与阿
莫西林之间表现为协同抗性。 这两类抗性组合都存在重金属折点浓度,且因抗性组合而异。 如与阿莫西林共
存时,Cu2+、Cr6+的折点浓度 50 mg / L,而 Zn2+的折点浓度为 10mg / L。 第 3种,菌体的抗生素抗性变化只与重金
属种类相关,如 Cu2+的共存导致菌体的四环素抗性减弱,敏感性从 R 变成 S,类似的还有 Cu2+与阿莫西林及
Cr6+与头孢拉定,而 Cu2+的共存导致菌体的红霉素抗性明显增强,敏感性从 I变成 R(表 3)。
表 3摇 重金属共存对抗生素敏感性的影响
Table 3摇 Effect of heavy metals on susceptibility of Pseudomonas alcaligenes LH7
重金属
Heavy Metals
浓度 / (mg / L)
Concentration
敏感性判定 Sensitivity Determination
红霉素
Erythromycin
阿莫西林
Amoxicillin
头孢拉定
Cephradine
四环素
Tetracycline
Cr6+ 0c I R S R
0.1 R R S R
2 R R S R
20 R R S R
50 I S S R
80 S R S R
Cu2+ 0c I R S R
0.1 R R I I
2 R R S S
10 R R S S
50 R I S S
100 R R S S
Zn2+ 0c I R S R
0.1 R I S S
2 R S I R
10 I S S R
50 S I S I
100 S R S I
摇 摇 c 空白
3摇 讨论
从养殖废水中筛选出的菌株 Pseudomonas alcaligenes LH7具有重金属(Cu2+、Zn2+、Cr6+)抗性和抗生素(红
霉素、阿莫西林、头孢拉定、四环素)抗性,菌体的重金属抗性强弱顺序为 Cu2+ = Zn2+> Cr6+。 Matyar 等[23]也从
海水及沉积物中分离得到具有重金属和抗生素抗性的假单胞菌,发现菌体的重金属抗性强弱顺序为 Cu > Cd
> Mn > Zn > Cr > Pb,且同时对多种抗生素表现出抗性[24]。 对于菌体同时具有重金属和抗生素抗性的原因,
可能是与许多抗生素和重金属抗性基因位于相同的移动遗传元件(MGEs),如质粒、转座子和整合子有关[2]。
重金属种类和浓度对菌株的抗生素抗性有很大影响(P<0.05)。 重金属和抗生素的交互作用主要表现在
协同抗性和协同杀菌。 具有协同抗性的抗性组合有 Cu2+与红霉素,低浓度的 Cr6+、Zn2+与红霉素及高浓度的
Cr6+、Zn2+与阿莫西林。 孙建平等[18]研究了抗生素和重金属联合毒性作用下对发光细菌的影响,发现金霉素
与 Cu(域)存在拮抗作用,金霉素的抑制作用随 Cu(域)浓度的增加而减小。 协同抗性是指重金属抗性基因和
抗生素抗性基因定位于同一个遗传元件上,如质粒、转座子或整合子,通过转化、质粒消除和质粒测序方法已
经证明重金属和抗生素抗性基因常常定位于质粒上[25鄄26]。 除了基因上的联系,重金属与抗生素之间的吸附
作用、络合作用也可能是其协同抗性的原因。 Jia 等[27]研究发现重金属铜和四环素共存时,会影响它们在土
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壤上的吸附行为,四环素增加了 Cu在两种土壤上的吸附量。 H觟lzel等[28]研究发现锌离子与四环素会形成稳
定的络合物,锌离子会抑制肠道对四环素的吸收,使得瞬时肠道(及排泄的)中的四环素浓度瞬时增大。 而这
种螯合作用对母药的抑菌效力的影响还有待进一步研究。
而具有协同杀菌作用的抗性组合有 Cu2+与四环素或阿莫西林,Cr6+与头孢拉定,低浓度的 Zn2+与阿莫西
林以及高浓度的 Cu2+与头孢拉定, Zn2+与四环素。 相类似地,孙建平等研究发现金霉素与 Zn(域)之间为相
加作用[18]。 在重金属、外源性化合物、有机溶剂的选择压力下,细菌的抗生素抗性基因会受到影响[29]。 某些
金属(例如 Ca、Co、Cr、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Na、Ni和 Zn)是必要的,作为微量营养素,用于氧化还原过程,以通过
静电作用稳定分子,作为多种酶的组成部分和调节渗透压[30]。 有研究表明重金属会引起亚致死损伤,这可能
会增加细菌对抗生素的敏感性[28]。 另外,同一交叉抗性组合在低浓度和高浓度的表现出的作用类型有所不
同,可能有 3种原因,第一,不同浓度重金属的毒性不同,低浓度的重金属可作为微量营养素刺激微生物生长,
高浓度的重金属与酶或 DNA结合,或产生氧自由基发生 Fenton 反应,表现为毒性增强,抑制微生物的生长繁
殖,延长微生物的增代时间,如 0.5 mM的 Zn2+可以抑制大肠杆菌的生长,10 mM浓度的 Zn2+可以减少大肠杆
菌的存活[31鄄32]。 所以,在低浓度表现为协同抗性,高浓度表现为协同杀菌。 然而,某些重金属既有毒性,又有
致突变性,如 Cr6+会引起细菌 DNA码组错位突变和碱基对替换[33],这就使得高浓度的 Cr6+与阿莫西林表现为
协同抗性。 第二,重金属与抗生素间的络合作用,如重金属阳离子与四环素类抗生素间的配合作用[34],铜
(域),镍(域),钴(域)与头孢拉定的氨基和羰基形成络合物[35]。 由于形成的络合物对细菌的影响还不明确,
有以下 3种可能:(1)络合物无毒性;(2)络合物低毒性;(3)络合物高毒性。 四环素与 Zn2+共存时,四环素抗
性随 Zn2+浓度的增大表现为先减弱后增强再减弱,可能是由于 Zn2+与四环素形成的络合物无毒或低毒,在低
浓度时,以抗生素和重金属的毒性为主,在一定范围的高浓度,以络合作用后四环素或重金属的毒性为主,超
过临界浓度时,则以重金属的毒性为主。 第三,与抗生素的种类有关,种类不同,抗菌作用机制也不同。 红霉
素和四环素主要抑制蛋白质的形成,阿莫西林和头孢拉定则抑制细胞壁的合成。 细菌的耐药作用可能需要某
些重金属的参与,如 Zn2+与阿莫西林共存时,阿莫西林属 茁鄄内酰胺青霉素类抗生素,产生 茁鄄内酰胺酶是细菌
耐药的重要机制之一,其中金属 茁鄄内酰胺酶为 茁鄄内酰胺酶中的一类,需要金属离子 Zn2+作辅因子[36]。 此外,
微生物的不同发育阶段对重金属敏感性不同[32],失活的菌体对某些重金属还具有一定的吸附作用或还原作
用,如 Cr6+,有研究发现用失活的黑曲霉吸附水体中的 Cr6+时,发现吸附在菌体上的铬大部分以 Cr3+存在,说
明失活菌体对在吸附 Cr6+的过程中还有较好的还原作用[37]。 因此,重金属的浓度与抗生素抗性之间有着很
复杂的关系。
4摇 结论
(1)从养殖废水分离出的革兰氏阴性杆菌 Pseudomonas alcaligenes LH7 具有 3 种重金属抗性和 4 种抗生
素抗性,对重金属抗性强弱顺序为 Cu2+ = Zn2+> Cr6+。
(2)重金属作用下,对菌株的抗生素抗性有显著影响。 抗生素种类、重金属种类和重金属浓度、抗生素种
类伊重金属种类、抗生素种类伊重金属浓度、重金属种类伊重金属浓度之间的二维交互效应以及抗生素种类伊重
金属种类伊重金属浓度之间的三维交互效应对抑菌圈直径有极为显著的影响(P<0.05)。 重金属的加入对四
环素抗性的影响最为明显,而对头孢拉定的影响最不明显。
(3) 重金属和抗生素的交互作用主要表现为协同抗性和协同杀菌,浓度对交叉抗性组合的影响主要分为
3种类型。 在低浓度表现为协同抗性,高浓度表现为协同杀菌的抗性组合有 Cr6+或 Zn2+与红霉素,Cu2+与头孢
拉定;在低浓度表现协同杀菌,高浓度表现为协同抗性的抗性组合有 Cr6+或 Zn2+与阿莫西林;菌体的抗生素抗
性变化只与重金属种类相关的抗性组合有 Cu2+与四环素或阿莫西林或红霉素,Cr6+与头孢拉定。
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