全 文 ：第７卷第３期
２００９年５月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．３
Ｍａｙ２００９
收稿日期：２００８－１２－２６
基金项目：国家杰出青年基金资助项目（２０６２５６１９）；食品科学与技术国家重点实验室科研基金资助项目（ＳＫＬＦＭＢ２００８０２）；江苏省自然科学
基金资助项目（ＢＫ２００７０１９）
作者简介：成 成（１９８５—），男，江苏泰州人，硕士研究生，研究方向：发酵工程及酶工程；吴 敬（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｊｉｎｇｗｕ＠ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
利用重组大肠杆菌生产 α 环糊精葡萄糖基转移酶
成 成１，２，李兆丰１，２，李 彬１，２，刘 花１，２，陈 坚１，２，吴 敬１，２
（１．江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，无锡 ２１４１２２；
２．江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘 要：将来源于软化类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｕｓｍａｃｅｒａｎｓ）的α 环糊精葡萄糖基转移酶（α ＣＧＴ）基因插入含ｐｅｌＢ
信号肽的质粒ｐＥＴ ２０ｂ（＋）中，构建了表达载体ｐＥＴ ２０ｂ（＋）／ｃｇｔ，并将其转化表达宿主 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）。对重
组菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１／ｐＥＴ ｃｇｔ进行摇瓶发酵条件的优化，确定了其胞外表达α ＣＧＴ酶的最适条件：葡萄糖８ｇ／Ｌ，乳
糖 ０５ｇ／Ｌ，蛋白胨１２ｇ／Ｌ，酵母膏２４ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４７２ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４１７ｍｍｏｌ／Ｌ，ＣａＣｌ２２５ｍｍｏｌ／Ｌ；初始ｐＨ为７０，
诱导温度为２５℃。在该条件下培养９０ｈ后最终α ＣＧＴ酶的胞外比活达到２２１Ｕ／ｍＬ，与来源菌 Ｐｍａｃｅｒａｎｓ所产
天然酶比活相比提高了４２倍，实现了 α ＣＧＴ酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于３Ｌ发酵罐中发酵，
９０ｈ后胞外酶比活达到２２６Ｕ／ｍＬ，证实了工业化放大的可能性。
关键词：α 环糊精葡萄糖基转移酶；ｃｇｔ基因；大肠杆菌；克隆
中图分类号：Ｑ５５５＋４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０３－００５６－０８
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆαｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｎ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
ＣＨＥＮＧＣｈｅｎｇ１，２，ＬＩＺｈａｏｆｅｎｇ１，２，ＬＩＢｉｎ１，２，ＬＩＵＨｕａ１，２，ＣＨＥＮＪｉａｎ１，２，ＷＵＪｉｎｇ１，２
（１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，
ＪｉａｎｇｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：αＣｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（αＣＧＴａｓｅ）ｇｅｎｅｆｒｏｍＰａｅｎｉｂａｃｉｌｕｓｍａｃｅｒａｎｓｗａｓｃｌｏｎｅｄ
ａｎｄｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ２０ｂ（＋）ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｓｅｃｒｅｔｉｖｅｐｅｌＢａｓｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．Ｔｈｅ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐＥＴ２０ｂ（＋）／ｃｇｔｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｆｏｒｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆαＣＧＴａｓｅｉｎｓｈａｋｉｎｇｆｌａｓｋｗｅｒｅｄｅｔｅｒ
ｍｉｎｅｄａｓｆｏｌｏｗｓ：８ｇ／Ｌｇｌｕｃｏｓｅ，０５ｇ／Ｌｌａｃｔｏｓｅ，１２ｇ／Ｌｐｅｐｔｏｎｅ，２４ｇ／Ｌｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，７２ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４，１７ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４，２５ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，ｉｎｉｔｉａｌｐＨ７０ａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ２５℃．
Ｗｉｔｈｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔαＣＧＴａｓｅｏｆｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｃｈｉｅｖｅｄ２２１Ｕ／ｍＬ
ａｆｔｅｒ９０ｈ，ｉｔｗａｓａｂｏｕｔｆｏｒｔｙｔｗｏｔｉｍｅｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｐａｒｅｎｔｓｔｒａｉｎＰ．ｍａｃｅｒａｎｓ．Ｗｈｅｎｔｈｅｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｅｄｓｔｒａｉｎｗａｓｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｉｎ３Ｌｆｅｒｍｅｎｔｏｒ，αＣＧＴａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｒｅａｃｈｅｄ２２６Ｕ／ｍＬ，
ｔｈｕｓｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆαＣＧＴａｓｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：αｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ｃｇｔｇｅｎｅ，Ｅ．ｃｏｌｉ；ｃｌｏｎｉｎｇ
环糊精葡萄糖基转移酶 （简称 ＣＧＴ，ＥＣ
２４１１９）是糖基水解酶 α 淀粉酶家族（家族１３）
的重要成员，它是一种胞外酶。该酶工业应用的基
础是能将淀粉通过环化反应转化为环糊精（简称
ＣＤ）。在ＣＤｓ中最常用的是 α 、β 、γ ＣＤ，它们
分别由６、７、８个Ｄ 吡喃葡萄糖单元构成［１－２］。环
糊精在食品、医药、农业、纺织、环保和分析化学等
领域具有广泛的应用［３］。环糊精的工业化生产均
采用酶法合成，但由于野生菌株的产酶能力普遍较
低，ＣＧＴ的产量远不能满足环糊精工业化生产的要
求，同时由于转化率低、提纯制备以及分离困难等
原因导致环糊精生产成本太高，其应用受到了很大
限制。为了有效降低环糊精的生产成本，大幅度提
高ＣＧＴ产量起着至关重要的作用［４］，因此，采用重
组ＤＮＡ技术生产ＣＧＴ越来越得到重视。
ＣＧＴ在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达产物大多是以不溶性包涵
体形式存在［５－７］，而这种包涵体的活化需要复杂的
过程［８］，这些都不利于重组 ＣＧＴ的工业化生
产［９－１０］。因此，通过优化表达系统或表达条件来实
现ＣＧＴ在Ｅ．ｃｏｌｉ中的胞外高效表达是迫切需要的。
Ｌｅｅ等［１１］的研究，成功实现了 β ＣＧＴ的过量胞外
生产，胞外酶比活达到２１６Ｕ／ｍＬ。
本研究将来源于软化类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｕｓ
ｍａｃｅｒａｎｓ）ＪＦＢ０５０１的 α ＣＧＴ酶基因插入到含分
泌型信号肽ｐｅｌＢ的质粒ｐＥＴ ２０ｂ（＋）并高效表达于
宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中，对出发培养基、温度、
ＩＰＴＧ浓度、Ｃ源、乳糖诱导、初始 ｐＨ以及金属离子
等因素进行了考察，同时运用优化后条件进行３Ｌ发
酵罐发酵验证。
１ 材料与方法
１１ 材料
１１１ 菌株和质粒
Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓＪＦＢ０５０１由本研究室筛选（保藏号
ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ２０８０６３）［１２］；克隆宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９、
表达宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）、克隆质粒ｐＭＤ１８ Ｔ
ｓｉｍｐｌｅ和表达质粒 ｐＥＴ ２０ｂ（＋）均购自大连宝生物
工程有限公司。
１１２ 主要试剂和仪器
ＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、限制性内切
酶ＮｃｏＩ和ＥｃｏＲＩ、胶回收试剂盒等均购自大连宝生
物工程有限公司；α 环糊精购自 Ｓｉｇｍａ公司；质粒
小量提取试剂盒、ＩＰＴＧ（异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖
苷）等试剂购自上海生工生物工程有限公司；工业
级蛋白胨购自上海上食肉类有限公司；酵母膏（工
业级）购自宜昌安琪酵母有限公司。其他常规试剂
采用进口分装或国产。
ＰＣＲ仪、蛋白电泳仪、ＵＶＰ凝胶成像系统均购自
美国ＢＩＯＲＡＤ公司；其他仪器有：北京六一ＤＹＹ ６Ｃ
型电泳仪；美国ＳＯＮＩＣＭＡＴＥＲＩＡＬＳ超声波破碎仪；
美国ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＢｉｏＦｌｏ１１０发酵罐。
１１３ 培养基
ＬＢ培养基、ＳＯＢ培养基、ＳＯＣ培养基、ＳＢ培养
基和ＴＢ培养基参照文献［１１］配制。
１２ αＣＧＴ酶基因的克隆
菌株 ＪＦＢ０５ ０１基因组 ＤＮＡ采用 ＣＴＡＢ法提
取。以该基因组 ＤＮＡ为模板，根据 ＮＣＢＩ数据库中
Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓα ＣＧＴ酶基因序列设计分别含ＮｃｏＩ和
ＥｃｏＲＩ位点的两端引物（上游引物 Ｐ１：５’ ＣＡＴＡＴ
ＧＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＣＧＡＴＡＣＧＡＧＣＧＴＧＧＡＣ ３’和
下游引物Ｐ２：５’ ＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＴＴＴＧＣＣＡＧＴＣ
ＣＡＣＣＧＴＣ ３’），用Ｐｙｒｏｂｅｓｔ聚合酶扩增 α ＣＧＴ酶
基因。将扩增的不含自身信号肽的α ＣＧＴ酶基因
与ｐＭＤ１８ Ｔｓｉｍｐｌｅ载体连接并转化宿主 Ｅ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９，采用蓝白斑筛选后将阳性菌株在含有
１００μｇ／ｍＬ氨苄青霉素（Ａｍｐ）的ＬＢ培养基中培养过
夜，提取质粒并采用酶切电泳和测序鉴定。序列测定
由上海生工生物工程有限公司完成。
１３ ＮｃｏＩ位点的突变
由于Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓα ＣＧＴ酶基因内部含有一个
ＮｃｏＩ位点，为了进一步将基因亚克隆到表达载体，以
质粒ｐＭＤ１８ Ｔｓｉｍｐｌｅ／ｃｇｔ为模板，设计一对互补引
物（正向引物：５’ ＣＡＡＴＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣ
ＣＡＧＣＣＧ ３’和反向引物：５’ ＣＧＧＣＴＧＧＣＣＣＡＴＴ
ＧＴＧＧＧＡＣＣＣＡＣＡＴＴＧ ３’），采用一步 ＰＣＲ法突变
α ＣＧＴ酶基因中的 ＮｃｏＩ位点，但不改变氨基酸序
列。将ＰＣＲ产物用ＤｐｎＩ处理后转化到宿主 Ｅ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９中，挑取单克隆在含有１００μｇ／ｍＬＡｍｐ的 ＬＢ
培养基中培养过夜，提取质粒并采用酶切电泳鉴定。
１４ 表达载体ｐＥＴ ２０ｂ（＋）／ｃｇｔ的构建与转化
将已突变 ＮｃｏＩ位点的质粒 ｐＭＤ１８ Ｔｓｉｍｐｌｅ／
ｃｇｔ通过ＮｃｏＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后回收目的片段，再
与通过同样酶切处理的含有ｐｅｌＢ信号肽和Ｈｉｓｔａｇ的
质粒ｐＥＴ ２０ｂ（＋）用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接；连接产物
转化 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９，挑取单克隆在含有１００μｇ／ｍＬ
Ａｍｐ的ＬＢ培养基中培养过夜，提取质粒并采用酶切
７５ 第３期 成 成等：利用重组大肠杆菌生产α 环糊精葡萄糖基转移酶
电泳和测序鉴定，最终得到含有正确序列的表达载体
ｐＥＴ ２０ｂ（＋）／ｃｇｔ，并将其转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）。
１５ 摇瓶发酵产α ＣＧＴ
从甘油管中将重组菌 ＥｃｏｌｉＢＬ２１／ｐＥＴｃｇｔ接
种于含有１００μｇ／ｍＬＡｍｐ的 ＬＢ培养基中，３７℃，
２００ｒ／ｍｉｎ摇床上，振荡培养１０ｈ后，按 ４％的接种
量接种至新鲜发酵培养基中，２００ｒ／ｍｉｎ摇床培养至
ＯＤ６００＝２０后加入一定量的 ＩＰＴＧ诱导，并在一定
温度下培养一段时间。
１６ 渗透压法提取α ＣＧＴ
取１ｍＬ的发酵液于１００００ｒ／ｍｉｎ下离心２０ｍｉｎ，
收集菌体并将菌体用纯水洗涤２遍，离心后菌体被
悬浮于内含１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ的２５０ｇ／Ｌ蔗糖溶液中，
并定容至１ｍＬ，在冰水浴中保存一定时间，离心后
上清液中的α ＣＧＴ酶活粗略替代周质组分中的可
溶性α ＣＧＴ酶活。
１７ ３Ｌ产α ＣＧＴ发酵罐培养条件
将在种子培养基中培养好的种子按５％的接种量
接入３Ｌ全自动发酵罐ＮＢＳ中，装液量１５Ｌ，搅拌转速
２００ｒ／ｍｉｎ，通气量１５Ｌ／ｍｉｎ，３７℃培养至ＯＤ６００＝２０
后加入诱导剂并降温至２５℃诱导培养９０ｈ。
１８ 菌体浓度的测定
菌体浓度利用分光光度计测定发酵液在
６００ｎｍ波长处的吸光度ＯＤ６００来确定。
１９ α ＣＧＴ酶活力的测定
α ＣＧＴ除了能催化环化反应生成环糊精，它
还能歧化、耦合和水解３个反应，因此理论上这４个
反应的活力均可用来评价 ＣＧＴ的多少。由于环化
反应是ＣＧＴ的特征反应，因此在环湖精制备工艺中
较为客观评价ＣＧＴ的活力应检测其环化能力。
利用甲基橙法测定α ＣＧＴ酶活［１３］。酶活单位
（Ｕ）定义为每分钟生成１μｍｏｌα 环糊精所需的酶量。
２ 结果与讨论
２１ 表达载体ｐＥＴ ２０ｂ（＋）／ｃｇｔ的构建
图１为表达载体 ｐＥＴ ２０ｂ（＋）／ｃｇｔ的构建框架
图。以ＪＦＢ０５ ０１的基因组 ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增
得到目的基因ｃｇｔ片段，其长度大小经凝胶电泳验证
为２１ｋｂ（图 ２）。将 ｃｇｔ基因片段插入ｐＭＤ１８ Ｔ
ｓｉｍｐｌｅ质粒中，测序后发现ｃｇｔ基因所编码的氨基酸
序列与网上氨基酸序列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：
Ｐ０４８３０）完全一致。由于在目的基因片段大约
１５００ｂｐ处本身存在一个ＮｃｏＩ位点，为了避免双酶
切时将目的基因切断，必须将目的基因片段中的
ＮｃｏＩ位点消除。定点突变前后 ＮｃｏＩ和 ＥｃｏＲＩ双
酶切验证结果如图３所示，电泳条带由３条变成２
条，证明基因片段中的 ＮｃｏＩ位点已经成功消除。
表达载体ｐＥＴ ２０ｂ（＋）／ｃｇｔ的 ＮｃｏＩ和 ＥｃｏＲＩ双酶
切验证结果如图４所示，电泳显示２条明显的条带，
图１ 重组表达质粒ｐＥＴ ２０ｂ（＋）／ｃｇｔ的构建
Ｆｉｇ．１ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ
ｐＥＴ ２０ｂ（＋）／ｃｇｔ
Ｍ—λ ＥｃｏＴ１４Ｉｄｉｇｅｓｔ；１—ｃｇｔｇｅｎｅ
图２ ｃｇｔ基因琼脂糖凝胶电泳图
Ｆｉｇ．２ Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｃｇｔｇｅｎｅ
８５ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图３ 定点突变前后重组质粒ｐＭＤ１８Ｔｓｉｍｐｌｅ／ｃｇｔ酶切
电泳验证
Ｆｉｇ．３ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓ
ｍｉｄｐＭＤ１８Ｔｓｉｍｐｌｅ／ｃｇｔｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｓｉｔｅ
ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
条带大小与预期相符，证明 α ＣＧＴ酶基因已成功
连接到ｐＥＴ ２０ｂ（＋），且测序结果证实了该表达载
体中所插入ｃｇｔ基因编码的氨基酸序列完全正确。
２２ α ＣＧＴ表达的摇瓶发酵条件优化
２２１ 出发培养基的选择
为了选择适合重组大肠杆菌表达α ＣＧＴ酶并
可用于下步优化的出发培养基，分别将它们置于５
种典型的大肠杆菌培养基（ＬＢ、ＳＯＢ、ＳＯＣ、ＳＢ和
ＴＢ）中进行培养，结果如图５所示。由图５可知，ＴＢ
培养基最有利于 α ＣＧＴ酶的表达，胞外酶比活达
到６４Ｕ／ｍＬ，ＳＢ培养基次之。分析其主要原因可
能是：１）ＴＢ和 ＳＢ培养基适合菌体生长，因此有更
多的菌体生产 α ＣＧＴ；２）ＴＢ和 ＳＢ培养基中含有
２０ｇ／Ｌ的酵母膏，明显高于其他培养基（５ｇ／Ｌ），而
Ｍ１—λＥｃｏＴ１４Ｉｄｉｇｅｓｔ；Ｍ２—ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；
１—ｐＥＴ２０ｂ（＋）／ｃｇｔ／ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ
图４ 表达载体ｐＥＴ ２０ｂ（＋）／ｃｇｔ酶切电泳验证
Ｆｉｇ．４ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ２０ｂ（＋）／ｃｇｔ
图５ 出发培养基对菌体生长和表达α ＣＧＴ的比较
Ｆｉｇ．５ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｂａｓｉｃｍｅｄｉｕｍｆｏｒｃｅｌｇｒｏｗｔｈａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆαＣＧＴａｓｅ
以前的报道显示酵母膏对重组酶释放到大肠杆菌
的周质空间具有明显的促进作用。因此选择 ＴＢ培
养基作为优化的出发培养基。
２２２ 温度对α ＣＧＴ表达的影响
在不同温度下对工程菌分别进行培养，α ＣＧＴ
酶表达结果见图６，图７为培养至９０ｈ后的菌体浓
度。由图６、图７可知，在培养至９０ｈ后，各温度条件
下的胞外酶活均达到较稳定水平，其中２５℃最适合
α ＣＧＴ的表达，比酶活达到最高为６６Ｕ／ｍＬ；当温
度较高时，虽然更适合菌体生长，但α ＣＧＴ的表达
受到明显抑制，３７℃下基本上没有 ＣＧＴ酶的胞外
表达，但当温度太低（２０℃）时，胞外比酶活仅为
２５Ｕ／ｍＬ。可能的原因是：１）高温下质粒的稳定性
大大降低，质粒丢失率较高，从而影响产酶水平；２）
较高的培养温度，重组酶的合成速率太快，来不及
９５ 第３期 成 成等：利用重组大肠杆菌生产α 环糊精葡萄糖基转移酶
跨膜转运就可能在胞内形成包涵体。而培养温度
太低时，重组酶的合成速率会降低，也限制了其表
达产量［１４］，因此选择２５℃作为培养温度。从图 ６
还可以看出，酶活的分泌有一滞后期，导致发酵周
期较长，培养时间定为９０ｈ。
图６ 不同诱导温度下α ＣＧＴ表达的时间过程曲线
Ｆｉｇ．６ ＴｉｍｅｃｏｕｒｓｅｓｏｆαＣＧＴａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅ
ｍｅｄｉｕｍａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
图７ 诱导温度对菌体生长的影响
Ｆｉｇ．７ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｃｅｌｇｒｏｗｔｈ
２２３ ＩＰＴＧ浓度对α ＣＧＴ表达的影响
在培养过程中加入不同浓度的 ＩＰＴＧ进行诱
导，诱导剂浓度对菌体生长和 α ＣＧＴ产酶的影响
如图８所示，随ＩＰＴＧ浓度的增加，菌体浓度呈下降
趋势，说明 ＩＰＴＧ的添加对细胞生长有一定的副作
用。较低的ＩＰＴＧ浓度才有利于α ＣＧＴ的表达，以
００１ｍｍｏｌ／Ｌ为最佳，胞外比酶活达到６８Ｕ／ｍＬ，当
ＩＰＴＧ浓度高于００１ｍｍｏｌ／Ｌ时，随 ＩＰＴＧ浓度升高
α ＣＧＴ酶 活 反 而 降 低，当 ＩＰＴＧ 浓 度 达 到
０４ｍｍｏｌ／Ｌ时，产酶活力仅为００１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ浓
度时的２８％。可能的原因是：ＩＰＴＧ用量过大不仅
导致菌体量减少，而且可能会导致重组酶合成速率
太快，以至于它们来不及正确折叠和转运就已经在
胞内形成包涵体。
２２４ Ｃ源对α ＣＧＴ表达的影响
按照含Ｃ质量分数相等的原则，以７种 Ｃ源：
图８ ＩＰＴＧ浓度对菌体生长和α ＣＧＴ表达的影响
Ｆｉｇ．８ ＥｆｅｃｔｓｏｆＩＰＴＧｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｃｅｌｇｒｏｗｔｈａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆαＣＧＴａｓｅ
可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、糊精、麦芽糖和果
糖分别代替基础培养基 ＴＢ中的４ｇ／Ｌ甘油进行 Ｃ
源单因素实验，结果如表１所示。由表１可知，以葡
萄糖和乳糖为Ｃ源的培养基，更适合 α ＣＧＴ酶的
胞外分泌。其主要原因为：菌体可以更好地利用葡
萄糖和乳糖作为Ｃ源，用于维持较高水平的代谢活
性和目的蛋白的表达量；而乳糖作为一种可诱导大
肠杆菌 ｌａｃ操纵子表达系统的诱导 Ｃ源，不仅可以
提供菌体生长所需的 Ｃ源，而且作为诱导剂被菌体
利用后会促使目的蛋白的表达。考虑到降低生产
成本的需要，故可将葡萄糖作为培养基的主要 Ｃ
源，并添加一定浓度的乳糖代替ＩＰＴＧ作为诱导剂。
表１ Ｃ源对α ＣＧＴ表达的影响
Ｔａｂｌｅ１ ＥｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆαＣＧＴａｓｅ
Ｃ源 α ＣＧＴ比酶活／（Ｕ·ｍＬ－１）
甘油 ６７８
可溶性淀粉 ６５６
蔗糖 ５８６
葡萄糖 １０１９
乳糖 １１３３
糊精 ３６９
麦芽糖 ６３４
果糖 ６９２
图９为添加不同质量浓度的葡萄糖对工程菌生
长和产酶活力的影响。由图９可以看出，８ｇ／Ｌ葡萄
糖最适合菌体生长和 α ＣＧＴ的胞外分泌，胞外比
酶活达到１６２Ｕ／ｍＬ，而继续增加葡萄糖反而会抑
制菌体生长和酶的胞外分泌。可能原因是：葡萄糖
添加过量会造成菌体的比生长速率过大，产生过高
浓度的代谢副产物乙酸，从而影响菌体的生长和外
源蛋白的表达。
０６ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图９ 葡萄糖质量浓度对菌体生长和α ＣＧＴ
表达的影响
Ｆｉｇ．９ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｇｌｕｃｏｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｃｅｌｇｒｏｗｔｈａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆαＣＧＴａｓｅ
２２５ 乳糖诱导对α ＣＧＴ表达的影响
前期考察了乳糖作为 Ｃ源与诱导剂双重角色
对工程菌产α ＣＧＴ的促进性作用，确定在以８ｇ／Ｌ
葡萄糖为Ｃ源的培养基中添加一定质量浓度的乳
糖替换００１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ进行诱导表达。不同质
量浓度的乳糖对于菌体生长及产α ＣＧＴ比酶活的
影响如图１０所示。以００１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导作为
对照，由图 １０可知，当加入乳糖终质量浓度为
００５ｇ／Ｌ时就可以促进重组 α ＣＧＴ的表达；添加
乳糖终质量浓度为０５ｇ／Ｌ时菌体浓度达到最大，胞
外酶活最高，达到１９４Ｕ／ｍＬ，为对照的１２倍，此
后随乳糖质量浓度的升高，菌体量和 α ＣＧＴ活均
有所下降，说明乳糖质量浓度过高会抑制菌体生长
和目的蛋白的表达。
１—００１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ；２～７—分别为００５、０２５、０５、
１０、２０、３０ｇ／Ｌ乳糖
图１０ 乳糖诱导对菌体生长和α ＣＧＴ酶
表达的影响
Ｆｉｇ．１０ Ｅｆｅｃｔｏｆｌａｃｔｏｓｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｎｃｅｌｇｒｏｗｔｈａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆα ＣＧＴａｓｅ
２２６ 初始ｐＨ对α ＣＧＴ表达的影响
发酵培养基的不同初始 ｐＨ对菌体生长及 α
ＣＧＴ表达的影响如图１１所示。由图１１可知，初始
ｐＨ对工程菌的生长和α ＣＧＴ表达有显著的影响，
当初始ｐＨ为７０时，菌体量和比酶活均达到最高，
胞外比酶活达到１９８Ｕ／ｍＬ，而太低或太高的初始
ｐＨ不利于菌体生长和 α ＣＧＴ的表达。因此发酵
初始ｐＨ控制在７０左右。
图１１ 初始ｐＨ对菌体生长和α ＣＧＴ表达的影响
Ｆｉｇ．１１ ＥｆｅｃｔｓｏｆｉｎｉｔｉａｌｐＨｏｎｃｅｌｇｒｏｗｔｈａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆαＣＧＴａｓｅ
２２７ 金属离子对α ＣＧＴ表达的影响
图１２ 金属离子对α ＣＧＴ酶表达的影响
Ｆｉｇ．１２ ＥｆｅｃｔｓｏｆｍｅｔａｌｉｏｎｓｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆαＣＧＴａｓｅ
金属离子是细胞生长和维持酶活性构象的必
要因素。在发酵培养基中分别加入浓度为
２５ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、
Ｆｅ２＋及Ｆｅ３＋等不同金属离子，培养９０ｈ后测定胞外
α ＣＧＴ比酶活，结果如图１２所示。由图１２可知，
金属离子Ｃａ２＋和 Ｃｕ２＋对工程菌的生长和 α ＣＧＴ
表达有显著促进作用，加入Ｃａ２＋后胞外比酶活达到
２２１Ｕ／ｍＬ，与来源菌Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓ所产胞外酶的α
环化比活力相比提高了４２倍，而且也达到甚至超过
了其他来源 ＣＧＴ酶在大肠杆菌中胞外表达的水
平［１１］。而Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋及 Ｆｅ３＋会抑制菌
体生长和α ＣＧＴ表达，尤其Ｃｏ２＋更为突出，Ｍｇ２＋对
菌体生长和α ＣＧＴ酶表达影响不明显。Ｃａ２＋对产
酶具有促进作用的可能原因是：一方面 Ｃａ２＋的加入
改变了细胞膜的通透性从而促进所表达α ＣＧＴ更
１６ 第３期 成 成等：利用重组大肠杆菌生产α 环糊精葡萄糖基转移酶
高效地分泌到胞外；另一方面可能提高了酶的稳定
性。至于Ｃｕ２＋如何促进工程菌发酵产酶，其机理还
有待进一步研究。
２３ ３Ｌ发酵罐上的发酵验证
为了能将本研究构建的基因工程菌更好地应
用于工业化生产重组 α ＣＧＴ，在经过摇瓶水平的
发酵条件优化后，运用最优的摇瓶条件进行了３Ｌ发
酵罐上的发酵过程验证工程菌的产酶活力（图１３）。
由图１３可知，３Ｌ发酵罐上的胞外产比酶活在９０ｈ
时可达到２２６Ｕ／ｍＬ，完全能达到摇瓶培养优化后
的产酶水平，证明此工程菌可以应用于工业化放大
生产。
图１３ ３Ｌ发酵罐α ＣＧＴ分批发酵过程曲线
Ｆｉｇ．１３ ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆαＣＧＴａｓｅｉｎ３Ｌｆｅｒｍｅｎｔｏｒ
由图１３还可以看出，在初始阶段只有少量重组
α ＣＧＴ分泌到胞外，而在发酵２０ｈ后周质空间中比
酶活达到８６Ｕ／ｍＬ，说明大多数重组酶首先积累于
周质空间，其原因是：由于在所构建的表达系统（图
１）中，α ＣＧＴ酶基因上连有ｐｅｌＢ信号肽序列，因此
新合成α ＣＧＴ的Ｎ端存在一段ｐｅｌＢ信号肽，它能
够帮助重组酶通过细胞内膜到达周质空间，在转运
过程中信号肽被切掉而成为成熟酶［１５］。然而，随着
发酵时间的延长，可能是由于细胞外膜的透性增
加，导致积累于周质空间的重组 α ＣＧＴ能相对快
速地分泌到胞外，因此，发酵培养基中的α ＣＧＴ比
酶活逐渐增加，在发酵９０ｈ后胞外比酶活达到
２２６Ｕ／ｍＬ，而周质空间中比酶活仅为２６Ｕ／ｍＬ。
３ 结 论
将α ＣＧＴ酶基因克隆到具有分泌型ｐｅｌＢ信号
肽的表达质粒 ｐＥＴ ２０ｂ（＋）上，转化 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１
（ＤＥ３），获得了能胞外产α ＣＧＴ的工程菌株Ｅ．ｃｏｌｉ
ＢＬ２１／ｐＥＴ ｃｇｔ。酶表达和产酶条件的优化研究结果
表明，该工程菌能异源高效胞外表达α ＣＧＴ。通过
前期对摇瓶培养基的优化及发酵条件的研究，得到了
较优的产重组α ＣＧＴ工艺条件：葡萄糖８ｇ／Ｌ，乳糖
０５ｇ／Ｌ，蛋 白 胨１２ｇ／Ｌ，酵 母 膏２４ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４
７２ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４１７ｍｍｏｌ／Ｌ，ＣａＣｌ２２５ｍｍｏｌ／Ｌ；初
始ｐＨ为７０，诱导温度为２５℃，与来源菌Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓ
所产天然比酶活力相比提高了４２倍（２２１Ｕ／ｍＬ）；
应用工艺条件到３Ｌ发酵罐上进行发酵实验可以达
到优化后的摇瓶产酶水平（２２６Ｕ／ｍＬ），体现了该基
因工程菌株应用于工业化生产α ＣＧＴ酶的良好前
景。但目前也存在一些不足之处，如发酵周期长，重
组酶的生产强度有待提高等，尚需要在后期研究中进
行改进和完善。
参考文献：
［１］ ＵｉｔｄｅｈａａｇＪ，ＶａｎｄｅｒＶｅｅｎＢＡ，ＤｉｊｋｈｕｉｚｅｎＬ，ｅｔａｌ．Ｃａｔａ
ｌｙｔｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｇｌｙｃｏ
ｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ａｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｆｒｏｍｔｈｅαａｍｙ
ｌａｓｅｆａｍｉｌｙ［Ｊ］．ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，３０
（３）：２９５３０４．
［２］ ＶａｎｄｅｒＶｅｅｎＢＡ，ＵｉｔｄｅｈａａｇＪ，ＤｉｊｋｓｔｒａＢ，ｅｔａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆ
ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，２０００，１５４３（２）：３３６３６０．
［３］ ＬｉＺＦ，ＷａｎｇＭ，ＷａｎｇＦ，ｅｔａｌ．Ｇａｍｍａｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ：ａｒｅｖｉｅｗ
ｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ，２００７，７７（２）：２４５２５５．
［４］ ＨｅｄｇｅｓＡＲ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ
Ｒｅｖ，１９９８，９８（５）：２０３５２０４４．
［５］ ＪｅａｎｇＣＬ，ＷｕｎｇＣＨ，ＣｈａｎｇＢＹ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ
Ｂａｃｉｌｕｓｍａｃｅｒａｎｓｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＳｃｉＣｏｕｎｃＲｅｐｕｂＣｈｉｎａＢ，１９９９，
２３（２）：６２６８．
［６］ ＬｅｅＫＣＰ，ＴａｏＢＹ．Ｈｉｇｈｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｇｌｙｃｏ
ｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｎＥ．ｃｏｌｉｕｓｉｎｇａＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．
Ｓｔａｒｃｈ，１９９４，４６（２）：６７７４．
［７］ ＪｉｎＨＨ，ＨａｎＮＳ，ＫｗｅｏｎＤＨ，ｅｔａｌ．Ｅｆｅｃｔｓｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
ｆａｃｔｏｒｓｏｎｉｎｖｉｖｏｆｏｌｄｉｎｇｏｆＢａｃｉｌｕｓｍａｃｅｒａｎｓｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｇｌｙｃｏｌ
ｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ［Ｊ］．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ，２００１，１１（１）：９２９６．
［８］ ＫｉｍＳＧ，ＫｗｅｏｎＤＨ，ＬｅｅＤＨ，ｅｔａｌ．Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｏｌｄｉｎｇ
ａｃｃｅｓｓｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｖｅｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｏｆＢａｃｉｌｕｓｍａｃｅｒａｎｓｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００５，４１（２）：
４２６４３２．
［９］ ＪｅａｎｇＣＬ，ＬｉｎＤＧ，ＨｓｉｅｈＳＨ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ
ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｏｆｔｈｅｓａｍｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｆｒｏｍＢａｃｉｌｕｓｍａｃｅｒ
ａｎｓ，Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ，ａｎｄＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄ
Ｃｈｅｍ，２００５，５３（１６）：６３０１６３０４．
［１０］ＹａｎｇＪ，ＭｏｙａｎａＴ，ＭａｃＫｅｎｚｉｅＳ，ｅｔａｌ．Ｏｎｅｈｕｎｄｒｅｄｓｅｖｅｎｔｙｆｏｌｄ
２６ 生 物 加 工 过 程 第７卷
ｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｅｘｃｒｅｔｉｏｎｏｆａｎＦＶｆｒａｇｍｅｎｔｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｌｐｈａ
ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ（ｓＦＶ／ＴＮＦａｌｐｈａ）ｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｃａｕｓｅｄｂｙ
ｔｈｅｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｅｆｅｃｔｓｏｆｇｌｙｃｉｎｅａｎｄｔｒｉｔｏｎＸ１００［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄａｎｄ
ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，６４（８）：２８６９２８７４．
［１１］ＬｅｅＫＷ，ＳｈｉｎＨＤ，ＬｅｅＹＨ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆβ
ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｎａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥ．ｃｏｌｉｕｓｉｎｇｓｅ
ｃｒｅｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，１２
（５）：７５３７５９．
［１２］陈坚，吴敬，李兆丰，等．一种α 环糊精葡萄糖基转移酶基
因的克隆与表达：中国，１０１２９４１４９［Ｐ］．２００８１０２９．
［１３］ＬｅｊｅｕｎｅＡ，ＳａｋａｇｕｃｈｉＫ，ＩｍａｎａｋａＴ．Ａｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃａｓ
ｓａｙｆｏｒｔｈｅｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｙｃｌｏｍａｌｔｏｈｅｘａｏｓｅ（ａｌｐｈａｃｙｃｌｏ
ｄｅｘｔｒｉｎ）ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ［Ｊ］．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９８９，１８１（１）：
６１１．
［１４］ＰｏＫＬ，ＯｓｍａｎＨ，ＡｒｓｈａｄＡ，ｅｔａｌ．Ｅｘｃｒｅｔｏｒｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
Ｂａｃｉｌｕｓｓｐ．Ｇ１ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＧＴａｓｅ）ｉｎＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｂｙｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
２００７，４０（５）：１２５６１２６３．
［１５］ＣｈｏｉＪＨ，ＬｅｅＳＹ．Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙａｎｄｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｕｓｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，６４（５）：
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
６２５６３５．
国外动态
胸腺嘧啶新的生物合成路径
胸腺嘧啶是由胸苷酸合成酶合成的，这种酶催化“２′脱氧尿苷 ５′单磷酸盐”的尿嘧啶部分的甲基化。
传统的胸苷酸合成酶，包括人体的这种酶，利用１个活性点氨基酸侧链在该反应的这一阶段激发基质。
几年前，研究人员在若干种生物（包括几种人类病原体）中识别出了另一种形式的胸苷酸生物合成，这
种形式涉及一种依赖于黄素的胸苷酸合成酶，后者是ｔｈｙＸ基因的产物。
现在，Ｋｏｅｎｈｎ等人对合成胸腺嘧啶的这一替代途径进行了定性研究，发现它并不需要一种酶类亲核试
剂；相反，实际情况似乎是１个氢负离子从被还原的黄素辅因子上直接转移到尿嘧啶环上。因为几种人类病
原体依靠这一生物合成通道来进行ＤＮＡ生物合成，所以有可能开发出以这种酶为目标的具有高度选择性的
新型抗生素。
新型工程酵母转化木糖、阿拉伯糖为生物燃料
目前的生物乙醇生产技术只能应用原料植物的贮藏性糖，如葡萄糖、蔗糖和淀粉。瑞士生物燃料公司
的ＥｃｋｈａｒｄＢｏｌｅｓ和德国Ｇｏｅｔｈｅ大学教授合作开发了可以将木糖、阿拉伯糖转化为乙醇的基因工程菌。
现在Ｂｏｌｅｓ和他的同事已经成功构建了可以将木糖直接转化为乙醇的基因工程酵母，并且使用基因工
程菌成功将阿拉伯糖转化为乙醇。他们已经找到一种将植物原料转化为生物燃料的高效方法。
（朱宏阳）
３６ 第３期 成 成等：利用重组大肠杆菌生产α 环糊精葡萄糖基转移酶