全 文 ：第 １２卷第 １期
２０１４年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０１􀆰 ００４
收稿日期：２０１３－１１－２７
基金项目：国家重点基础研究发展计划 （９７３计划）（２０１１ＣＢ７０７４０５）
作者简介：胡翠敏（１９８４—），女，河北唐山人，博士，研究方向：工业生物技术；赵宗保（联系人），研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｏｚｂ＠ ｄｉｃｐ􀆰 ａｃ􀆰 ｃｎ
皮状丝孢酵母同步利用葡萄糖 ／木糖的糖转运动力学
胡翠敏１，２，王　 倩１，龚志伟１，杨晓兵１，靳国杰１，沈宏伟１，赵宗保１
（１􀆰 中国科学院 大连化学物理研究所 生物技术部，大连 １１６０２３； ２􀆰 天津大学 化工学院，天津 ３０００７２）
摘　 要：皮状丝孢酵母（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）能够同步利用葡萄糖和木糖生产油脂。 以 ２ 脱氧葡萄糖（２ ＤＯＧ）
为底物，考察皮状丝孢酵母糖跨膜运输的转运动力学。 结果表明：２ ＤＯＧ转运符合米氏方程，表观米氏常数 Ｋｍ为
０􀆰 １９ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，最大转运速率 Ｖｍａｘ为 １４􀆰 １ ｎｍｏｌ ／ （ｍｉｎ·ｍｇ）。 葡萄糖和木糖均竞争性抑制 ２ ＤＯＧ 转运，葡萄糖表观
抑制常数 Ｋｉ远低于木糖，表明存在一个共用转运体系，且该转运体系对葡萄糖亲和力更高。 大量木糖与 ２ ＤＯＧ
同时转运到胞内，进一步说明木糖与葡萄糖共运输。 代谢抑制剂和 ｐＨ对糖转运有明显影响，说明质子 ／底物同向
运输系统是该酵母的主要糖转运系统。
关键词：同步利用；糖转运；同向运输；２ 脱氧葡萄糖；皮状丝孢酵母
中图分类号：ＴＱ２２３􀆰 １２２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０１－００１８－０５
Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ ｕｓｉｎｇ
ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｘｙｌｏｓｅ
ＨＵ Ｃｕｉｍｉｎ１，２，ＷＡＮＧ Ｑｉａｎ１，ＧＯＮＧ Ｚｈｉｗｅｉ１，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏｂｉｎｇ１，ＪＩＮ Ｇｕｏｊｉｅ１，
ＳＨＥＮ Ｈｏｎｇｗｅｉ１，ＺＨＡＯ Ｚｏｎｇｂａｏ１
（１􀆰 Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｌｉａｎ １１６０２３，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ ｃａｎ ｕｔｉｌｉｚｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｘｙｌｏｓｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｌｉｐｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ􀆰 Ｔｈｅ ｓｕｇａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ２⁃ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ （ ２⁃ＤＯＧ） ａｓ ａ
ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ􀆰 Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｄａｔａ ｏｆ ２⁃ＤＯＧ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｆｉｔｔｅｄ ｗｅｌｌ ｔｏ Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ⁃Ｍｅｎｔｅｎ ｐｌｏｔ
ａｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｐｐａｒｅｎｔ Ｋｍ ｏｆ ０􀆰 １９ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｏｆ １４􀆰 １ ｎｍｏｌ ／ （ｍｉｎ·ｍｇ） ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ􀆰 Ｂｏｔｈ ｇｌｕｃｏｓｅ
ａｎｄ ｘｙｌｏｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｌｙ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ２⁃ＤＯＧ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｓｈａｒｅｄ ｔｈｅ
ｓａｍｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ􀆰 Ｔｈｅ ａｐｐａｒｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｋ ｉ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｘｙｌｏｓｅ，
ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ａ ｈｉｇｈｅｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｔｏ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｈａｎ ｘｙｌｏｓｅ􀆰 Ｔｈｅ ｆａｃｔ ｔｈａｔ ｌａｒｇｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｘｙｌｏｓｅ
ｗａｓ ｕｐｔａｋｅｎ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ２⁃ＤＯＧ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｔｈｅ ｃｏ⁃ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｘｙｌｏｓｅ􀆰 Ａｓ ２⁃ＤＯＧ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｗａｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｐＨ，ａｎ Ｈ＋ ／ ｓｕｇａｒ⁃ｓｙｍｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ａｓ ｔｈｅ
ｍａｉｎ ｓｕｇａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ； ｓｕｇａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ； ｓｙｍｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ； ２⁃ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ；
Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ
　 　 近年来，利用木质纤维素生产微生物油脂受到
广泛关注［１－３］，微生物油脂技术对缓解生物柴油规
模化生产原料短缺的瓶颈具有重要意义。 由于木
质纤维素水解产物中同时含有葡萄糖和木糖，高效
转化利用葡萄糖和木糖对生物质生物转化过程的
经济性具有重要影响。 然而，葡萄糖通常为微生物
偏好底物，对木糖利用存在抑制作用。 如何克服葡
萄糖效应，实现五、六碳糖高效共利用，成为当前生
物炼制研究的热点之一［４－６］。
跨膜运输是糖分子生物转化的第一步，在某些
情况下是限速步骤［７］。 酵母菌最常见的 ２ 种糖跨
膜运输机制为协助扩散和质子 ／糖同向运输［ ８－１０］。
在酿酒酵母 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中，已发现 ２０种
不同己糖转运子均采用协助扩散机制［１１］。 虽然质
子 ／糖同向运输体系在 Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 中尚未发现，但
多数葡萄糖苷类物质依赖质子同向运输体系［１２－１３］。
酿酒酵母没有木糖特异的转运子，因此木糖跨膜运
输借助己糖转运系统实现，但转运速率远低于葡萄
糖［６］。 在 Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 中表达来源于 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ的 ２个转运子，提高了木糖转化率，但重组
菌株仍然存在葡萄糖效应［６］。 葡萄糖抑制木糖转
运，导致葡萄糖优先利用，推测木糖跨膜运输是木
糖利用的限速步骤之一［１４－１５］。
Ｈｕ 等［１６］研究发现皮状丝孢酵母 Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ
ｃｕｔａｎｅｕｍ能同步利用葡萄糖和木糖生产油脂，进一
步研究该酵母利用葡萄糖和木糖的混合糖时没有
底物偏好性，对探索消除葡萄糖效应的方法以及纤
维素生物能源的生产有重要价值。 ２ 脱氧葡萄糖
（２ ＤＯＧ）由于不易被代谢，且通常与葡萄糖共用
转运载体，常作为葡萄糖类似物以考察葡萄糖转运
规律［１７－１８］。 笔者以 ２ ＤＯＧ 为底物，考察皮状丝孢
酵母单糖跨膜运输特性，以期揭示葡萄糖和木糖同
步利用的机制。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 化学试剂
２ 脱氧葡萄糖，Ａｃｒｏｓ 公司；Ｎ，Ｎ′ 二环己基碳
化二亚胺 （ＤＣＣ）、羰基氰化物间氯苯腙 （ＣＣＣＰ），
Ｓｉｇｍａ公司；４ 硝基苯酚 （４ ＮＰ）、叠氮化钠，国药
集团。 其他试剂均为分析纯。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 菌悬液制备
将－８０ ℃保存的皮状丝孢酵母 ＡＳ ２􀆰 ５７１ （中国
普通微生物菌种保藏管理中心） 在新鲜 ＹＥＰＤ
（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、 ｐｅｐｔｏｎｅ、 ｄｅｘｔｒｏｓｅ）斜面 （葡萄糖 ２０
ｇ ／ Ｌ，酵母粉 １０ ｇ ／ Ｌ，蛋白胨 １０ ｇ ／ Ｌ，琼脂 １５ ｇ ／ Ｌ） 上
活化，取一环接种于装有 ５０ ｍＬ 液体 ＹＥＰＤ 的 ２５０
ｍＬ三角瓶中，于 ３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ摇床中培养 ２４ ｈ，
然后取 ０􀆰 ５ ｍＬ二次转接于同样的培养基，于 ３０ ℃、
２００ ｒ ／ ｍｉｎ 摇床中培养 １８ ｈ。 ８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心
５ ｍｉｎ，用 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４溶液 （ｐＨ ４􀆰 ６） 洗涤 ２
遍［１９］，并重悬于该溶液至细胞质量浓度为 １０ ｇ ／ Ｌ
（以细胞干质量计），于 ３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ培养 ３０ ｍｉｎ
后置于 ０ ℃备用。
１􀆰 ２􀆰 ２　 转运实验操作及试样制备
取 ０ ℃保存的菌悬液 １ ｍＬ与底物一起于 ３０ ℃
平衡 １０ ｍｉｎ，加入 ２００ μＬ底物与菌悬液混合开始反
应，混匀，取 １ ｍＬ 菌液用 ０􀆰 ４５ μｍ 真空膜快速（耗
时 ６０ ｓ）过滤，用 ３􀆰 ０ ｍＬ冰水洗涤菌体，将菌体连同
滤膜转移到 １ ｍＬ 水中，微波处理并迅速冷却（８００
Ｗ，１ ｍｉｎ ／次，２次），再加入 １ ｍＬ 水混匀，离心取上
清液备用。 为了排除细胞对底物的非特异性吸附，
采用菌体和底物均在 ０ ℃平衡，混合后迅速过滤，按
照上述方法测定细胞吸附底物的量。
①葡萄糖和木糖对 ２ ＤＯＧ 跨膜运输的影响。
将葡萄糖或木糖与 ２ ＤＯＧ 混合，同时作为底物考
察其对 ２ ＤＯＧ跨膜运输的影响。
②转运抑制作用考察。 反应开始前 ２ ｍｉｎ 向菌
液添加不同浓度的转运抑制剂（叠氮化钠，ＤＣＣ，
ＣＣＣＰ 或 ４ ＮＰ），取叠氮化钠水溶液或其他 ３ 种化
合物 ９５％乙醇溶液（乙醇在反应混合物中的体积分
数低于 １％）１０ μＬ，然后添加 １９０ μＬ 浓度为 ０􀆰 ４７５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ２ ＤＯＧ 开始反应，对照组分别添加 １０
μＬ水和 １０ μＬ ９５％乙醇，考察它们对 ２ ＤＯＧ转运
的影响。
③ｐＨ 对 ２ ＤＯＧ 转运的影响。 用 ＫＨ２ＰＯ４和
Ｋ２ＨＰＯ４配制不同 ｐＨ 的缓冲液，浓度为 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ。
细胞悬液用缓冲液洗涤 １遍并重悬于该缓冲液，２
ＤＯＧ浓度为 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，考察 ｐＨ 对 ２ ＤＯＧ 转运
的影响。
１􀆰 ２􀆰 ３　 试样分析及数据处理
胞内糖浓度采用离子色谱分析，实验条件为
ＰＡ１０色谱柱和 ＰＡ１０保护柱，ＥＤ５０电化学检测器，流
动相为 １８ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ，流速 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，柱温 ３０
℃。 在此条件下，２ ＤＯＧ、葡萄糖和木糖的保留时间
分别为 ７􀆰 ２、１１􀆰 ４和 １２􀆰 ９ ｍｉｎ。 细胞干质量的测定方
法参照文献［２０］。 数据处理采用软件 Ｏｒｉｇｉｎ ８􀆰 ０。 数
据为 ２个试样的平均值，误差线表示标准偏差。
９１　 第 １期 胡翠敏等：皮状丝孢酵母同步利用葡萄糖 ／木糖的糖转运动力学
２　 结果与讨论
测定糖分子跨膜运输速率的方法受到多重因
素影响，主要包括：试样前处理过程的可重复性，进
入细胞后的代谢过程以及细胞转运活性的稳定
性［１９］。 尽量缩短转运时间并采用不能被微生物代
谢的类似物 ２ ＤＯＧ，避免了代谢过程的影响。 将
细胞悬液于冰上保存，采取终点法记录转运及过滤
的总时间，用于计算糖转运速率。 通过采取上述措
施，发现实验数据的重复性较好，为测定皮状丝孢
酵母单糖跨膜运输特性打下了基础。
２􀆰 １　 ２ ＤＯＧ转运动力学
实验结果表明，２ ＤＯＧ 跨膜运输速率在初始
５０ ｓ内保持稳定，所以实验选取 ３０ ｓ 作为转运时间
来考察。 ２ ＤＯＧ 转运动力学如图 １ 所示。 由图 １
可知：２ ＤＯＧ跨膜运输符合米氏动力学方程，经非
线性回归计算，表观米氏常数 Ｋｍ为 ０􀆰 １９ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，最
大速率 Ｖｍａｘ为 １４􀆰 １ ｎｍｏｌ ／ （ｍｉｎ·ｍｇ）。 饱和米氏动
力学曲线表明是有载体介导的转运机制［２１］。
Ｅａｄｉｅ Ｈｏｆｓｔｅｅ 曲线呈线性，说明在此条件下可能仅
存在 １个 ２ ＤＯＧ转运体系。
图 １　 ２ ＤＯＧ转运动力学（插图为 Ｅ Ｈ曲线）
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ２⁃ＤＯＧ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
（Ｉｎｓｅｔ，ｔｈｅ Ｅ⁃Ｈ ｐｌｏｔ）
２􀆰 ２　 葡萄糖和 ２ ＤＯＧ转运的关系
考察葡萄糖对皮状丝孢酵母 ２ ＤＯＧ转运活性
的影响，结果见图 ２。 由图 ２ 可知：在没有添加葡萄
糖的条件下，２ ＤＯＧ 浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 和 ０􀆰 ４
ｍｍｏｌ ／ Ｌ所得到的 ２ ＤＯＧ 转运速率分别为（４􀆰 ８±
０􀆰 １）和（９􀆰 ３±０􀆰 ３）ｎｍｏｌ ／ （ｍｉｎ·ｍｇ）。 随着葡萄糖浓
度升高，２ ＤＯＧ转运速率降低。 据图 ２ 数据计算，
当 ２ ＤＯＧ 浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、葡萄糖浓度达到
０􀆰 ２８ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，２ ＤＯＧ 转运速率降低 ５０％；２
ＤＯＧ浓度升高到 ０􀆰 ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ时，２ ＤＯＧ转运速率
降低 ５０％所需葡萄糖浓度为 ０􀆰 ６５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。 由
Ｄｉｘｏｎ曲线可知，葡萄糖竞争性抑制 ２ ＤＯＧ 转运，
表观抑制常数 Ｋ ｉ为 ０􀆰 ２６ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，表明葡萄糖和 ２
ＤＯＧ共用一个转运体系，并且该转运体系对两者的
亲和力相近。
图 ２　 葡萄糖对 ２ ＤＯＧ转运的影响（插图为 Ｄｉｘｏｎ图）
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ ２⁃ＤＯＧ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔ （Ｉｎｓｅｔ，Ｄｉｘｏｎ ｐｌｏｔ）
２􀆰 ３　 木糖对 ２ ＤＯＧ转运的影响
将木糖与 ２ ＤＯＧ同时作为底物考察皮状丝孢
酵母转运两者的规律，结果见图 ３。 由图 ３ 可知：当
２ ＤＯＧ浓度分别为 ０􀆰 １ 和 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，没有木
糖的情况下，２ ＤＯＧ转运速率分别为（４􀆰 １±０􀆰 １）和
（８􀆰 ４±０􀆰 ２） ｎｍｏｌ ／ （ｍｉｎ·ｍｇ）；添加 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 木糖
后，２ ＤＯＧ转运速率分别降低 １６％和 ３％。 当底物
中２ ＤＯＧ浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，转运速率降低
５０％需要木糖 １２􀆰 ７ ｍｍｏｌ ／ Ｌ；底物中 ２ ＤＯＧ浓度为
０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，转运速率降低 ５０％需要木糖 ２０􀆰 ５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ。 由图 ３ 还可知，木糖也竞争性抑制 ２
ＤＯＧ转运，表明木糖和 ２ ＤＯＧ 共用同一个转运体
系。 木糖对 ２ ＤＯＧ 转运的表观抑制常数 Ｋ ｉ为
１０􀆰 ３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，远大于葡萄糖对应的表观抑制常数，
说明该转运系统对木糖的亲和力远低于葡萄糖。
图 ３　 木糖对 ２ ＤＯＧ转运的影响（插图为 Ｄｉｘｏｎ图）
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｘｙｌｏｓｅ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ
２⁃ＤＯＧ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ （Ｉｎｓｅｔ，Ｄｉｘｏｎ ｐｌｏｔ）
进一步检测发现，胞内积累 ２ ＤＯＧ 的同时也
积累了大量木糖。 由于胞内 ２ ＤＯＧ 浓度高于胞
０２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
外，推测 ２ ＤＯＧ为主动运输过程。 假设 １􀆰 ０ ｍｇ 细
胞干质量相当于 ２􀆰 ０ μＬ 胞内水分［２２］，计算所得数
据如表 １ 所示。 由表 １ 可知：木糖和 ２ ＤＯＧ 同时
运输到胞内，并且底物中木糖浓度越高，胞内 ２
ＤＯＧ浓度越低，胞内木糖浓度也越高。 当底物中木
糖浓度为 ４０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，胞内木糖浓度高达 ２
ＤＯＧ浓度的 １８ 倍。 此现象说明，虽然转运蛋白对
木糖的亲和力较低，但是木糖可能具有更高的
Ｖｍａｘ ［２３］。 由于发酵过程中底物远远过量，其跨膜运
输以较高速率进行。 葡萄糖转运速率接近 ２ ＤＯＧ
转运的最大速率 Ｖｍａｘ，即 １４􀆰 １ ｎｍｏｌ ／ （ｍｉｎ·ｍｇ），而木
糖转运速率可能更高。 由发酵实验结果计算得知，
当培养基中葡萄糖和木糖浓度比为 １ ∶１时，消耗速
率分别为 ０􀆰 ２８ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）和 ０􀆰 ２９ ｇ ／ （Ｌ·ｈ） ［１６］，比消
耗速率分别为 １􀆰 １ 和 １􀆰 ４ ｎｍｏｌ ／ （ｍｉｎ·ｍｇ）。 所以，
葡萄糖和木糖跨膜运输很可能不是限速步骤，因此
发酵过程中 ２种底物的利用没有明显偏好性。
毕赤酵母 Ｐｉｃｈｉａ ｈｅｅｄｉｉ 在利用葡萄糖和木糖时
存在明显的葡萄糖效应［２４］，木糖跨膜运输完全被葡
萄糖抑制，但木糖不影响葡萄糖跨膜运输。 所以，
木糖与葡萄糖共运输，以及木糖抑制葡萄糖转运是
葡萄糖和木糖同步利用的前提条件。
表 １　 胞内 ２ ＤＯＧ和木糖浓度分析
Ｔａｂｌｅ １　 Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ２⁃ＤＯＧ ａｎｄ ｘｙｌｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｘｙｌｏｓｅ ｌｅｖｅｌｓ
ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ｃ（胞外木糖） ｃ（胞内木糖） ｃ（胞内 ２ ＤＯＧ）
０ ０　 　 　 　 １􀆰 ０３±０
１ ０􀆰 ７２±０􀆰 ０１ ０􀆰 ８７±０􀆰 ０４
１０ ３􀆰 ０２±０􀆰 ０３ ０􀆰 ５７±０
２０ ４􀆰 １２±０􀆰 ２０ ０􀆰 ４２±０􀆰 ０１
４０ ４􀆰 ６６±０􀆰 ２４ ０􀆰 ２６±０􀆰 ０２
　 注：外源 ２ ＤＯＧ浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，反应时间为 ３０ ｓ。
２􀆰 ４　 代谢抑制剂和 ｐＨ对 ２ ＤＯＧ转运的影响
质子导体和代谢抑制剂能够抑制质子梯度的
形成，从而抑制质子 ／糖同向运输。 考察 ４种抑制剂
对皮状丝孢酵母转运糖特性的影响，结果见表 ２。
由表 ２可知：４ 种抑制剂均对 ２ ＤＯＧ 转运存在明
显抑制作用，抑制能力从强到弱的顺序为 ＣＣＣＰ、叠
氮化钠、４ ＮＰ 和 ＤＣＣ。 其中，ＣＣＣＰ 浓度为 ０􀆰 ０５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ就能抑制 ２ ＤＯＧ 转运活性的 ９１％。 ２
ＤＯＧ对代谢抑制剂的敏感性表明存在以质子梯度
为动 力 的 糖 主 动 运 输 过 程［２５］。 在 Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ［２６－２７］， Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ［２８］ 和
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ［２９］等酵母中也发现了同样的转
运机制。 Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 中发现的主动运输过程也都属
于质子同向运输体系［２５，３０］。
表 ２　 抑制剂对 ２ ＤＯＧ转运的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｎ ２⁃ＤＯＧ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
抑制剂 ｃ ／ （ｍｍｏｌ·Ｌ－１） 相对转运活力
空白 １􀆰 ００　 　 　
叠氮化钠 ０􀆰 ２ ０􀆰 ３１±０􀆰 ０２
叠氮化钠 １􀆰 ０ ０􀆰 １９±０􀆰 ０１
ＣＣＣＰ ０􀆰 ０５ ０􀆰 ０９±０􀆰 ０２
ＣＣＣＰ ０􀆰 ４ ０􀆰 ０５±０􀆰 ０１
ＤＣＣ ０􀆰 １ ０􀆰 ９３±０􀆰 ０１
ＤＣＣ ０􀆰 ４ ０􀆰 ７６±０􀆰 ０６
４ ＮＰ ０􀆰 ２ ０􀆰 ７７±０􀆰 ０２
４ ＮＰ １􀆰 ０ ０􀆰 １８±０􀆰 ０１
质子同向运输体系运输糖分子的过程对外界
ｐＨ变化非常敏感［３１－３２］。 图 ４ 为 ｐＨ 对运输分子的
影响结果。 由图 ４ 可知：当以 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ２ ＤＯＧ
为底物时，ｐＨ由 ８降低到 ４􀆰 ６，转运速率逐步增大；
ｐＨ 为 ４􀆰 ６ 时， 转 运 速 率 为 （ ７􀆰 ５ ± ０􀆰 １ ）
ｎｍｏｌ ／ （ｍｉｎ·ｍｇ）。 结果符合一般的质子 ／糖同向运
输机制，即质子梯度是主动运输过程的主要推动
力［２６，３３］。 当 ｐＨ为 ８时，暗示存在其他转运体系，而
质子同向运输体系在酸性条件下起主要作用。
图 ４　 外界 ｐＨ对 ２ ＤＯＧ转运的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｐＨ ｏｎ ２⁃ＤＯＧ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
３　 结　 论
在油脂酵母 Ｔ􀆰 ｃｕｔａｎｅｕｍ 中，葡萄糖和木糖与
２ ＤＯＧ共用同一个转运系统，经验证为质子 ／糖同
向运输体系。 该酵母中，葡萄糖和木糖同步跨膜进
入胞内，与以往报道的葡萄糖效应菌株不同。 分离
获得该转运体系的相关基因，对阐明同步利用机
制、改造工业菌株以及木质纤维素高效转化有重要
意义。
１２　 第 １期 胡翠敏等：皮状丝孢酵母同步利用葡萄糖 ／木糖的糖转运动力学
参考文献：
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ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｕｔｉｌｉｚｅ ｘｙｌｏｓｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ａｅｒｏｂｉｃ ｘｙｌｏｓｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ
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ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｓｕｇａｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｔｈｅ
ｙｅａｓｔ Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ （ Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ） ［ Ｊ］ ． Ｊ
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［１７］ 　 Ｈａｎｓｅｎ Ｐ，Ｇｕｌｖｅ Ｅ，Ｈｏｌｌｏｓｚｙ Ｊ􀆰 Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ２⁃ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ ｆｏｒ
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ｏｆ Ｄ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ２⁃ｄｅｏｘｙ⁃Ｄ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ｂｙ ｓｔａｒｖｉｎｇ ａｎｄ
ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｌｙ⁃ｇｒｏｗｉｎｇ ｙｅａｓｔｓ［ Ｊ］ ． Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９７６，１１１ （ １ ／
２）：１８５⁃１９２􀆰
［２０］ 　 Ｈｕ Ｃ Ｍ，Ｚｈａｏ Ｘ，Ｚｈａｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ􀆰 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｂｙ⁃
ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｎ ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ ｙｅａｓｔ Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ［ Ｊ ］ ．
Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，１００（２０）：４８４３⁃４８４７􀆰
［２１］ 　 Ｂｒｉｃｚｉｎｓｋｉ Ｅ Ｐ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ａ Ｔ，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ Ｆ􀆰 Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｂｙ
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｕｂｓｐ􀆰 ｌａｃｔｉｓ ｏｃｃｕｒｓ ｖｉａ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ
ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００８，７４（２２）：６９４１⁃６９４８􀆰
［２２］ 　 Ｍｅｒｅｄｉｔｈ Ｓ Ａ，Ｒｏｍａｎｏ Ａ Ｈ􀆰 Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ２⁃
ｄｅｏｘｙ⁃Ｄ⁃ｇｌｕｃｏｓｅ ｂｙ ｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ⁃ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｂａｋｅｒｓ′
ｙｅａｓｔ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１９７７，４９７（３）：７４５⁃７５９􀆰
［２３］ 　 Ｌｕｃａｓ Ｃ，ｖａｎ Ｕｄｅｎ Ｎ􀆰 Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｏｎｏｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｘｙｌｏｓｅ⁃ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｙｅａｓｔ Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９８６，２３（６）：４９１⁃４９５􀆰
［２４］ 　 Ｄｏｅｓ Ａ Ｌ，Ｂｉｓｓｏｎ Ｌ Ｆ􀆰 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ｔｈｅ
ｙｅａｓｔｓ Ｐｉｃｈｉａ ｈｅｅｄｉｉ ａｎｄ Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８９，５５（１）：１５９⁃１６４􀆰
［２５］ 　 Ｈｏｌｌａｔｚ Ｃ， Ｓｔａｍｂｕｋ Ｂ Ｕ􀆰 Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ
ａｌｐｈａ⁃ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ［ Ｊ ］ ． Ｊ
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［２６］ 　 Ｖｉｉｇａｎｄ Ｋ，Ａｌａｍａｅ Ｔ􀆰 Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
ＭＡＬ ｌｏｃｕｓ： ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ⁃ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ
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Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ［Ｊ］ ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，１９９８，１６６（２）：
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ｔｒａｎｓｐｏｒｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ［ Ｊ ］ ． Ｂｉｏｃｈｉｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｂｉｏｍｅｍｂｒ，１９８７，９０３（３）：４２５⁃４３３􀆰
［２９］ 　 Ｈｏｆｅｒ Ｍ，Ｍｉｓｒａ Ｐ Ｃ􀆰 Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｐｒｏｔｏｎ ／ ｓｕｇａｒ ｓｙｍｐｏｒｔ ｉｎ ｔｈｅ
ｙｅａｓｔ Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ （ｇｌｕｔｉｎｉｓ） ［ Ｊ］ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，１９７８，１７２：
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［３０］ 　 Ｓｔａｍｂｕｋ Ｂ Ｕ，ｄｅ Ａｒａｕｊｏ Ｐ Ｓ􀆰 Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ａｌｐｈａ⁃ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］ ．ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ，２００１，
１（１）：７３⁃７８􀆰
［３１］ 　 Ｎｏｂｒｅ Ａ，Ｌｕｃａｓ Ｃ，Ｌｅａｏ Ｃ􀆰 Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｘｏｓｅｓ
ａｎｄ ｐｅｎｔｏｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｙｅａｓｔ Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ［Ｊ］ ．
Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，６５（８）：３５９４⁃３５９８􀆰
［３２］ 　 Ｊａｎｄａ Ｓ，Ｋｏｔｙｋ Ａ，Ｔａｕｃｈｏｖａ Ｒ􀆰 Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍｓ
ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ［ Ｊ］ ． Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９７６，１１１
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［３３］ 　 Ｈａｒｏｌｄ Ｆ Ｍ􀆰 Ｃｈｅｍｉｏｓｍｏｔｉｃ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ⁃ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ
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［３４］ 　 Ｋａｔａｈｉｒａ Ｓ， Ｉｔｏ Ｍ， Ｔａｋｅｍａ Ｈ， ｅｔ ａｌ􀆰 Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ
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ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎｇ Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖｉａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｓｕｔ１
［Ｊ］ ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，４３：１１５⁃１１９􀆰
（责任编辑　 荀志金）
２２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷