全 文 ：第4崔第3期 生物加工过程 Aug．2006
2(I()6年8月 chineseJoumalofBi叩rocessEn西neering ．。51．
双底物抑制下脂肪酶催化合成乳酸乙酯的研究
赵天涛1，张丽杰1，高 静2，全学军1
(1．重庆工学院 生物工程学院，重庆4c0050；2．河北工业大学化工学院，天津300131)
摘要：从微观体系考察了在双底物抑制下脂肪酶催化合成乳酸乙酯，叔丁醇是最佳溶剂，它可以很好地破坏乳酸
分子由缔合而形成的分子簇。在所选的脂肪酶中，N0vo删4315(南极假丝酵母脂肪酶B)的催化活性最好。综合产
率和酶活两方面因素确定了最佳实验条件：酸醇摩尔比=l：8、反应温度60℃、酸浓度O．3m洲L、酶浓度45∥Inol、摇
床转速200r／111in。
关键词：双底物抑制；缔合；催化；脂肪酶；乳酸乙酯
中图分类号：Q814 文献标识码：A 文章编号：1672～3678(2006)03—005l—05
Em妒natic销te渤tionfore h姐lactatesyn hesisinacidandaIcoholiIdIibition
zHAoTian—ta01，zHANGLi．jiel，GAoJi《，QUANXue．julll
(1．sch00lofBioellgine耐Ilg，Chon呼ngInstituteflkhnology，C}longqing400050，Cllina；
2．SchoolfChernicalErlgine商Ilg，HebeiUniversityof‘‰hnolo舒，Tianjin300130，C扯na)
Ab!蛐陷ct：EtllyllactatewasyntIlesizedbvlactica idandetIlaIIolindoublesubstmtesinhibition，andthebest
solventwas据r霉．but、rlalcoh01，whichcanbreakmef．0忧eassoci砒edbetweenlactica idmolecuIa]瞎theviewof
Illicrocosmic，and吐Iebestlipasis№V啊嘲435(“paseBf．mm饧以i如on玩rc￡记n)．ne叩timizedcond —
tionswerestudiedandcoll]譬nIledindetailacc0耐ingtoyieldandactivityofenzyme：meHlol8rratio(acid：alco．
h01)was1：8，t}let n耻raturewas60℃，t}leconcent飕tionofacid明d1ipasewas0．3mol／Larld45∥mol，
res讲犯tively，t}lemtatati锄speedwas200Ⅳrnin．
1【eywo州s：aeidanalcollolinhibiti锄；associati彻；catalysis；lip鼬e；ethyllactate
乳酸乙酯是具有酒香的无色液体，它的特殊风
味对酒的品质起着至关重要的作用【lj。而且，乳酸
乙酯具有无毒、溶解性好、不易挥发等优点，是极具
开发价值和应用前景的“绿色溶剂”怛]。目前乳酸乙
酯的生产多采用传统的浓硫酸催化酯化法，该方法
存在设备腐蚀严重、产品质量差等缺点婚J。
脂肪酶可以催化酯类化合物的分解、合成和酯
交换h引，因而被广泛应用于食品、精细化工和医药
工业中。有机相脂肪酶催化的研究极大地扩展了酶
的应用范围。国内外已有报道酶法合成其它乳酸酯
和脂肪酸乙酯。但是From并没有涉及乳酸乙酯的
合成"j。最近的报道也主要集中于乳酸与其他脂肪
酸或糖酯的合成博j，这些反应与乳酸乙酯的合成是
不同的，因为，乳酸和乙醇可以完全互溶，但乳酸不
与大多数有机溶剂互溶。而且，乳酸同时包括羧基
和羟基两个官能团，这使得乳酸容易自聚形成链形
自聚体或内交酯。乳酸的酸性较一般的有机酸强很
多，乳酸的酸性常数憨较其他有机酸商许多(甲酸
17．7×10一，乙酸1．75×10。)，又因为乙醇是酶的
失活剂，所以乳酸乙酯的酶法合成至今未见报道。
收稿日期：2006—02．20
基金项目：国家自然科学基金(200360】0)
作者简介：赵天涛(1976、)，男，河北沧州人，硕士，讲师。研究方向：生物化工，酶工程，E．mi8I：zhaott@cqit．edu．c“
万方数据
·52· 生物加工过程 第4卷第3期
基于此，对有机相脂肪酶催化合成乳酸乙酯进
行了系统的研究。通过寻找合适的体系使得酸和醇 2 结果与讨论
的抑制最小，从而获得最佳的产率。
1材料与方法
1．1材料
Novozynl435(固定化于大空丙烯酸树脂的南极
假丝酵母脂肪酶B)，CCL(非固定化南极柱状酵母脂
肪酶)，“pase驴erILIM(固定化于硅胶的嗜热真菌
脂肪酶)，PPL(非固定化猪胰脂肪酶)，Li谳ase(茸毛
腐质霉菌脂肪酶)，以上脂肪酶均购于诺维信公司。
其它试剂均购于天津试剂一厂，所有溶剂均为分析
纯且在使用前均用分子筛脱水处理。
1．2酶反应
除特殊说明以外，所有反应均在恒温振荡水浴
摇床中进行。首先将一定比例的乳酸和乙醇加入
5ⅡlL的具塞锥形瓶中，再加入一定体积的有机溶剂，
充分混和后加入一定质量的脂肪酶，在特定的温度
和摇床转速下反应一定时间。
1．3酶活力的测定
(1)取pH7．5的磷酸盐缓冲溶液5-llL于100
mL锥形瓶中，加入5rIlL橄榄油乳化液，放入水浴振
荡37℃、150r，“n、5lIlin。冷却，加入准确称量的待
测脂肪酶，于50℃水浴，150““n，振荡1h。
(2)取出锥形瓶，立即加入95％乙醇10fnL，振
荡终止反应，用浓度精确已知的氢氧化钾溶液滴定
水解产生的游离脂肪酸，以酚酞为指示剂。
(3)将每克酶每分钟催化产生1肛mol脂肪酸定
义为1个活力单位(舢10l／(g·“n))。
1．4气相色谱分析
乳酸乙酯含量的测定采用气相色谱内标法，气
相色谱为安捷伦6890(美国)，色谱柱为sE．30毛细
柱(30m×0．25lnm×0．25胛)。柱箱温度105℃，
检测室和气化室温度分别为160℃和190cC，内标
物为环己酮。校正因子为0．9568，平均偏差为
0．9998。
1．5含水量测定
溶剂的含水量用KF．2型卡尔费休水分测定仪
测定，采用连续3次平行数据(误差小于2％)作为
结果，试验中使用未经脱水的经济性乳酸，其含水量
为14．8l％。
2．1溶剂的选择
由图1可知乳酸在常态下以复杂的形式缔
合旧J，而乙醇也可通过氢键与乳酸结合，从微观角度
称之为分子簇。脂肪酶的催化机理一般均遵循双乒
乓机制¨引，而这一机制的前提就是单分子反应。对
乳酸良好的溶解(使其在较低温度下破坏分子簇)且
溶剂本身对脂肪酶的抑制最小是选择溶剂的关键。
由表1可见，叔丁醇为溶剂时产率最高。叔丁醇的
突出的效果可以从以下3点解释：第一、叔丁醇对酶
的负面影响较之乙腈、丙酮小，所以，即使乙腈和丙
酮能部分地破坏缔合，但其本身对酶的强抑制性亦
使酶无法发挥活性。第二、叔丁醇较之氯仿和苯可
以很好地破坏该缔合，保证体系中绝大部分乳酸以
单分子地形式存在，从而实现酶催化。第三、空白实
验产率的高低反映了微观体系中分子簇破坏的情
况。叔丁醇的空白实验产率为0，说明其反应体系
可以完全的破坏分子簇。而且，叔丁醇的空间位阻
大，由色谱分析，未见其它峰的出现，说明叔丁醇在
脂肪酶存在下未与乳酸反应。
表1不同溶剂下Novoz邢435催化酯化的数据
T丑曲el D8_ta0neste曲cadonbyNov啊恤435诵th
di饪bremsolevents
酸醇摩尔比l：4，底物总质量0．8g，Novoz舯43550蝣，
溶剂5rTlL，摇床转速150r，IIlin，反应时间24h。
2。2脂肪酶的选择
选择了两种固定化脂肪酶和3种非固定化脂肪
酶。由于某些产物量过小，检测以超出内标曲线的
线性范围，故均采用<1％来表示。考虑到不同脂肪
酶的最佳催化温度不同，催化反应分别在30℃和
60℃下进行。由表2可知，N435对于该反应是最好
的催化剂。
万方数据
2006年8月 赵天涛等：双底物抑制下脂肪酶催化合成乳酸乙酯的研究 ．53．
／ 弋
H3c一午H—c=o⋯。H’o——c一午H—cH3ln一，lcH3fHcooH
6——H⋯一o～H⋯ 6一H⋯．o—H⋯ oH
H，c一亡H—cooH3c—cH—cooH
图l乳酸缔合方程
Fig．1Equ出onf leassociation0f1acIica id
表2不同脂肪酶的催化效果
7I汕1e2 Em：yrrmticsyTlt}lesisofet}Iyllac纽te
usiflgdi＆rentbiocatalysts
酸醇摩尔比1：4，底物总质量0。4g，酶50nlg，叔丁醇5mL，
摇床转速200r，lIlin，时间24h。
2．3最佳温度的选择
由图2的实验结果比较可知：温度小于40℃
时，酶活随温度升高而升高；当温度大于40℃时，酶
活随温度的升高而降低。温度低于60℃的范围内，
产率随着温度的升高而增加，直到60℃，反应得到
一个最大的产率，当温度再升高产率则呈下降趋势。
高活性一J。在较低温度下，N0vozynl435的活性不能
充分得以发挥；第二、随着温度的增加，底物的粘度
降低，外扩散阻力减小，也可以使产率提高；第三、温
度高于60℃时，会造成脂肪酶的失活加剧，从而导
致产率降低；第四、随着温度的升高，乳酸自身发生
聚合的程度加剧，致使体系中单分子乳酸减少而影
响产率。
乳酸乙酯的产率在60℃时达到最大值，这表明
酶的活性在60℃时较高并且体系对酶的不可逆失
活影响较小。所以将最优体系的温度定为60℃，并
在此基础上进行其它条件的优化选择。
2．4最佳底物配比的选择
固定乳酸的量，乙醇按一定摩尔比混合。乳酸
较高的含水量会导致整个体系的水含量过高，这有
可能影响酶的微观构相，加之乳酸的成本较乙醇高，
因此主要考察了乙醇过量的情况。如图3所示。随
璧!了罗岂：三堂髦璺亍芋竺：然43550娜，叔丁 着：畜对乳酸摩尔比的增大，N0vozym435的活性没
醇10札摇床转鼍罢√：：量譬￡要：h 暑磊主磊萎花。，石藉蕞艺磊晶摹摹葫主菇吴：。；磊图2反应温度的影响 7同7】业o，又～’l旦叮“瞅“邵叫7甲74“，日7”3“
№．2嗽t0ftemp。咖呲。n蛾tionyi。ld 醇摩尔比达到I：8时，产率达到最大。但是随着乙。萼翟实黧鍪望暨竺誓黧鬻，妻惹黧鬈裟黧器淼景：妻：：妻：量一：酶的涪譬!篓燃夏曼坠套娶三萎薪≤搽二‘-茗冥猫，署鞴；美夏军茹往的报道中N0v0鲫435可以在较高的温度下发挥。)‘一“。1””17、“”一。～一“7“。一～～”
万方数据
万方数据
万方数据