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Design of peptide with higher activity by studying the Granulysin’s antibacterial mechanism

从Granulysin抗菌机理出发合理设计抗菌肽



全 文 :从!"#抗菌机理出发合理设计抗菌肽
陈 菲,严 明,韦 萍!
(南京工业大学 制药与生命科学学院,南京*+,,,-)
摘 要:!"#是一种表达于人体毒性.淋巴细胞中的抗菌蛋白,其作用相当于广谱抗菌素。随着分子模拟技
术的发展,人们已经初步掌握了其结构与功能的关系,有关这方面的研究也取得了较大的进展。根据!"#
覆膜作用机理重新设计出具有活性的抗菌小肽,并通过实验对该片段的活性进行检验。
关键词:!"#;抗菌肽;抗菌活性
中图分类号:/0+1234 文献标识码:5 文章编号:+67*84679(*,,0),+8,,668,0
!"#+",%-"./0*1*232#*4+2&%*-"5./&462#&’#
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K?P?&FRM?QFGAF&?J%&#"I)M%&#Q)F.?JL)YFG)Q((Q"%JQ%"?QF#Q)T#JQ?")#&M?JL#W)(ML#(T??(QKMF"?"?J?Q&’X5R?RQ)K?(?BM?QU)QLL)BL?"#JQ)P)Q’,U#(K?()B?K T#(?KFQL?Q?JQF")#&M?MQ"#?M?JL#)(MFG!"#)QL)(R#R?",#K)Q(#Q)T#JQ?")#&G%JQ)FL#(T?P#&)K#Q?KT’?VR?")M?Q(3
9"2,’.+#:!"#;#Q)T#JQ?")#&R?RQ)K?;#Q)T#JQ?")#&#JQ)P)Q’
!"#(颗粒溶素)是近几年来新发现的一
种细胞毒性效应蛋白,它选择性地表达于自然杀伤
细胞和激活后的人体毒性.淋巴细胞,其作用相当
于广谱抗菌素,作用范围包括革兰氏阴性菌,革兰氏
阳性菌,真菌以及各种寄生虫等[+]。
: 基于!"#结构和抗菌机理来进行
抗菌肽的设计
+X+ !"#抗菌机理和活性结构特征的初步研究
抗菌肽与膜作用的时候有覆膜(J#"R?QW&)S?)和
穿膜(T#""?&W(Q#P?)两种基本模式[*]。已有研究表明
!"#可以覆膜形式与细胞膜直接作用导致细
胞膜的通透性增加继而使细胞裂解,电荷分布、疏水
作用和中心凝集作用是决定!"#作用模式的
主要因素[4]。
依据AF&?J%&#"<&?JQ"FRF"#Q)F理论,分子表面静电 势在抗菌肽与膜结合的过程中扮演了重要的角色[1]。 而!"#%&’()的等电点为-X1+0,其活性片段的等电点 高达+*X+90,我们推断!"#%&’()分子最大正电势所分 布的区域正是它们与膜结合时的不同起始区域。 碱性残基和疏水残基的极端排列是两亲螺旋的 主要特征,这种特殊的结构特征对抗菌肽的活性有 很重要的影响。对于!"#%&’()!稿,,1W+W,+9,W>?TX,,0·66·:L)?(?ZF%"#&FG[)FR"FJ?((<B)??")B
第4卷第+期
*,,0年*月
万方数据
片段处碱性氨基酸残基的数量较大,导致了其活性
片段具有较强的正电性,而且由于两亲螺旋的疏水
残基紧密地排列于球心,形成了一个较强的疏水核,
致使其可以稳定地以球形结构存在。
!"# 设计具有活性的抗菌肽
我们首先建立了所研究肽段的结构模型为
#%;627;=7>;.%4;.%4;&"’—(8)
原片段 (9)—:7%;.%4;1%/;.%4;();<&);8*+;.%4 ;(*;627;=7>;.%4;.%4;!+#—(8)
理论活性片段由!0个氨基酸残基组成,?个碱性氨基酸残基,5个疏
水氨基酸残基,黑体表示经替换的氨基酸残基
图! 替换后片段与原片段氨基酸序列比对图
@,4"! 8AB/&%,’4>27+7C(7’D7AEF7+,4’7F/7/>,F7+74B7’>>A
>2&>AE%&’()*+,’的螺旋-,图I为经替换后的理论活性片段。深灰
色球代表较强亲水性氨基酸,黑色球代表较强疏水性氨基酸,浅灰
色球代表其他类氨基酸。比较图&和图I我们可以看出替换后片段
的两亲性和正电性相对于%&’()*+,’螺旋-的!"(!#"!J5)
图# 螺旋片段氨基酸残基分布图(.’>27K,’可视化软件)
@,4"# L,+>%,I(>,’4AE&B,’A&D,F+,’>27+>%(D>(%7AE!;27),M
!"5 计算结果
我们分别计算了两个片段的表面静电势,并得
到了如图0所示的表面静电势分布图。
由图0可以很明显地看出替换残基后的%&’()*+,’抗菌机理出发合理设计抗菌肽 ·?3·
万方数据
! 实验结果
!"# #.+,的层析柱,填料为/012340567!8,
."8!#,9/,:;的流速,在!<.;,检测下以!倍床
体积的洗脱液进行平衡洗脱来分离纯化#肽。经质 谱和’=9&检测,目标肽已经合成,且纯度较高(如图 8,>)。 图8 合成抗菌肽的’=9&分析结果 ?:@"8 ’=9&3;3ABC:CDECB;F20C:G04101F:40 图中#.H!"8和#.I."<处均可表明目标肽的存在 图> 纯化后#肽的质谱图
?:@"> J3CC7C10+FKL,+23KF:;@DE#7101F:40 !"! 抗菌肽浓度测定———考马斯亮蓝67!8.法 先用已知浓度梯度系列的标准牛血清白蛋白 ()/M)取代待测蛋白质样品,与待测蛋白质样品同 等测定条件下,测定!8H8值。以)/M标准蛋白质量 浓度(,@/,9)为横坐标,!8H8值为纵坐标,绘制标 准曲线,得到线性方程:"N.".!I8OP.".##!I#。 测定待测样品的浓度时,做了O个待测浓度梯度即 #/>待测、O/>>>待测,采用待测#、待测!
O待测,
最后测得合成肽质量浓度为."I,@/,9。 !"O 抗菌肽构象的初步确定 !"O"# 在)LE0K环境中的二级结构———远紫外圆 二色谱(&%)的测定[8]."@合成肽溶解于!"<,9、!8,,DA/9的磷
酸缓冲液,1’为>",用旋光分光光度计在!8Q以 下测定&%光谱,结果如图I所示(峰谷&%值: R>"I!!>,峰尖&%值:R">#I#)。计算结果
为:M9=’M!."#!。
图I 缓冲液中十四肽的&%谱图
?:@"I 6K312DEF20&%C10+FK3DE#733101F:40:;F20SLE0K !"O"! 在疏水环境中的二级结构———远紫外圆二 色谱(&%)的测定[8,>].,@合成肽溶解于!"<,9、O.,J/9/%/
溶液,用旋光分光光度计在!8Q以下测定&%光
谱,结果如图<所示(峰谷&%值:RH".!$I,峰尖
&%值:R8"!"!""# 琼脂孔穴扩散法[I]
将处于对数生长期的细菌悬浮液(%&>8.N."O)
>."9与固体培养基(含琼脂质量分数#"8QQ保存。使用时皿内等距离打直径为O
,,的小孔,滴入!<"9的待测样品液,OIQ培养 #.2,测量抑菌圈直径,表示测试品的活力大小(图 H)。3图中,滴加)LE0K的孔最大直径为"8,,,滴
加/%/的孔最大直径为>,,;S图中,滴加)LE0K的
孔最大直径为#.,,,滴加/%/的孔最大直径为#O
,,。可见
·><· 生物加工过程 第O卷第#期
万方数据
图! 在疏水环境中十四肽的"#谱图
%&’G H2/%I%/%01-.345+0+/%60%7/,0=:.0)*76<#<
图3A 十四肽的抑菌效果分析
%&/’,可致死()*的菌体;作
用于葡萄球菌时,+,-./溶液中(0肽浓度为0!
!%&/’时可以致死!0*的菌体,且在
121溶液中的线性关系优于+,-./溶液。
! 讨 论
葛兰氏阳性菌的磷壁酸是重要表面抗原,它带
有较多的负电荷,表面具有较强的负电性,因此具有
强正电性的(0肽可以更好地通过静电作用扰乱葛
兰氏阳性菌的细胞壁和细胞模结构。实验结果表明
(0肽的设计方法是合理的,而且通过比较其在
+,-./环境和疏水环境中的抗菌活性,进一步说明
了"螺旋的重要性以及抗菌肽结构和功能的重要关
系。
随着对抗菌肽的分离、结构与功能的研究,改造
并合成既具有稳定高效抗菌活性又具特异抗菌谱且
同时对宿主无害的抗菌肽,并通过基因工程在原核
细胞、真核细胞中进行表达,以实现批量生产,将有
希望成为对付主要病原体特别是耐药菌或肿瘤细胞
的新型药物。
参考文献:
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·NL· 生物加工过程 第M卷第(期
万方数据

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