全 文 ：从!"#$%&’()$抗菌机理出发合理设计抗菌肽
陈 菲，严 明，韦 萍!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京*+,,,-）
摘 要：!"#$%&’()$是一种表达于人体毒性.淋巴细胞中的抗菌蛋白，其作用相当于广谱抗菌素。随着分子模拟技
术的发展，人们已经初步掌握了其结构与功能的关系，有关这方面的研究也取得了较大的进展。根据!"#$%&’()$的
覆膜作用机理重新设计出具有活性的抗菌小肽，并通过实验对该片段的活性进行检验。
关键词：!"#$%&’()$；抗菌肽；抗菌活性
中图分类号：/0+1234 文献标识码：5 文章编号：+67*84679（*,,0）,+8,,668,0
!"#$%&’()")*$+",$*--$%-"./0*$1$*232#*4+2$&%*-"5./&462#$&’#
/&*$3/0*".$/67"0-/&$#7 :;<=>?)，@5=A)$B，C（:F&?B?FGH)G?IJ)?$J?#$KEL#"M#J’，=#$N)$BO$)P?"()Q’FG.?JL$F&FB’，=#$N)$B*+,,,-，:L)$#） 83#*./0*：!"#$%&’()$)(#(R?J)#&S)$KFG#$Q)T#JQ?")#&R"FQ?)$，UL)JL)(?VR"?((?K)$:’QF&’Q)J.H’MW RLFJ’Q?()$QL?L%M#$TFK’XDQL#((FM?#$Q)T#JQ?")#&#JQ)P)Q)?(()M)&#"QFQL?T#JQ?")FRL#B?XC)QLQL?
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9"2,’.+#：!"#$%&’()$；#$Q)T#JQ?")#&R?RQ)K?；#$Q)T#JQ?")#&#JQ)P)Q’
!"#$%&’()$（颗粒溶素）是近几年来新发现的一
种细胞毒性效应蛋白，它选择性地表达于自然杀伤
细胞和激活后的人体毒性.淋巴细胞，其作用相当
于广谱抗菌素，作用范围包括革兰氏阴性菌，革兰氏
阳性菌，真菌以及各种寄生虫等［+］。
: 基于!"#$%&’()$结构和抗菌机理来进行
抗菌肽的设计
+X+ !"#$%&’()$抗菌机理和活性结构特征的初步研究
抗菌肽与膜作用的时候有覆膜（J#"R?QW&)S?）和
穿膜（T#""?&W(Q#P?）两种基本模式［*］。已有研究表明
!"#$%&’()$可以覆膜形式与细胞膜直接作用导致细
胞膜的通透性增加继而使细胞裂解，电荷分布、疏水
作用和中心凝集作用是决定!"#$%&’()$作用模式的
主要因素［4］。
依据AF&?J%&#"<&?JQ"FRF"#Q)F$理论，分子表面静电 势在抗菌肽与膜结合的过程中扮演了重要的角色［1］。 而!"#$%&’()$的等电点为-X1+0，其活性片段的等电点 高达+*X+90，我们推断!"#$%&’()$分子最大正电势所分 布的区域正是它们与膜结合时的不同起始区域。 碱性残基和疏水残基的极端排列是两亲螺旋的 主要特征，这种特殊的结构特征对抗菌肽的活性有 很重要的影响。对于!"#$%&’()$分子，因为其活性 ! 收稿日期：*,,1W+*W*, 作者简介：陈 菲（+-9,W），女，硕士研究生，研究方向：抗菌肽，抗菌蛋白。 >?TX*,,0 ·66· 生 物 加 工 过 程 :L)$?(?ZF%"$#&FG[)FR"FJ?((<$B)$??")$B
第4卷第+期
*,,0年*月
万方数据
片段处碱性氨基酸残基的数量较大，导致了其活性
片段具有较强的正电性，而且由于两亲螺旋的疏水
残基紧密地排列于球心，形成了一个较强的疏水核，
致使其可以稳定地以球形结构存在。
!"# 设计具有活性的抗菌肽
我们首先建立了所研究肽段的结构模型为
$%&’()*+,’螺旋-结构相似的两亲性!螺旋片段； 其次，考虑到碱性和疏水性氨基酸残基的重要影响， 我们选择了-个重要位点进行残基替换；因为!螺 旋结构有特殊的氢键形成方式，最终我们认为以下 的残基替换最为合理：.+/0-替换为12%以减小片 段的负电性；.+’03替换为.%4以增加片段的正电 性和亲水性；1*%5#替换为627以增加片段8末端 的疏水性，如图!，#，-所示。 替换后片段 （9）—:7%;.%4;1%/;.%4;!"#;<&);8*+ ;$#%;627;=7>;.%4;.%4;&"’—（8）
原片段 （9）—:7%;.%4;1%/;.%4;$();<&);8*+;.%4 ;$(*;627;=7>;.%4;.%4;!+#—（8）
理论活性片段由!0个氨基酸残基组成，?个碱性氨基酸残基，5个疏
水氨基酸残基，黑体表示经替换的氨基酸残基
图! 替换后片段与原片段氨基酸序列比对图
@,4"! 8AB/&%,’4>27+7C(7’D7AEF7+,4’7F/7/>,F7+74B7’>>A
>2&>AE$%&’()*+,’G+&D>,H7+74B7’> 图&为$%&’()*+,’的螺旋-，图I为经替换后的理论活性片段。深灰
色球代表较强亲水性氨基酸，黑色球代表较强疏水性氨基酸，浅灰
色球代表其他类氨基酸。比较图&和图I我们可以看出替换后片段
的两亲性和正电性相对于$%&’()*+,’活性片段而言更强，理论活性 片段的!"（!#"3J5）大于$%&’()*+,’螺旋-的!"（!#"!J5）
图# 螺旋片段氨基酸残基分布图（.’>27K,’可视化软件）
@,4"# L,+>%,I(>,’4AE&B,’A&D,F+,’>27+>%(D>(%7AE!;27),M
!"5 计算结果
我们分别计算了两个片段的表面静电势，并得
到了如图0所示的表面静电势分布图。
由图0可以很明显地看出替换残基后的$%&’; ()*+,’活性片段9末端处的正静电势相对于原片段 而言强度更加集中，且正静电势的作用范围也往外 延伸；此外，由图N的比较结果可以知道替换残基 图&表明该理论活性片段可以正常地形成!螺旋；图I表明该理论 活性片段中15的9;O与:!的8PQ之间，RS的9;O与15的8P Q之间以及@!0的9;O与@!T的8PQ之间都能正常地形成氢键， 说明这-个位点氨基酸残基的替换不会影响螺旋的正常形成 图- 理论活性片段达最低能量态时的氢键形成图（O*/7%; D27B试用版软件，利用分子动力学==U方法进行几 何优化） @,4"- @A%B&>,A’AEO;IA’F,’>27F7+,4’7F/7/>,F7+74B7’> &为替换残基后的片段，I为未经替换的片段；深灰色表示显正电性 的区域，浅灰色表示显负电性的区域 图0 片段表面静电势分布图（.%4(+)&I软件，用量子力学 V=;WX9LQ方法计算） @,4"0 L,+>%,I(>,’4AE>27+>&>,D/A>7’>,&)&%A(’F>27BA)7D()7+ 后片段的两亲性也强于原片段。因此从理论上我们 推断经残基替换后的片段能够更稳定地与膜结合， 并且因为8末端的627带有比1*%更强的疏水基 团从而更易导致膜的扰动。 #TT5年#月 陈 菲等：从$%&’()*+,’抗菌机理出发合理设计抗菌肽 ·?3·
万方数据
! 实验结果
!"# #$肽的合成，分离和纯化 我们用%&&／’()*固相合成法合成了目标肽， 选用#+,-$.+,的层析柱，填料为/012340567!8，
."8!#,9／,:;的流速，在!<.;,检测下以!倍床
体积的洗脱液进行平衡洗脱来分离纯化#$肽。经质 谱和’=9&检测，目标肽已经合成，且纯度较高（如图 8，>）。 图8 合成抗菌肽的’=9&分析结果 ?:@"8 ’=9&3;3ABC:CDECB;F20C:G04101F:40 图中#.H!"8和#.I."<处均可表明目标肽的存在 图> 纯化后#$肽的质谱图
?:@"> J3CC7C10+FKL,+23KF:;@DE#$7101F:40 !"! 抗菌肽浓度测定———考马斯亮蓝67!8.法 先用已知浓度梯度系列的标准牛血清白蛋白 （)/M）取代待测蛋白质样品，与待测蛋白质样品同 等测定条件下，测定!8H8值。以)/M标准蛋白质量 浓度（,@／,9）为横坐标，!8H8值为纵坐标，绘制标 准曲线，得到线性方程："N.".!I8OP.".##!I#。 测定待测样品的浓度时，做了O个待测浓度梯度即 #／>$待测、O／>$待测和>／>$待测，采用$待测#、$待测!
和$待测O三者平均值作为最终测定质量浓度$待测，
最后测得合成肽质量浓度为."$I,@／,9。 !"O 抗菌肽构象的初步确定 !"O"# 在)LE0K环境中的二级结构———远紫外圆 二色谱（&%）的测定［8］$."@合成肽溶解于!"<,9、!8,,DA／9的磷
酸缓冲液，1’为>"$，用旋光分光光度计在!8Q以 下测定&%光谱，结果如图I所示（峰谷&%值： R>"I!$!>，峰尖&%值：R$">#I#$）。计算结果
为：M9=’M!."#!。
图I 缓冲液中十四肽的&%谱图
?:@"I 6K312DEF20&%C10+FK3DE#$733101F:40:;F20SLE0K !"O"! 在疏水环境中的二级结构———远紫外圆二 色谱（&%）的测定［8，>］$.,@合成肽溶解于!"<,9、O.,J／9/%/
溶液，用旋光分光光度计在!8Q以下测定&%光
谱，结果如图<所示（峰谷&%值：RH".!$I，峰尖
&%值：R8"!"$抗菌分析 !"$"# 琼脂孔穴扩散法［I］
将处于对数生长期的细菌悬浮液（%&>8.N."O）
>."9与固体培养基（含琼脂质量分数#"在$8Q左右混合均匀，铺在水平的灭菌培养皿中，待 其凝固后$Q保存。使用时皿内等距离打直径为O
,,的小孔，滴入$!<"9的待测样品液，OIQ培养 #.2，测量抑菌圈直径，表示测试品的活力大小（图 H）。3图中，滴加)LE0K的孔最大直径为$"8,,，滴
加/%/的孔最大直径为>,,；S图中，滴加)LE0K的
孔最大直径为#.,,，滴加/%/的孔最大直径为#O
,,。可见
·><· 生物加工过程 第O卷第#期
万方数据
图! 在疏水环境中十四肽的"#谱图
$%&’! ()*+,-./,0"#1+02/)*-.345**+0+/%60%7/,0,85 6)-+,-9%22%)2:;1/*720 34肽对金黄色葡萄球菌的抗性约为大肠杆菌的两 倍，且在<#<溶液中的抗性要强于在=:.0)中的抗 性。 >’4’> 抗菌肽液体抑菌浓度的测定［!］ 将处于对数生长期的细菌悬浮液（!"?@AB A’C）CA!D与液体培养基@EA!D混合，加入4AA!D 不同浓度的抗菌肽，CEF恒温振荡培养3@A;%7，用 冰水浴冷却，然后测定?@A7;的吸光率。以浓度 的对数值对相对吸光率作图（见图3A）。 *大肠杆菌活性实验结果：3，>号孔滴加=:.0)，C，4号孔滴加<#<。 9金黄色葡萄球菌活性实验结果：3，>号孔滴加=:.0)，C，4号孔滴加 <#<。 图G 在=:.0)和疏水环境中34肽的抗菌活性比较（3和C 号孔滴加量为4!D，>和4号孔滴加量为!!D）$%&’G H2/%I%/%01-.345+0+/%60%7/,0=:.0)*76<#<
图3A 十四肽的抑菌效果分析
$%&’3A H7*J81%1-./,0345+0+/%60’1*2/%I%/%01’ 作用于大肠杆菌时，=:.0)溶液中34肽浓度为 4@!;-J／D时可以致死>EK的菌体，最低抑菌浓度 为33’>@!;-J／D，可致死3?K的菌体。<#<溶液中 34肽浓度为4@!;-J／D时可以致死C?K的菌体，最 >AA@年>月 陈 菲等：从()*7:J81%7抗菌机理出发合理设计抗菌肽 ·?G· 万方数据 低抑菌浓度为!"#!$%&／’，可致死()*的菌体；作
用于葡萄球菌时，+,-./溶液中(0肽浓度为0!
!$%&／’时可以致死0#*的菌体，121溶液中(0肽 浓度为0!!$%&／’时可以致死!0*的菌体，且在
121溶液中的线性关系优于+,-./溶液。
! 讨 论
葛兰氏阳性菌的磷壁酸是重要表面抗原，它带
有较多的负电荷，表面具有较强的负电性，因此具有
强正电性的(0肽可以更好地通过静电作用扰乱葛
兰氏阳性菌的细胞壁和细胞模结构。实验结果表明
(0肽的设计方法是合理的，而且通过比较其在
+,-./环境和疏水环境中的抗菌活性，进一步说明
了"螺旋的重要性以及抗菌肽结构和功能的重要关
系。
随着对抗菌肽的分离、结构与功能的研究，改造
并合成既具有稳定高效抗菌活性又具特异抗菌谱且
同时对宿主无害的抗菌肽，并通过基因工程在原核
细胞、真核细胞中进行表达，以实现批量生产，将有
希望成为对付主要病原体特别是耐药菌或肿瘤细胞
的新型药物。
参考文献：
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·NL· 生物加工过程 第M卷第(期
万方数据