全 文 ：May2008
·48·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第3期
2008年5月
利用蛋白酶产生菌固态发酵
去除豆粕中抗原蛋白
胥九兵，余晓斌，王丽菊
(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122)
摘要：从实验室保藏的菌种中，筛选出固态发酵所需的高产蛋白酶茵株，进行豆粕发酵。以抗源蛋白去除情况作
为考察指标，通过条件优化发现，在豆粕水分质量分数为45％，颗粒直径在1．O一2．0l砌，发酵温度35℃，发酵时
间为50h时。抗原蛋白的去除率在90％以上。通过十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现抗源蛋白得
到有效降解。分解为相对分子质量小于10000的肤类物质。
关键词：抗源蛋白；枯草杆茵；凝胶电泳；豆粕
中图分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)03—0048一04
Removalof ntigenproteininsoybeanmealbyaproteinase
producingBacillussubtilisstrain
XUJiu—bing，YUXiao-bin，WANGLi-ju
(KeyLaboratoryofIndustrialB otechnologyofMinistryofEducation，CollegeofBiotechnology，
JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)
Abstract：ABacillussubtilisstrainwascreenedtoimprovethproductionofproteinaseinthprocessof
solidstatef rmentationofsoybeanmeal．OrthogonalexperimentaldesignWasusedtoscreenoptimalcon-
ditionfor emovingantigenproteins．Undertheoptimalconditionofsoybeanmealhumidityat45％，par-
ticlediameterat1．0—2．0mm，andfermentationat35℃for50h，theremovalr teofantigenprotein
reached90％．SDSelectrophoresisc nfirmedthantigenproteinWaseffectivelydegraded．Themolecular
weightof hedegradedpeptideWaslessthan10000．
Keywords：antigenprot in；Bacillussubtilis；electrophoresis；soybeanmeal
豆粕作为一种重要的植物蛋白源，含有比较齐
全、丰富的营养成分，有着重要的应用和研究价值。
但大豆中的蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitors)、植物
凝集素(soybeanagglutinin，SBA)、大豆抗原蛋白
(antigenprotein)、脲酶(urease)、植酸(phyticacid)、
大豆低聚糖(soybeanoligosaccharides)等抗营养物质
的存在，不但极大地阻碍动物对营养成分的消化、
吸收和利用，而且严重地危害动物的健康和生长发
育⋯。其中的蛋白酶抑制剂、植物凝集素、脲酶等
物质属于热不稳定抗营养因子，可以通过加热的方
法将其去除。大豆抗原蛋白作为热稳定性抗营养
因子，能够引起动物的腹泻、生长受阻等过敏反应。
收稿日期：2007—12-27
基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划资助项目(IRT0532)
作者简介：胥九兵(1982一)，男，山东莱芜人，硕士研究生。研究方向：发酵工学。
联系人：余晓斌，男，教授，E-mail：xbyu@jiangnan．edu．cn
万方数据
2008年5月 胥九兵等：利用蛋白酶产生菌固态发酵去除豆粕中抗原蛋白 ·49·
大豆抗原蛋白主要包括11S球蛋白和7S球蛋白，两
者占大豆蛋白含量的70％左右阻。5]。
对豆粕抗原蛋白的处理方法有：热乙醇处理
法、膨化加工处理法、生物处理法。生物处理法主
要是利用微生物产生的酶系来降解豆粕中的抗原
蛋白。不但可以去除蛋白酶抑制剂、植物凝集素、
脲酶等热不稳定抗营养因子的作用，而且能够大大
降低抗原蛋白的含量，增加大豆多肽、游离氨基酸
的含量，具有较好的动物适口性，从而提高豆粕的
利用率和营养价值怕J。
1材料和方法
1．1 材料
豆粕：市场购得，蛋白质量分数40％，粉碎。
菌种：枯草杆菌，实验室保藏，已经经过鉴定为
安全可靠菌株。
培养基：细菌培养基‘71；酪素培养基‘81。
豆粕发酵培养基：取50g豆粕(含水质量分数
50％)，pH自然，置于250mL三角瓶中，110℃灭菌
15min。
1．2仪器
DYY-6C型电泳仪，凯氏定氮仪2300，水分天
平、分析天平等。
1．3试剂
0．03mol／L的Tris—HCI(pH8．0，包括0．01
mol／L口．巯基乙醇)，电泳试剂，凯氏定氮试剂等。
1．4实验方法
1．4．1菌种培养和豆粕发酵
将枯草芽孢杆菌接种于摇瓶中30℃培养24h，
以10％的接种量接种于豆粕发酵培养基中，混匀，
32℃静止发酵48h后烘干，粉碎。
1．4．2抗原蛋白提取和测定
称取粉碎后的发酵豆粕1．00g，使其浸泡在
20．0mL、0．03mol／L的"Iris．HCI(pH8．O，包括
0．01mol／L口一巯基乙醇)缓冲液中，将其置于100
r／min的摇床上30℃浸泡1h，然后4000r／min离
心20min，取上清液。将上清液用HCl调节pH至
6．4，在2～5℃、4000r／min条件下离心20min，沉
淀即为11S球蛋白。然后将取得的上清液用HEl
调节pH至4．8，在2—5℃、4000r／min条件下离
心20rain，所得沉淀为7S球蛋白[9J。提取豆粕中
的抗原蛋白时，直接取上清液，不调节pH等电点，
上清液为抗原蛋白(11S球蛋白和7S球蛋白之
和)、小肽和氨基酸类的混合物。蛋白含量用凯氏
定氮法测定¨0|。
抗原蛋白去除率(％)=发酵后豆粕中抗原蛋
白质量(g)／发酵前豆粕中抗原蛋白质量(g)
×100％
1．4．3十二烷基磺酸钠(SDS)一聚丙烯酰胺凝胶电泳
11S球蛋白是一个四聚体蛋白，相对分子质量
在3．50×105—3．60×105之间，具有3000个氨基
酸残基，是由6对相同的蛋白亚基构成，每对亚基的
相对分子质量约6．00×104，该亚基是由1个酸性A
肽(3．50×104～4．00×104)和1个碱性B肽
(2．20×104)通过二硫键连接而成；7S球蛋白为1
个三聚体蛋白，相对分子质量在1．50×105～1．75×
105之间，由Ot’，Ot，133个亚基组成，相对分子质量
分别为7．60×104，7．20×104，5．30X104。可以用
SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳将其分离，按照文献[7]
和[11]配制质量分数12％的分离胶和质量分数
5％的浓缩胶。将上述制得的未调节pH的上清液
按体积比1：1的比例加入2倍还原缓冲液(2×re—
ducingbuffer)，放入沸水中加热3—5min，冷却至室
温。加入到制得的电泳凝胶板上，调节电流15mA，
电压为200V，进行电泳。当溴酚蓝指示剂到达凝
胶底部时，结束电泳。小心剥胶至固定液中固定10
—15min，取出凝胶染色20—30rain后，放置于脱色
液中脱色，直至条带清晰可见"川。
2实验结果与讨论
2．1产蛋白酶菌株的选择
根据菌株在酪素培养基中产生透明圈的大小
筛选出A、B、C、D、E、F、G7株蛋白酶高产菌株。将
筛选出的7株菌接种于液体培养基中，30℃下培养
24h，再按10％的接种量加入到豆粕发酵培养基中，
混匀，30℃静止培养48h，在发酵过程中通过观察
发酵料的颜色、气味(氨臭气味)、黏度来观察发酵
情况(以“+”的个数表示颜色、气味、黏度情况)，结
果如表1所示。黏度过大会影响发酵时的通气性，
氨臭气味过重会影响动物的适口性。发酵结束后，
烘干、粉碎发酵料，称取1．00g，测定抗原蛋白的降
解率，结果如图l所示。C株枯草芽孢杆菌在发酵
过程中保持松散，无异味，而且抗原蛋白降解效果
良好，所以选用C株菌作为实验菌株。
万方数据
·50· 生物加工过程 第6卷第3期
表1 不同菌株对豆粕发酵后性状的影响
TableE日ectofdifferentstrainsfermentation
onsoybeanc kecharacter
80
堡70
姗60
蠡
辖10帅 r] r]
2．2 固态发酵条件的优化
固态发酵是细菌在少量游离水的基质表面上
有氧生长富集的过程。影响微生物生长产酶的同
时会影响到抗原蛋白的降解。其中较为重要的是
发酵豆粕的水分含量、通气量、发酵温度和发酵时
间。其中的水分含量是指添加液体种子量、豆粕本
身含水量、外加水分之和占发酵豆粕总质量分数。
在发酵过程中，游离水分不足，不能满足微生物生
长代谢的需要；水分过量，影响豆粕的通气性。合
适的水分对于豆粕发酵有着重要的意义。在静止
发酵过程中，豆粕的颗粒直径直接影响到整个发酵
过程的通气量和微生物的分布。颗粒太大，利于空
气渗透到发酵豆粕的下层，但同时总的表面积会减
少，影响细菌的分布，产生的酶也不能充分渗透到
豆粕内部达到降解抗原蛋白的目的；颗粒太小，加
大了总的表面积，利于微生物的分布，酶解效率提
高，但是影响了整个体系的通气量，也不利于抗原
蛋白的去除。因此需要控制适当的颗粒直径，既能
满足微生物对空气的需求又能达到降解抗原蛋白
的目的。温度不仅能够影响到微生物的生长速度、
产酶效率，而且对蛋白酶的酶活也有很大影响，温
度不同对抗原蛋白的降解效率也会有很大的不同。
发酵时间也是影响抗原蛋白降解的重要因素，时间
不足，抗原蛋白不能得到有效降解；时间过长，会造
成资源的浪费，因此合理的发酵时间也有着重要的
经济意义。
根据降低抗原蛋白的要求，可以选择对豆粕发酵
有较大影响的水分含量、颗粒直径、发酵温度、发酵时
间4个因素、3个水平设计正交实验，正交实验因素
和水平设计如表2所示，正交实验结果及分析如表3
所示。在水分含量的3个水平中，抗原蛋白降解率变
化较小，即水分质量分数在45％一50％时，对抗原蛋
白降解率影响较小。在颗粒直径的3个水平中，颗粒
直径在1．0—2．0Inln时，抗原蛋白的降解率要高于另
外两个水平。在不同的温度水平中，抗原蛋白的降解
率变化较大，其中在35℃时降解效果突出，达到
90％。发酵时间不同，对抗原蛋白的降解也有一定的
影响，在50h时降解效果较好。按照极差大小，影响
固态发酵降低抗原蛋白的主次因素依次为C、B、D、
A。根据表3可知，工艺组合为A3B：C：D，，由于水分
对抗原蛋白降解影响不大，利用A，B：c：D，组合和
A，B：C：D，组合进行对照实验，抗原蛋白降解率分别
为92．0％和92．8％，可见水分质量分数在45％一
50％时对抗原蛋白降解作用不明显，因此工艺优化组
合为水分质量分数45％，颗粒直径1．0—2．0toni，发
酵温度35℃，发酵时间50h。
表2正交实验的因素和水平设计
Table2 Thefactorsandlevelinorthogonalexperiment
批次埘(水分A)／％d(颗粒B)／mmf(发酵C)／℃f(发D酵)／h
2 l 82．7
¨一一一％一㈨灿那眦舢Ⅲ舢吣一一一～一一一一一一一一一一一
～～一B一一。2
3。2
3。2
万方数据
2008年5月 胥九兵等：利用蛋白酶产生菌固态发酵去除豆粕中抗原蛋白 ·51·
2．3 SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳
利用工艺优化得到的最佳组合，进行豆粕发
酵，将样品处理后，进行SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳，
由图2知，大豆的抗原蛋白降解较为彻底，大部分转
化为相对分子质量小于1×104的肽类物质。
图2 SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
Fig．2ResultsofSDS—PAGE
3结论
经过条件优化和电泳实验验证发现，豆粕水分
质量分数为45％，颗粒直径在1．O～2．0mm范围
内，发酵温度35qC，发酵时间50h时，产蛋白酶菌
对抗原蛋白降解效果较好，去除率在90％以上。
致谢：本课题是在酶工程与技术研究室老师的
精心指导和同实验室的研究生同学的大力协助下
完成，感谢他们所提供的帮助。
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