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Recent advances in biodesulfurization catalyst

生物脱有机硫催化剂的最新研究进展



全 文 :Hov.2003
·6·
生物加工过程
曲iIle∞j删Ⅱ试《Bi叩‘0ce骼Ⅱ西nee矗“g
第1卷第2期
2003年n月
疫苗分离纯化研究进展
周卫斌,苏志国
(中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京100080)
摘要:综述了国内外关于疫苗分离纯化的研究进展,系统介绍了目前可用作各类疫苗(尤其是基因工程疫苗)分
离纯化的方法。沉淀和离心等传统分离技术在各类疫苗的分离纯化中应用广泛,层析技术和其它分离技术的结合
已成为疫苗分离纯化的主流,新型膜技术和亲和层析在基因工程亚单位疫苗分离纯化中的作用引人注目。
关键词:基因工程疫苗;分离纯化;亲和层析
中图分类号:R3742 文献标识码:A 文章编号:1672—3678(2()03)02一0006一07
DeveIopmentinr嚣翰rchofisolationandpIlri6cati衄ofvaccine
ZHOUWd_bjn,SUZhi一即o
(N砒iondI丑岫小y0fBioclleIIlicalEn画ne甜IIg,IfIstitute0fProc ssEI画TleedrIg,
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Abs吮t:’11lecu肿nts 吕ne0王developmentinthe聪search甜jsolaLion卸dpu一{icationofvaccinesrwie№d.
TheVad叫ss8p棚tiontechnologies,whichhavebeenutilizedfbrv∞eines para60n,a10ngWithdⅡk唧1‘印pli—
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lal誉一sc甜el vel,etc,arehi出ighted鲫dt}leworkforfutureisdiscussed.
Keywords:rec叩_lbinalltvaccine;isolatjonandpllrmcation;amni‘ychmlTlatography
疫苗在预防许多种疾病方面的功绩已为世人公
认。因大面积接种天花疫苗、脊髓灰质炎疫苗等,
1977年,世界卫生组织(wHo)宣布在地球上彻底消
灭-广天花;2000年,中国和世界上许多国家消灭了
小儿麻痹症;数以百计的疫苗对许多传染病也已实
现有效控制,使人类的平均寿命延长了几十年。这
一切无可辩驳地证明了疫苗对人类健康和社会发展
做出的巨大贡献。
长期以来,疫苗的研制一直采用直接灭活病原
菌或连续培养减毒的方法。这种用全颗粒菌体或病
毒制成的传统疫苗一般都有较大的副作用。近几十
收稿日期:蜘030826
作者简介:周卫斌(1974一),男,博士研究生,研究方向:生化工程。
年来,化学、生物化学、分子生物学和免疫学等学科
的空前发展,使得人们可直接从细菌或病毒巾提纯
有效的蛋白抗原或多糖抗原成分制成无细胞疫苗。
上世纪70年代后,由于基因工程技术的兴起,人们
可通过克隆外源基因到细菌和病毒中或者突变、缺
失有关基因获得基因工程减毒活疫苗,也可通过克
隆外源基因到细菌、酵母、动植物及昆虫细胞中表达
病原菌的特异性蛋白抗原,然后纯化出抗原组分制
成基因工程亚单位疫苗。这种组分疫苗(包括无细
胞疫苗和基因工程疫苗)已逐渐替代传统疫苗成为
当代疫苗生产的主导。20世纪90年代后期刚出现
万方数据
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2003年11月 许平等:生物脱有机硫催化剂的最新研究进展 ‘3’——一——————————————————————————————————————————————————————————————————————一——1提高重组细菌脱硫活力
重组的降解DBT的菌株都存在一个提高脱硫
活力进而提高表达效率的问题,现在的研究主要是
从表达调控和引进脱硫过程中参与的氧化还原酶的
如D基因提高脱硫活力。
1.1改变表达的拷贝数提高表达效率
1bⅢMaLsLli等人重组到一株鼬od删瑚sp.
1∞,pRKPP,通过引进了一个额外的d口操纵元可以
将脱硫活力提高3,3倍.从每克干细胞9.5p-nol/h
提高到每克干细胞31伽甜/h;进而他们优化了DBT
的浓度在25n叫L,葡萄糖的质量浓度在log,L,即
优化了c,s比,改变了脱硫基因表达的拷贝数,同样
也将脱硫的活力提高了2~3倍”J。
1.2共表达d“D提高脱硫活力
在所谓的“4s”途径中,还需要由第四个酶:
NADH:删N氧化还原酶来协同作用,它提供了氧化
反应的还原力。它是由d口D基因编码的,并且它的
表达并不和d”ABc基因紧密联系”J。以前的文献
报道发现将IGTS8中的d%D基因失活可以阻止脱
硫恬力,但是它的功能在体外可咀完全被其他的
ⅢN还原酶代替。所以在重组表达d口ABc基因的
时候一般是同时引人如D的基因来提高脱硫活力,
实验也证明d”D基因的协同表达可以极大的提高
脱硫活力。一方面可以将原始菌株的d”D酶基因
导人到再组子中,让这个四个酶同时表达,可以提高
脱硫活力,如watanabe等人将矾Dd口c∞c∞e州^啪胁
KA215—1的d站AB(D转化到P螂舶伽na5础喇r啪
NcIMB957l中,构建的重组子PAR4l的体止细胞可以
从含s 360n叫L的轻汽油(LI如)中降解了舒n卅L的
硫;同时使用烷烃培养的休止细胞要比葡萄糖培养
的活力提高10~18倍“j。另一方面可以使用其他
的氧化还原酶基因来代替原始菌株的d”D酶。在
一株恶臭假单胞菌中,使用妣启动子表达d《ABc
的共表达E.c埘w中的如oc黄素还原酶可以极大
的提高脱硫活力,这个枷c.d"ABc重组质粒已经
被导人到凸P“由m舢,c0,础删rⅢ,和砌舭on缸等
菌株中,都表现出了脱硫活力”J。同样的结果也在
Reichmutll等人的工作中出现,他们在一株E.∞n中
共表达d”ABc和w6嘞胁n柳黄素还原酶”1,构建
了两个质粒:pDsR3负责将DBT转变成2一HBP,pD—
sR2表达w6n0如n州f黄索氧化还原酶。最大的降
解DBT速率达到了每克干细胞8-n咖,如果在氧化
还原酶表达中添加额外的葡萄糖或甘油来培养菌
体,可以达到一个最高的降解DBT速率:每克十细
胞51In舢。但是有一个很奇怪的现象:虽然表达氧
化还原酶可以提高DBT的脱除速率,但是降低了2一
HBP的生成速率。当使用乙酸培养和没有氧化还原
酶的表达的时候可以达到最大的HBP产生速率。
关于这个现象,Kenesz认为是由于参与反应的FMN
成为还原态的FMNH,后,必须要自然氧化,产生过
氧化氢和游离的超氧化物。当黄素还原酶的活力太
高的时候,这些物质积累太多对细胞是有毒性的。
所以为了构建最佳的脱硫菌株,就要兼顾这两个方
面,一方面适当的提高黄素还原酶的活力;另一方面
也要保护菌株不受这些副产物的毒害。还有‘个策
略是提高一些抗氧化蛋白的表达水平来保护菌体本
身,例如:过氧化氢酶,超氧化物歧化酶或烷基氢过
氧化物还原酶”,。
2使用定向进化技术(m蛆sbumiIlg)扩大
底物降解范围
1994年,一种新的定向分子进化新技术——
I)NA改组(DNAshumillg)在美国A硒Tlax研究所的
stemnler实验室出现。该技术在分子水平上创造出
分子的多样性(mleclllafdiversiLv),结合灵敏的筛选
技术,迅速得到理想的变异。Monticello及其同事给
出一种莉的技术用于定向进化,即RAcH邢
(Rand吣ehin忙rBgef燃isontrallsienLt Ⅱ磷a{鹧)技术。
使用RAcHnTI.技术他们改造了IGl硝中的d口c酶
的基因,获得了每个基因14个重组交换,大大高于
其他的⋯些重组方法。改造后的酶提高了降解速
率,扩大r对各种复杂底物的降解范围,列各种非自
然的物质的降解速率提高了加倍”]。同样也是
MonticeIl0这个研究小组他们使用一个两相限硫恒化
培养法(h∞.phases曲r_limite(1chemostal)来挑选
IG7Is8的突变子,结果他们获得的突变子可以以辛
基硫化物和5.甲基苯噻吩作为唯一硫源.扩大了原
始菌的脱硫谱。他们研究发现是如A和础c基因
发生了突变,其中d”c在编码区的26l位碱基由G
变成了T,从而使它获得了降解5.甲基苯噻吩的能
力。使用改进了的RAcHⅡTr技术获得了d镕c在这
个位点所有可能发生突变的氨基酸序列,测试了这
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参考文献:
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