全 文 ：第 １３卷第 ６期
２０１５年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０６􀆰 ００８
收稿日期：２０１５－０３－１１
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢ７１０８００）；国家自然科学基金青年基金（２１４０６１１１）
作者简介：陶惟一（１９９０—），女，江苏南京人，硕士研究生，研究方向：生物化工；李　 霜（联系人），教授，ｌｉｓｈｕａｎｇ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
枯草芽胞杆菌 ＰｎｂＡ酯酶选择性拆分制备 ｌ 薄荷醇
陶惟一，徐　 娴，李　 霜
（南京工业大学 生物与制药工程学院， 江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：利用重组大肠杆菌表达来源于枯草芽胞杆菌 ＣＩＣＣ ２００３４中的 ＰｎｂＡ酯酶，不对称催化水解 ｄｌ 薄荷醇丙酸
酯制备 ｌ 薄荷醇。 考察助溶剂种类、助溶剂添加浓度、温度、催化剂用量、底物浓度以及 ｐＨ 等对反应的影响。 结
果表明：添加 ２５％（体积分数）助溶剂乙醇可显著提升该酯酶对 ｌ 薄荷醇的立体选择性，对映选择率（Ｅ）由 ２􀆰 ４ 提
高到 ９９􀆰 ４３，为不加乙醇条件下的 ４０ 倍。 酶催化最佳条件：２５％乙醇作为助溶剂，反应温度 ３７ ℃，缓冲液为 ０􀆰 １
ｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ８􀆰 ０）并保持 ｐＨ ８􀆰 ０反应条件，底物量 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，反应体系中酶的添加量 ７５０ Ｕ ／ ｍＬ，在此条件
下，酶促反应 ３０ ｍｉｎ后，ｌ 薄荷醇转化率可达 ３４％，产物光学纯度对映体过量值（ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｐ）达 ９５％。
关键词：ＰｎｂＡ酯酶；对映选择率；ｌ 薄荷醇；助溶剂；选择性拆分
中图分类号：ＴＱ０３３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０６－００４３－０６
Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｌ⁃ｍｅｎｔｈｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ｉｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌ⁃ｍｅｎｔｈｏｌ ｂｙ ＰｎｂＡ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＴＡＯ Ｗｅｉｙｉ，ＸＵ Ｘｉａｎ，ＬＩ Ｓｈｕａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ＰｎｂＡ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＣＩＣＣ ２００３４ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｌ⁃ｍｅｎｔｈｏｌ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｌ⁃ｍｅｎｔｈｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ． Ｔｈｅ
ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏ⁃ｓｏｌｖｅｎｔｓ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｐＨ， ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔｉｔｅｒｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｄｏｓａｇｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｅｔｈａｎｏｌ ｗａｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｏ⁃ｓｏｌｖｅｎｔ； ａｄｄｉｎｇ
２５％（Ｖ ／ Ｖ） ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｌ⁃ｍｅｎｔｈｏｌ，ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ
（Ｅ） ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｒｏｍ ２􀆰 ４ ｔｏ ９９􀆰 ４３，ａｂｏｕｔ ４０ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｌ⁃ｍｅｎｔｈｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｌ⁃ｍｅｎｔｈｏｌ ｂｙ ＰｎｂＡ ｗｅｒｅ ２５％（Ｖ ／ Ｖ） ｅｔｈａｎｏｌ，０􀆰 １ ｍｏｌ ／
Ｌ Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ８􀆰 ０）， ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄｌ⁃ｍｅｎｔｈｙｌ ｐｉｏｐｉｏｎａｔｅ，７５０ Ｕ ／ ｍＬ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，３７ ℃
ａｎｄ ｐＨ ８􀆰 ０． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｌ⁃ｍｅｎｔｈｏｌ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｂｏｖｅ ３４％ ａｎｄ
ｔｈｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｐｕｒｉｔｙ ａｂｏｖｅ ９５％ ｉｎ ３０ ｍｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰｎｂＡ ｅｓｔｅｒａｓｅ； ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ； ｌ⁃ｍｅｎｔｈｏｌ； ｃｏ⁃ｓｏｌｖｅｎｔ； ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
　 　 ｌ 薄荷醇是天然薄荷醇的立体构象，具有特
有的薄荷香气和清凉效果，已经广泛应用于食品、
医药和日用品等行业［１］ 。 目前，薄荷醇的生产主
要是天然提取，但受环境、天气等因素影响，天然
薄荷醇质量和产量都难以满足日益增长的消费需
求。 因此，近年来采用脂肪酶或酯酶不对称拆分
制备 ｌ 薄荷醇成为研究热点。 用于拆分制备 ｌ 薄
荷醇的酯酶或脂肪酶的微生物主要有枯草芽胞杆
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） ［２］ 、产碱假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ⁃
ａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ） ［３］ 、洋葱布克氏菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐ⁃
ａｃｉａ） ［１］等。
在拆分反应中，影响酶立体选择性的因素有温
度、ｐＨ、助溶剂种类以及添加量等。 其中，助溶剂对
酶立体选择性的影响较大。 Ｗａｔａｎａｂｅ 等［４］发现在
酶促水解反应中，可以通过添加二甲基亚砜
（ＤＭＳＯ）改变 ２种构型底物的反应初速度来提高对
映选择率。 Ｗｕ 等［５］利用来源 Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ 的脂
肪酶催化酯化反应时发现，添加的乙醇含量可以显
著影响对映选择率以及反应初速度。
但是，目前针对有机溶剂是如何影响酶立体选
择性的机制探究还没有定论。 本文中，笔者重点考
察 ＰｎｂＡ酯酶不对称水解生产 ｌ 薄荷醇反应中各因
素的影响，期望能为进一步探究有机溶剂含量对酶
立体选择性的研究机制打下基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌体培养
利用载体为 ｐＥＴ２２ｂ 重组表达枯草芽胞杆菌
ＰｎｂＡ酯酶（带 Ｈｉｓ Ｔａｇ 标签），宿主为 Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１
（ＤＥ３）。 重组菌以 ２％（体积分数）接种量接入装有
５０ ｍＬ 无菌 ＬＢ培养基的 ２５０ ｍＬ 摇瓶中，加入终质
量浓度 １００ ｍｇ ／ Ｌ 的氨苄青霉素，在 ３７ ℃和 ２００
ｒ ／ ｍｉｎ条件下培养 ２ ｈ后，加入终浓度 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的诱
导剂 ＩＰＴＧ，继续培养 ４ ｈ。
１􀆰 ２　 ＰｎｂＡ酯酶的制备
培养结束后于８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 下离心 １０ ｍｉｎ，收集
菌体，用 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 缓冲液（ｐＨ ７􀆰 ０）洗涤
２ 次 后 重 悬 菌 体， 超 声 波 破 碎 菌 体， 离 心
（８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、４ ℃、１５ ｍｉｎ） 除去细胞碎片，收集上
清液（即粗酶液）。 粗酶液使用镍柱亲和纯化，得到
ＰｎｂＡ酯酶纯酶，用于电泳验证。
１􀆰 ３　 蛋白质含量及酶活力测定
采用考马斯亮蓝法［６］测定蛋白质含量。
以对硝基苯酚丁酸酯 （ ｐ⁃ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ ｂｕｔｙｒａｔｅ，
ｐＮＰＢ）为底物的分光光度法测定反应过程中生成对
硝基苯酚的微摩尔数来确定酯酶活力。 酶活单位
的定义：在 ４０ ℃、ｐＨ ７􀆰 ０条件下，每分钟催化 ｐＮＰＢ
水解生成 １ μｍｏｌ ｐＮＰ 所需的酶量［７］，Ｕ。
１􀆰 ４　 ＰｎｂＡ酯酶不对称水解 ｄｌ 薄荷醇丙酸酯
反应体系（２ ｍＬ）包括：底物 ｄｌ 薄荷醇丙酸酯
（浙江大学杨立荣教授实验室成员合成），０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 缓冲液（ ｐＨ ７􀆰 ０），ＰｎｂＡ 粗酶液，有机溶
剂；于 ３７ ℃下振荡反应一定时间，加入 ２ ｍＬ正己烷
终止反应，并旋涡振荡 ５ ｍｉｎ 萃取产物以及残留底
物，再将获得的有机相用无水 ＭｇＳＯ４干燥后进行气
相色谱分析。 文中所有试验均重复 ３ 次取其平
均值。
气相分析在 ＦＵＬＩＧＣ９７９Ｏ 型气相色谱仪上进行
分析，ＦＩＤ检测器，ＣＰ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ β ２，３，６ Ｍ
１９手性柱（０􀆰 ２５ ｍｍ×０􀆰 ２５ ｍｍ×５０ ｍｍ，β 环糊精，安
捷伦公司）。 柱温 １３０ ℃，总压 ０􀆰 １４ ＭＰａ，空气 ０􀆰 ０３
ＭＰａ，Ｈ２ ０􀆰 １ ＭＰａ，Ｎ２ ０􀆰 ０１ ＭＰａ，进样温度 ２６０ ℃，检
测温度 ２５０ ℃，进样量 ５ μＬ。
底物转化率和产物的对映体过量值的计算见
式（１） ～ （３）。
转化率（Ｃ） ＝ ｅ．ｅ． ｓ ／ （ｅ．ｅ． ｓ ＋ ｅ．ｅ．ｐ） × １００％ （１）
产物光学纯度（ｅ．ｅ．ｐ） ＝
［（Ｃ ｌ － Ｃｄ） ／ （Ｃ ｌ ＋ Ｃｄ） × １００％］ （２）
对映选择率（Ｅ） ＝ ｌｎ［１ － Ｃ（１ ＋ ｅ．ｅ．ｐ）］ ／
ｌｎ［１ Ｃ（１ ｅ．ｅ．ｐ）］ （３）
式中：ｅ．ｅ． ｓ为底物对映体过量值；ｅ．ｅ．ｐ为产物对映体
过量值；Ｃ ｌ为 ｌ 构型对映体的峰面积；Ｃｄ为 ｄ 构型
对映体的峰面积。
１􀆰 ５　 助溶剂乙醇对 ｐｎｂＡ酯酶的影响
考察助溶剂种类、助溶剂浓度对 ＰｎｂＡ 酯酶不
对称水解 ｄｌ 薄荷醇丙酸酯的影响，并在反应体系
中加入不同浓度乙醇，考察 ＰｎｂＡ 酯酶对乙醇的耐
受能力，测量加入乙醇后，在不同时间内 ＰｎｂＡ 酯酶
的活性。
１􀆰 ６　 荧光光谱分析
使用纯化后的 ＰｎｂＡ 酯酶，用 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
ＬＳ５５ 型荧光光谱仪测定不同乙醇浓度下酶的荧光
光谱（λｅｘ ＝ ２８０），测量时扫描范围为 ２６０～４００ ｎｍ。
１􀆰 ７　 反应条件优化
考察助溶剂种类、反应温度、助溶剂浓度、底物
浓度、催化剂用量以及反应体系 ｐＨ 对 ＰｎｂＡ 酯酶
不对称水解 ｄｌ 薄荷醇丙酸酯的影响。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 枯草芽胞杆菌 ＰｎｂＡ酯酶的制备
重组菌 ＰｎｂＡ 粗酶水解 ｐＮＰＢ 体积活力达
４４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
１１０ ０００ Ｕ ／ Ｌ，比酶活为 ４３０ Ｕ ／ ｍｇ，经镍柱亲和纯化
后，比酶活达１ ６６８ Ｕ ／ ｍｇ，纯化 ３􀆰 ９ 倍，回收率 ３２％。
重组菌表达的 ＰｎｂＡ 酯酶及其纯化品进行电泳鉴定
的结果如图 １ 所示，其理论相对分子质量约为 ５􀆰 ６×
１０４。 由图 １可知，泳道 １的 ＰｎｂＡ的相对分子质量与
理论值相符，镍柱亲和纯化 ＰｎｂＡ酯酶达到电泳纯。
Ｍ—标准蛋白；１—重组大肠杆菌诱导后的
全蛋白；２—纯化后的 ＰｎｂＡ酯酶
图 １　 重组 ＰｎｂＡ酯酶的表达与纯化
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｅｓｔｅｒａｓｅ ＰｎｂＡ
２􀆰 ２　 枯草芽胞杆菌 ＰｎｂＡ酯酶的同源性分析
来自枯草芽胞杆菌 ＣＩＣＣ２００３４ 的 ＰｎｂＡ 酯酶
（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＪ９３９２５１􀆰 １）与解淀粉芽胞杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ ｐａｒａ⁃ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ 中未表征的酯酶
（ＧｅｎＢａｎｋ： ＷＰ ＿ ０２１４９５２３５） 一级结构同源性为
９９％，与已表征的 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｃｈａｉｎ Ａ， ＰｎｂＡ酯
酶（ＰＤＢ：１ＱＥ３＿Ａ）的一级结构同源性为 ６３％。
　 　 已报道用于薄荷酯不对称拆分的酯酶 ／脂肪酶
如表 １所示。 与表 １ 中的数据对比可以发现，笔者
所用的 ＰｎｂＡ 酯酶与 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＥＣＵ０５５４ 脂肪
酶（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＳＵ＿３４３９０）同源性最高为 ６４％，与
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｘ１脂肪酶同源性为 ３５％，表
明该 ＰｎｂＡ酯酶具备用于薄荷拆分反应的潜力。
２􀆰 ３　 助溶剂对 ＰｎｂＡ 酯酶水解 ｄｌ 薄荷醇丙酸酯
选择性的影响
　 　 水溶性有机溶剂往往会显著影响酶的立体选择
性和催化活性。 一方面，由于促进了水不溶底物在反
应体系中的分散，从而提高对映选择性和产物的光学
纯度［１１］；另一方面，有机溶剂直接影响酶的构象，改
变酶反应活性通道，从而影响酶的催化性质。 此外，
有机溶剂往往会夺去酶分子表面的水化层，引起酶分
子构象改变，进而影响酶的催化活性。 添加 １０％（体
积分数）的 ＤＭＳＯ、丙酮、乙醇和二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）
等亲水溶剂作为反应体系的助溶剂，２ ｍＬ 反应体系
中含有 ２ ｍＬ助溶剂、２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄｌ 薄荷醇丙酸酯和
５００ Ｕ ／ ｍＬ ＰｎｂＡ粗酶液，３７ ℃、ｐＨ ７􀆰 ０条件下反应 ２
ｈ，结果如图 ２ 所示。 由图 ２ 可知：乙醇和 ＤＭＦ 可以
显著提升 ＰｎｂＡ酯酶水解反应的选择性，产物 ｅ．ｅ．ｐ值
由 ３５􀆰 １增加至 ４７，反应的 Ｅ值也相应增加，且与 ｅ．ｅ．ｐ
值的变化呈正相关。 这可能是由于底物在不同的有
机溶剂中分散系数不同，因此 ｅ．ｅ．ｐ值较高［１２］。 后续
反应选择乙醇作为助溶剂。
表 １　 已表征的不对称水解 ｌ 薄荷酯的酯酶 ／脂肪酶
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌ⁃ｍｅｎｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｏｒ ｅｓｔｅｒａｓｅ ａｓ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ
来源 底物 ｅ．ｅ．ｐ ／ ％ 同源性 文献
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｘ１ ｄｌ 薄荷醇丙酸酯 ＞９９％ ３５％ ［３］
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ⁃Ｍｉｎｕｔａ Ｖａｒ Ｔｅｘｅｎｓｉｓ ｄｌ 薄荷醇琥珀酸酯 ＞９９％ — ［８］
Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ａｎｔｈｒｏｐｉ ｄｌ 薄荷醇乙酸酯 — — ［９］
Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ ｄｌ 薄荷醇苯甲酸酯 ＞９９％ — ［１０］
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ＡＴＣＣ２５４１６ ｄｌ 薄荷醇乙酸酯 ＞９９％ — ［１］
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＥＣＵ０５５４ ｄｌ 薄荷醇乙酸酯 ＞９６％ ６４％ ［２］
２􀆰 ４　 助溶剂乙醇浓度对 ＰｎｂＡ酯酶不对称水解ｄｌ
薄荷醇丙酸酯的影响
　 　 通常低浓度的助溶剂有助于提高酶活力，但当
溶剂浓度增加时往往会对酶有毒害作用［２］。 考察
助溶剂乙醇浓度对 ＰｎｂＡ 酯酶不对称水解 ｄｌ 薄荷
醇丙酸酯的影响，２ ｍＬ反应体系中含有不同浓度乙
醇、２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄｌ 薄荷醇丙酸酯和 ５００ Ｕ ／ ｍＬ ＰｎｂＡ
粗酶液，３７ ℃、ｐＨ ７􀆰 ０条件下反应 ２ ｈ，结果见图 ３。
由图 ３可以看出：随助溶剂乙醇浓度的增加，水
解反应 Ｅ值呈现先增高后降低的趋势，在乙醇添加
５４　 第 ６期 陶惟一等：枯草芽胞杆菌 ＰｎｂＡ酯酶选择性拆分制备 ｌ 薄荷醇
图 ２　 有机溶剂对 ＰｎｂＡ酯酶不对称水解
ｄｌ 薄荷醇丙酸酯的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ
ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｌ⁃ｍｅｎｔｈｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ
ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＰｎｂＡ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ
量为 ２５％时达到最大值 ９９􀆰 ４３，比不加助溶剂条件
下高了近 ４０倍；同样的，反应转化率（Ｃ）也呈现出
先增高再降低的趋势，从 ３２􀆰 ９％到 ４７􀆰 ９５％，但是当
乙醇体积分数大于 ２５％后，转化率出现快速下降。
值得注意的是，产物的光学纯度随着乙醇浓度的增
加而增加，乙醇添加量为 ２５％时，产物的光学纯度
大于 ９５􀆰 ４％，即使乙醇体积分数超过 ２５％，产物的
光学纯度仍未降低。 这表明助溶剂乙醇的最适添
加量为 ２５％（体积分数），该酯酶对 ｌ 薄荷醇酯的选
择性提高了近 ４０倍，实现了从几乎无对映选择性到
对映选择性大于 ９９􀆰 ４３，这一显著的变化引起了笔
者的注意。
Ｗｅｈｂｉ等［１３］证明助溶剂可以通过改变酶活性
部位的极性以及部分构象从而激活磷脂酶。
Ｗａｔａｎａｂｅ等［４］研究了 ＤＭＳＯ 可以引起脂肪酶构象
变化或提高其疏水性。 对此，为了进一步探究乙醇
是如何影响 ＰｎｂＡ酯酶不对称水解 ｄｌ 薄荷醇酯的
机制，就有必要探究乙醇添加量对 ＰｎｂＡ 酯酶耐受
性的影响以及不同添加量条件下该酯酶的荧光光
谱的变化。
２􀆰 ５　 乙醇添加量对 ＰｎｂＡ酯酶耐受性的影响
考察添加不同乙醇浓度对 ＰｎｂＡ 酯酶活性的影
响，结果如图 ４所示。 由图 ４可以看出：将初始酶活
力设定为 １００％， 随着添加乙醇含量的增加，高于
２５％时，该酯酶活力迅速丧失，在添加量为 １５％ ～
２５％时，１０ ｍｉｎ 内酶活力下降至初始酶活的 １ ／ １０，
说明该酯酶对乙醇的耐受性很差，也可以进一步说
明当添加乙醇体积分数高于 ２５％时，不对称水解反
应转化率剧烈下降，与酶的失活密切相关。
图 ３　 助溶剂乙醇浓度对 ＰｎｂＡ酯酶不对称水解
ｄｌ 薄荷醇丙酸酯的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｎ ｔｈｅ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ
ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｌ⁃ｍｅｎｔｈｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ
ＰｎｂＡ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ
图 ４　 乙醇添加量对 ＰｎｂＡ酯酶耐受性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆ ＰｎｂＡ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ
２􀆰 ６　 利用荧光光谱法探究乙醇对 ＰｎｂＡ 酯酶二级
结构的影响
　 　 荧光光谱法是研究蛋白质分子构象的方法之
一，在蛋白质分子中，能发射荧光的氨基酸有色氨
酸（Ｔｒｐ）、酪氨酸（Ｔｙｒ）以及苯丙氨酸（Ｐｈｅ）。 蛋白
质的荧光通常在 ２８０ ｎｍ 或更长的波长被激发，其内
源荧光主要由 Ｔｒｐ 和 Ｔｙｒ 产生。 Ｔｙｒ 荧光光谱最大
发射波长一般位于 ３０３ ｎｍ 处，而 Ｔｒｐ的荧光光谱对
微环境的变化很敏感，其峰位一般在 ３２５ ～ ３５２ ｎｍ
波长之间变动，当蛋白质逐步解折叠，内源色氨酸
相应的逐步暴露于溶剂中，荧光谱不断红移，直至
达到 ３５２ ｎｍ（自由色氨酸在水溶液中的最大发射波
长）。 Ｔｒｐ与 Ｔｙｒ残基作为高度疏水的基团，常常位
于蛋白质分子内部。 而酶分子构象改变时往往会
引起某些疏水集团的暴露，因此，可以通过 Ｔｒｐ 残基
和 Ｔｙｒ残基荧光光谱的动态变化分析蛋白质分子所
处的构象状态。
在 ＰｎｂＡ 酯酶氨基酸序列中，有 ９ 个色氨酸残
６４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
基（２４、４８、１０３、１６９、３６０、３７７、３８３、４３２、４４８），１２ 个
酪氨酸残基 （２９、８５、１１０、１１９、１３７、１５４、３０８、３２６、
３２９、３４３、３７９、４５１）。 因此，可以用色氨酸与酪氨酸
残基发射光谱来检测其二级结构的变化。 图 ５为在
２８０ ｎｍ激发光条件下，ＰｎｂＡ酯酶的荧光光谱图。
图 ５　 ＰｎｂＡ酯酶的荧光光谱
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＰｎｂＡ
图 ６　 温度、酶用量、底物浓度和 ｐＨ对 ＰｎｂＡ酯酶不对称水解 ｄｌ 薄荷醇丙酸酯的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｄｌ⁃ｍｅｎｔｈｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＰｎｂＡ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ
由图 ５ 可知：在此条件下，ＰｎｂＡ酯酶的最大发
射光强在 ３３５ ｎｍ左右处，表明此时主要为色氨酸
残基发出的荧光。 在乙醇体积分数为 ０％ ～ ２５％
时，随乙醇浓度的增加，ＰｎｂＡ 酯酶荧光光强逐渐
增大，在 ２５％乙醇条件下，其最高荧光强度，且最
大发射光波长出现红移现象。 这说明此时酶构象
发生了改变，其色氨酸残基微环境发生改变，使其
所属的微环境亲水性增加，极性增加，蛋白质结构
趋于舒展［１４］ ，这可能是蛋白质结构的舒展，使其活
性中心暴露，从而更加契合 ｌ 构型的薄荷丙酸酯
底物，因此，在增加乙醇体积分数到 ２５％时，催化
生产ｌ 薄荷醇的手性选择性以及转化率都增加。
然后随着乙醇体积分数大于 ２５％，荧光光强逐渐
降低。 从 ＰｎｂＡ酯酶耐受乙醇情况来看，当乙醇体
积分数大于 ２５％时，酶迅速失活，因此可以推断此
时荧光强度的降低是由于酯酶已失活聚集成团。
２􀆰 ７　 ＰｎｂＡ酯酶不对称水解 ｄｌ 薄荷醇丙酸酯
通过考察温度、ｐＨ、酶的用量以及底物浓度等因
素对 ＰｎｂＡ酯酶不对称水解 ｄｌ 薄荷醇丙酸酯的影
响，具体反应条件分别为（ａ）０􀆰 ２ ｍＬ乙醇、２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ｄｌ 薄荷醇丙酸酯、５００ Ｕ ／ ｍＬ ＰｎｂＡ 粗酶、２ ｍＬ 反应
体积、ｐＨ ７􀆰 ０；（ｂ）２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄｌ 薄荷醇丙酸酯、２ ｍＬ
反应体积、３７ ℃、ｐＨ ７􀆰 ０，添加 ２５％乙醇；（ ｃ） ７５０
Ｕ ／ ｍＬ ＰｎｂＡ粗酶、２ ｍＬ 反应体积、３７ ℃、ｐＨ ７􀆰 ０，添
加 ２５％乙醇；（ｄ） ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄｌ 薄荷醇酸酯、７５０
Ｕ ／ ｍＬ ＰｎｂＡ粗酶、２ ｍＬ反应体积、３７ ℃，添加 ２５％乙
醇。 结果如图 ６所示。 由图 ６ 可知：ＰｎｂＡ 酯酶的最
适反应温度为 ３７ ℃，最适 ｐＨ ８􀆰 ０，酶用量 ７５０ Ｕ ／ ｍＬ，
ｄｌ 薄荷醇丙酸酯浓度 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，反应进行 ３０ ｍｉｎ
后，产物 ｌ 薄荷醇达到 ２３􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，转化率达 ３４％，
产物光学纯度 ｅ．ｅ．ｐ＞９５％。
７４　 第 ６期 陶惟一等：枯草芽胞杆菌 ＰｎｂＡ酯酶选择性拆分制备 ｌ 薄荷醇
３　 结论
利用枯草芽胞杆菌 ＣＩＣＣ ２００３４ 中的 ＰｎｂＡ 酯
酶不对称水解 ｄｌ 薄荷醇丙酸酯。 研究发现当不添
加助溶剂乙醇时，该酯酶对 ｄｌ 薄荷醇酯几乎没有
立体选择性；添加 ２５％（体积分数）的助溶剂乙醇，
ＰｎｂＡ酯酶能高效、高立体选择性地催化 ｄｌ 薄荷醇
丙酸酯为 ｌ 薄荷醇，不对称水解反应 Ｅ值增加近 ４０
倍（Ｅ＞９９􀆰 ４３），产物光学纯度 ｅ．ｅ．ｐ＞９５％。
本研究为酶法高效拆分有应用价值的手性醇
以及有机溶剂乙醇影响酶立体选择性提供了一定
的实验依据，初步探究了其二级构象变化。 今后还
需进一步研究乙醇对该酯酶构象的变化，结合分子
模拟手段，更为深入研究其构象变化的机制。
致谢
感谢浙江大学化学工程与生物工程系吴坚平
副教授和陈辉博士对本研究的帮助。
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（责任编辑　 荀志金）
８４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷