全 文 ：微生物法生产!!癸内酯的初步研究
闫淑芳，华栋梁，林 山，王 霞，马翠卿!
（山东大学 微生物技术国家重点实验室，济南 "#$%$$）
摘 要：研究了耶罗威亚酵母（ !"##$%&" &’(）转化蓖麻油生成!!癸内酯的过程。根据菌株的生长特性，确定底物蓖
麻油的最适加入时间；分批培养菌体转化，!!癸内酯产量为 " () * + ,；采用转化液接种进行二次转化，!!癸内酯产量
可提高到 ) ($ * + ,；考察了溶氧条件变化对!!癸内酯积累的影响。
关键词：耶罗威亚酵母；!!癸内酯；生物转化；溶氧
中图分类号：-.%/ 文献标识码：0 文章编号：%12" 3 412.（"$$#）$4 3 $$2) 3 $)
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子结构式如图 % 所示。它具有浓郁的桃香和椰子
图 % !!癸内酯分子结构式
YB* (% G@AKO9A;P &JP9OJ9PK @:!!RKO;A;OJ@
食品添加剂和药品添加剂。因其具有诱人香味和低
香气阈值的特性，在香料工业得到了广泛的应
用［%，"］。!!癸内酯的制取可以通过天然提取、化学合
成、生物技术 4 种方式来实现，天然提取获得的产品
价格昂贵，有关食品添加剂和药品添加剂的规定又
严格限制化学合成产品的使用，因而生物技术方法
生产!!癸内酯越来越受到人们的重视。
目前，利用生物技术生产!!癸内酯普遍采用生物
转化的方法，即利用酵母菌，以蓖麻油中的主要组分
蓖麻油酸（%"!羟基!/!十八碳烯酸，含量在 .$Z以上）
为底物，先经过"!氧化使碳链缩短，再内酯化生成!!
癸内酯，代谢途径如图 " 所示［4］。酵母菌一般选用耶
罗威亚酵母（ !"##$%&" &’ (），假丝酵母（’"()&)" &’ (），
毕赤酵母（*&+,&" &’ (），锁掷胞酵母（ -.$#&)&$/$012 &’ (）
等菌株［)］。其中 !"##$%&" &’ ( 菌株降解蓖麻油，生成
!!癸内酯的能力尤为显著，据文献报道，6BO;9R 等利
! 收稿日期："$$#!$.!%/
基金项目：国家十五科技攻关计划（"$$)[02%4[$/!$#）。
作者简介：闫淑芳（%/2)!），女，硕士研究生，研究方向：生物催化。
联系人：马翠卿，女，教授，QKA：$#%4!..41)$$4
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·2)·
生 物 加 工 过 程
H8B
"$$# 年 . 月
万方数据
用 !"##$%&" !" # 通过两步发酵，获得 $#% & ’ (的最终产
量［%］。目前国内对生物转化法生产!)癸内酯的研究
少，且内酯产量很低，最高为*#+ & ’ (，因此加快加深对
该课题的研究显得尤为迫切。
图 , 生物转化蓖麻油酸生成!)癸内酯
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本文对耶罗威亚酵母（ !"##$%&" !" #）转化蓖麻
油酸生成!)癸内酯进行了研究。主要探讨了底物
加入时间、转化方式及溶氧对过程的影响，为今后的
产业化打下基础。
! 材料和方法
* #* 菌株
耶罗威亚酵母（ !"##$%&" !" #），本实验室保存。
* #, 培养基及培养条件
* #, #* 斜面培养基（质量分数;）
葡萄糖 *，蛋白胨 *，酵母浸膏 + #%，牛肉膏 + #%，
氯化钠 + #%，琼脂粉 * #<，"= 自然。,> ?恒温箱，培
养 * 9。
* #, #, 种子培养基（质量分数;）
葡萄糖 ,，玉米浆 <，磷酸氢二钠 + #,@，硫酸镁
+ #*,，吐温 A B+ + #C，"= < #%。%++ D(三角瓶装 %+ D(
培养基，,> ?，培养 * 9，摇床转速为 ,++ 5 ’ D.2。
* #, #C 发酵培养基（;）
葡萄糖 ,，玉米浆 <，磷酸氢二钠 + #,@，硫酸镁
+ #*,，吐温 A B+ + #C，"= < #%。%++ D(三角瓶装 %+ D(
培养基，,> ?，摇床转速为 ,++ 5 ’ D.2。
* #C 实验方法
* #C #* 葡萄糖浓度的测定
发酵液中葡萄糖浓度的测定采用葡萄糖氧化酶
酶电极（E/F)%G型生物传感器）。
* #C #, 分批生物转化法
菌株培养一定时间后加底物蓖麻油，,> ?转
化，间隔一定时间取样，定量检测!)癸内酯的产生，
摇床转速控制为 ,++ 5 ’ D.2。
* #C #C 转化液接种二次转化法
以上一次转化所得转化液 *+ D( 为种子，接入
新的发酵培养液中，同时加入 @;的蓖麻油，检测!)
癸内酯的生成。
* #C #@ 溶氧对产物生成的影响
三组 %++ D( 三角瓶中菌体培养结束后，加入
@;蓖麻油，分别置于不同转速的摇床上进行转化，
定时取样检测!)癸内酯浓度。
* #@ 底物与产物的检测方法
以乙酸丁酯为萃取剂，体积比 * H * 室温萃取
*% D.2。使用 I85.82 JK)CCB+ 气相色谱仪测定!)癸
内酯和蓖麻油。EK/)% 毛细管柱，-LG 检测器。程序
升温，*@+ ? 保留 , D.2，以 B ? ’ D.2 速度升至
,++ ?，再以 *% ? ’ D.2 的速度升至 ,%+ ?。质谱采
用 I85.82 E8:M52,+++，G/)% 柱（C+ D N + #,% DD N
+ #,%"D）。
" 结果与讨论
, #* 蓖麻油转化产物的确定
图 C 为耶罗威亚酵母转化蓖麻油的产物通过
OJ)PE 联用检测得到 PE 图谱，与标准物图库中对
比可确定该物质即是!)癸内酯。
, #, 菌株生长曲线
耶罗威亚酵母（ !"##$%&" !" #）在发酵培养基中
的生长曲线如图 @ 所示，*+ Q 之前菌体生长处于延
迟期，菌体生长缓慢，*+ Q 后开始进入指数生长期，
菌体质量浓度快速增长，伴随着葡萄糖消耗完全，
C+ Q后菌体生长进入稳定期。
,++% 年 B 月 闫淑芳等：微生物法生产!)癸内酯的初步研究 ·>%·
万方数据
图 ! !"癸内酯的质谱图
#$% &! ’()) )*+,-./0 12!"3+,(4(,-15+
—!—!"3+,(4(,-15+；—"—6+)$30+ 74/,1)+
图 8 葡萄糖残量与!"癸留酯产生的关系
#$% &8 6+4(-$15)9$* :+-;++5 .+)$3/+ ,15-+5- 12 %4/,1)+ (53 <$+43 12
!"3+,(4(,-15+
= &! 蓖麻油添加时间
发酵初期菌体以葡萄糖为唯一碳源，丰富的种
子培养基有利于菌体的快速生长，由图 8 可知在接
种 !> 9 后，葡萄糖基本消耗完全，蓖麻油加入诱导
产生了相关代谢的酶类，加快了蓖麻油的分解代谢，
内酯的生成。故选定在指数生长后期到稳定期之间
（=? @ !A 9），加入底物蓖麻油转化 8B 9，检测!"癸内
酯的生成。结果如图 C 所示，培养时间 !! 9 时加入
蓖麻油，!"癸内酯的产量最高，最终确定 !! 9为蓖麻
油的最适加入时间。
= &8 补料生物转化的效果
分别采用分批及转化液接种的方法进行转化实
验。结果如图 D 所示，分批转化实验中，随着蓖麻油
的不断降低，内酯质量浓度逐渐提高，最终质量浓度
为 = &8 % E F。
以此时转化液为种子补加发酵培养基，进行转
化实验，从图 D 可以看出底物蓖麻油的消耗速率、!"
癸内酯的生成速度都高于单批次转化过程，最终质
量浓度可达到 8 &> % E F。这是因为转化蓖麻油相关
的酶是诱导酶，与单批次转化相比，该过程菌体内部
已存在相关代谢的酶，省去了诱导所需的时间，故底
物的消耗速率和产物的生成速率都快。另菌体对产
物及底物的适应能力有了较大提高，且可以继续利
用蓖麻油经生物转化积累大量产物，最终产量达到
8 &> % E F。
图 C 底物加入时间对!"癸内酯积累的影响
#$% &C G22+,- 12 )/:)-.(-+ (33$5% -$0+ 15 3+,(4(,-15+ *.13/,-$15
转化液补料转化与单批次转化相比，产量提高
了 D?H。可见发酵液接种转化为!"癸内酯产量提
高提供了新的途径。但是同时存在转化后期，由于
内酯浓度高、毒性大，大量菌体死亡，无法多次补料
转化，因此如何及时将产物从转化液中分离，减少其
对菌体的毒性是需要解决的问题。
·?D· 生物加工过程 第 ! 卷第 ! 期
万方数据
—!—!!"#$%&%$’()#；—"—*#+,"-# .&/$(+#
图 0 补料生物转化蓖麻油酸的实验
1,2 30 4,($()5#6+,() (7 6,$,)(&#,$ %$," 8,’9 7#" :%’$9 -("#
; 3< 溶氧对!!癸内酯生成的影响
为研究溶氧对产物!!癸内酯生成的影响，将三
角瓶分成 = 组，分别以 >?的接种量转接发酵培养
基，;@ A培养 == 9，加入 >?蓖麻油，转速 ;BB 6 C -,)
转化 ;> 9 后：第 D 组摇床转速保持 ;BB 6 C -,)，第 ;
组置于 ;转速摇床，继续转化，分别取样检测!!癸内酯浓度，
结果如图 @ 所示。
—!—;图 @ 溶氧对!!内酯积累的影响
1,2 3@ E77#$’ (7 ",++(&5#" (FG2#) ()!!"#$%&%$’()# H6("/$’,()
!!癸内酯的生成随时间呈规律性变化，从底物
加入开始，蓖麻油酸在菌体作用下不断降解内酯化，
!!癸内酯的含量逐步提高，此时内酯的生成速度大
于降解速度，当内酯积累达到一定程度后，由于溶液
毒性增大，菌体大量减少，生成速度减慢，代谢速度
相对增大，内酯含量呈下降趋势［0］。
研究发现溶氧条件对!!癸内酯的积累影响较
大，通过改变发酵过程中溶氧的条件可以显著提高
!!癸内酯的产量，实验结果如图 @ 所示。发现，发酵
初期一定的溶氧速度利于底物的吸收及代谢的进
行，而当代谢进行到一定阶段后，较高的溶氧反而会
抑制内酯的生成，低的溶氧仍使内酯生成呈上升趋
势。
研究还发现，发酵过程一直保持较高的溶氧，则
会显著积累一种物质，推测为 0!羟基!=!十二碳烯酸
（初步已经检测到，但还未最终完全确定）。根据生
物转化的代谢途径我们推测，发酵后期高的溶氧会
促进"!氧化的进行，限制双键的代谢，使 0!羟基!=!
十二碳烯酸大量积累，阻碍了 0!羟基!=!十二碳烯酸
向!!癸内酯的转化，从而降低了内酯的生成速度，
同时高的溶氧也提高了内酯的代谢速度，最终造成
!!癸内酯含量的减少。
! 结论
对 !"##$%&" +H 3 生物转化蓖麻油生成!!癸内酯
的发酵过程进行了研究。培养菌体时，在葡萄糖消
耗完毕后再加入蓖麻油有利于底物的吸收与利用。
以上一次发酵液为种子做二次转化，提高了菌体对
底物及产物毒性的适应能力，!!癸内酯最终质量浓
度达到 > 3B 2 C I。溶氧条件显著影响了产物的积
累，中间物 0!羟基!=!十二碳烯酸的出现解释了发酵
后期，提高转速不利于向!!癸内酯的转化。以上实
验结果为生物转化!!癸内酯的进一步研究提供了
参考，此外，如何减小产物对菌体的毒性，增加转化
次数，将是生物转化合成!!癸内酯研究的方向之
一。
参考文献：
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