全 文 :第7卷第5期
2009年9月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.7No.5
Sep.2009
doi:10.3969/j.issn.1762-3678.2009.05.002
收稿日期:2008-06-13
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20576055);国家高技术研究发展计划(863计划)探索导向基金资助项目(2006AA02Z207)
作者简介:张洪涛(1979—),男,河南洛阳人,博士研究生,研究方向:微生物多糖的发酵法生产与功能开发;詹晓北(联系人),教授,Email:
xbzhan@jiangnan.edu.cn
热凝胶的高产策略及功能研究进展
张洪涛,詹晓北,郑志永,陈定强
(江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122)
摘 要:热凝胶(curdlan)又名β(1→3) D 葡聚糖,在食品、医药、保健品等领域具有重要的应用潜力。由粪产碱
杆菌(Alcaligenesfaecalis)或土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)生物合成的热凝胶以成本低廉、提取与纯化技术成熟而成
为研究热点。笔者主要针对提高热凝胶产量的菌株改造和发酵控制策略以及热凝胶生物活性的研究进展和相关
专利进行综述。
关键词:热凝胶;由粪产碱杆菌;生物活性;功能
中图分类号:Q815 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2009)05-0008-05
AdvancesincurdlanofproductionbyAlcaligenesfaecalis
andfunctionofcurdlan
ZHANGHongtao,ZHANXiaobei,ZHENGZhiyong,CHENDingqiang
(TheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnologyMinistryofEducation,SchoolofBiotechnology,
JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Abstract:Curdlanisanimportantcommercialyvaluablemicrobialpolysaccharide.Itwaspreparedby
fermentationwithAlcaligenesfaecalisorAgrobacteriumsp.Thebreedingofcurdlanoverproducingstrains,
theoptimalstrategiesforcontrolingthefermentationprocessandthefunctionalityofcurdlanfromAlcali
genesfaecaliswerereviewed.
Keywords:curdlan;Alcaligenesfaecalis;fermentation;function
热凝胶多糖主要通过粪产碱杆菌(在1991年
被鉴定为土壤杆菌属)和土壤杆菌发酵获得,其分
子大约由450个葡萄糖单体通过 β (1→3)糖苷键
聚合而成,不溶于水和乙醇,但溶于025mol/L的碱
性溶液和二甲基亚砜溶液。热凝胶多糖有着广泛
的应用价值,可作为食品固凝剂、化妆品保湿增香
剂、高温增塑剂等。近年来,亦有文献报道将其进
行化学修饰后用于抗艾滋病病毒的备选用药[1-2]。
在微生物多糖热凝胶的研究领域,前期的研究
主要集中在通过基因工程途径改造和筛选高产菌
株、优化培养基、添加辅助因子、优化发酵条件及设
备等策略来提高微生物多糖的产量。随着发酵法
生产热凝胶工艺的逐渐成熟,热凝胶的生物活性拓
展、靶向给药、热凝胶、热凝胶缀合物的合成及其活
性研究等正逐渐成为新的研究热点。Ritu等[3]对来
自不同国家、地区的7组科研团队在糖组学或功能
糖组学的研究进行了专题报道。由于无论是原核
细胞,还是真核细胞,它们生命活动均离不开糖 蛋
白的相互识别作用[4-6],因此研究糖在生物体内的
功能有着极其重要的意义。功能糖组学已成为继
基因组学、蛋白质组学之后生命科学与生物技术
领域最活跃、最前沿的研究领域之一。而糖功能
组学和药学的结合,将探索出药物研究的新途径
与新方法,必将成为未来各国激烈争夺的生命科
学研究的制高点。与其他来源的多糖相比,微生
物多糖由于具有成本低、易获取的优点,已引起研
究者的广泛重视,并逐渐成为糖功能组学研究的
热点之一。
本文对微生物多糖———热凝胶以及其衍生物
的生物活性及功能进行综述,并对提高其生产强度
及产率的相关研究策略进行了介绍。
1 实现热凝胶高产率的策略与途径
影响热凝胶产率的因素是多方面的,发酵法生
产热凝胶高产率的实现主要通过以下途径来进行。
11 发酵条件、过程控制与反应器
热凝胶是由粪产碱杆菌在限制 N源条件下进
行生物合成得到的。由于细菌生长期与产胶过程
是非耦联的,因此可采用两阶段发酵方法来提高产
量。其产量主要取决于2个因素:①菌体生物质量;
②产胶期细胞形成热凝胶的能力。发酵条件对热
凝胶的形成影响见表1。
表1 发酵条件对热凝胶产量的影响
Table1 Theefectoffermentationconditionsoncurdlanproduction
生产菌株 发酵条件 热凝胶生产强度 文献
Agropbacteriumspecies P的质量浓度为05g/L 13g/(L·d) [7]
Alcaligenesfaecalis 补入尿嘧啶核苷 139g/(L·d) [8]
Alcaligenesfaecalis pH反馈控制,生长期 102g/(L·d) [9]
pH70,产胶期维持在56
Alcaligenesfaecalis 补入嘌呤 产量提高17倍 [10]
Agropbacteriumspecies 搅拌速度600r/min 129g/(L·d) [11]
粪产碱杆菌和土壤杆菌均是好氧发酵,但是在深层
发酵条件下,由于合成的多糖包裹在菌体的周围从而限
制了O2的传递。通过提高转速来提高发酵液中的溶解
氧,虽然有助于产量的提高[12-13],但增加了能耗,降低了
产品的相对分子质量。针对溶解氧限制的问题,通过设
计不同结构和型式的生物反应器来提高热凝胶产量的
研究见文献[14-15],如表2所示。研究表明,在搅拌效
果相近的情况下,单个轴向流搅拌桨由于更节能而优于
径向流搅拌桨;如果采用气泡分布器进行通气则可以提
高气泡的分散和传质,反应器底部采用轴向流搅拌桨要
远胜于径向流搅拌桨,圆底反应器优于平底反应器。这
些理论的获得为高效生物反应器的设计奠定了基础。
目前,江南大学的詹晓北等[16-18]针对微生物多糖的高黏
度发酵特征,正在从反应器结构、通气方式和搅拌桨结构
和流型组合等角度进行高黏度多糖发酵的新型生物反
应器的设计与开发。
表2 桨型与反应器对热凝胶产率的影响
Table2 Theefectoffermentorconfiguration,impelersandaeratingstyleoncurdlanyield
桨型组合 反应器类型 通气方式 通气量/vvm
转速/
(r·min-1)
转化率/
(mg·g-1·h-1)
三档直叶涡轮桨 平底反应器 通过轴底部通气 03 600 110
三档直叶涡轮桨 平底反应器 气泡分布器通气 10 500 107
底部直叶涡轮桨+上部船用桨 平底反应器 通过轴底部通气 03 700 54
底部直叶涡轮桨+上部船用桨 平底反应器 气泡分布器通气 038 500 45
底部船用桨 圆底反应器 气泡分布器通气 03 500 102
底部螺旋浆 圆底反应器 气泡分布器通气 03 500 90
9 第5期 张洪涛等:热凝胶的高产策略及功能研究进展
12 选育高产菌株
发酵法生产热凝胶时,菌种的优劣成为影响产
量的关键因素之一,因此,选育优良菌株成为提高
凝胶产率的重要途径。目前,在热凝胶领域,优良
菌种的选育主要通过以下途径来进行。
121 通过传统的诱变选育高产菌株
最初筛选的热凝胶生产菌株———粪产碱杆菌
10C3(Alcaligenesfaecalisvar.myxogenes10C3),其发
酵产物中含有两种多糖:90%的热凝胶与10%的琥
珀酰葡聚糖。日本TakedaChemicalIndustriesLtd公
司以粪产碱杆菌10C3为出发菌株,通过筛选自发
突变株获得一个不产生琥珀酸多糖的菌株10C3K。
韩国Kim等[19]通过使用 N 甲基 N′硝基 N 亚
硝基胍来诱导 Agrobacteriumsp.得到一株高产突变
株,产品质量浓度达到644g/L。高产菌株初筛方
法主要是基于苯胺蓝与热凝胶形成蓝色复合物的
现象来进行。
122 通过基因工程途径获得高产菌株
通过基因工程手段来对粪产碱杆菌进行改造
以获得高产菌株的研究是另外一条获得高产菌株
的途径,该研究主要是在基于提高合成热凝胶的葡
萄糖代谢流和菌体细胞呼吸链的整体效率的理论
基础上进行。
1)代谢途径改造 早在1977年,Sutherland[20]
就已经开展了热凝胶的合成以及代谢途径的研究
工作。但是,到目前为止,对细菌中热凝胶生物合
成的分子遗传学仍然知之甚少。Zheng等[21]研究
了粪产碱杆菌的热凝胶的合成以及代谢途径,并对
其最大理论产值进行计算,推测热凝胶的理论产值
远高于实际产值。这表明,粪产碱杆菌发酵法生产
热凝胶的产值仍有较大的提高空间。对粪产碱杆
菌进行更深入的代谢通量及遗传学研究,将为热凝
胶的合成开辟新的道路。
2)呼吸链改造 由于热凝胶多糖不溶于水,发
酵过程中形成的细小凝胶包裹于细菌表面,使得热
凝胶合成中后期时氧传质阻力大大增强,从而削弱
了热凝胶的持续合成。研究表明,热凝胶的合成与
胞内的ATP、UMP水平成正相关,而 ATP主要通过
呼吸链实现再生,氧传质的受阻将严重抑制 ATP的
再生,同时将造成热凝胶合成的代谢途径受阻。
微生物的电子呼吸链往往具有分支结构,不同
支路的产能效率有很大差异。图1是粪产碱杆菌的
电子呼吸链,存在着3条支路[22-23]。如果对粪产碱
杆菌呼吸链中不同支链的能量效率开展研究,去除
低效呼吸链的相关基因,将可能使得呼吸链整体产
能效率得以提高,有利于微生物多糖的合成。
图1 产碱杆菌的电子呼吸链
Fig.1 TheproposedrespirationchainofAlcaligenesfaecalis
2 热凝胶的特性和应用
21 热凝胶物理、化学特性的应用
美国、中国和日本等国家现都已批准热凝胶作
为生物增稠剂和胶凝剂应用于食品领域[24]。不同
强度热凝胶的形成主要取决于加热的温度、热处理
时间和热凝胶质量浓度。由于热凝胶具有强度高、
热成型后不可逆的特性,因而广泛应用于定型食
品,如通心粉以及挂面等;同时,由于人的消化道内
没有可以消化热凝胶的酶,热凝胶又被应用于开发
新的低能量减肥食品;由于热凝胶具有胶凝的功
能,因此可用于为咀嚼或吞咽有困难的人开发出一
种新的流质食品。
应用于医药中的胶囊,主要由动物胶组成,然
而,这些来自于动物的胶抗热效果很差,在灭菌过
程中将会把包含的物质释放出来。热凝胶正好具
01 生 物 加 工 过 程 第7卷
有一次成型后不再变形的优点,同时由于热凝胶可
以形成非蛋白热抗性的胶囊,这就使得热凝胶可以
用作包裹任何产品的胶囊。Ono等[26]成功开发出
用热凝胶包裹具有热抗性和稳定性的胶囊。随后,
Kamaguchi等[27]开发出了完全由热凝胶组成的
胶囊。
热凝胶还可以用于生产不透水膜。例如将由
热凝胶做成的不透水的膜包裹在肉的表面来保持
肉的新鲜[28]。热凝胶用碱溶解并喷洒在肉的表面,
然后通过热处理使得其形成不再具有热恢复能力
的薄膜。
22 热凝胶生物活性及其应用
热凝胶除了具有物理化学特征而被应用于以
上领域以外,还具有潜在的医学和药理学的应用价
值,热凝胶分子具有增强免疫力[29]和抗癌的效
果[30],并且能提高人体抗击癌症[31]、细菌和病毒
(AIDS)的能力[32]。用 β 葡聚糖医治病人,目前,
静脉注射和腹腔注射的治疗方式均已进行,主要问
题是不溶的以及难溶解 β 葡聚糖造成了明显的不
利影响,因此,今后在疾病治疗领域,采用口服的形
式应该成为优先使用的方式。
23 热凝胶的衍生化及其应用
热凝胶的生物活性与其结构紧密相关。虽然
热凝胶已经表现出了良好的生物活性,但对其进行
修饰后,其生物的活性能力明显增强。最初的修饰
是通过使用热凝胶水解酶使多糖水解为寡糖来提
高多糖的生物活性[33]。另外一种修饰方法是通过
化学修饰方法来实现,比如硫酸化。硫酸化后的多
糖具有抗氧化、抗凝血、抗血栓,抑制艾滋病病毒等
生物活性,此外,多糖的硫酸化衍生物与衍生前相
比,不仅生物活性得到提高,而且溶解于水的能力
也大大提高[34],尤其是由于多糖的硫酸化而使得链
的空间结构与组成均发生改变,从而进一步导致热
凝胶衍生物的生物活性发生变化[35]。通过化学的
方法对多糖进行修饰为获得新的药物提供了可
能[36]。此外,将葡聚糖的衍生物应用于塑料工业,
可明显提高塑料的品质[37]。
3 展 望
由于热凝胶等微生物多糖具有免疫调节、抗病
毒、抗癌症的功效,通过生物工程手段对产多糖微
生物的代谢途径进行改造(使得每条糖链都包含有
多种生物活性糖成分),使这些基因工程菌株能够
合成新的高效广谱抗病毒、抗细菌的多糖,这无疑
是今后糖工程的重点研究方向之一。
伴随着对热凝胶的研究,新的功能将会不断发
现,应用领域也将更为广泛。通过热凝胶的化学修
饰,尤其是热凝胶硫酸化的成功预示着多糖应用时
代的来临,而通过化学修饰方法来改变、提高热凝
胶的功能及生物活性也将成为热凝胶功能开发的
主流方向。
因微生物多糖适合产业化、规模化生产并且生
产成本相对低廉,因此,通过对多糖基因工程菌株
的发酵法生产与生物化工修饰相结合的方法来获
得高效、具有广谱抗病毒、病菌的多糖药物或保健
药物,一旦成功,必将产生巨大的经济效益和社会
效益。
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