全 文 ：第 １３卷第 ６期
２０１５年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０６􀆰 ０１０
收稿日期：２０１５－０３－１９
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１３ＣＢ７３３９０１）；江苏省高校优势学科建设工程
作者简介：管　 钊（１９８９—），男，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：生物工程；姜　 岷（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｍｉｎ＠ ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
进化代谢选育高浓度 ＮＨ＋４ 耐受型产丁二酸大肠杆菌
管　 钊，吴明科，陈吴方，陈美丽，马江锋，姜　 岷
（南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 ２１０００９）
摘　 要：利用大肠杆菌厌氧制备丁二酸过程中，采用氨水作为 ｐＨ调节剂不仅可以中和酸性产物还可提供无机氮，
被菌体利用，然而高浓度 ＮＨ＋４的积累会抑制菌体生长及代谢产酸的能力。 为增强大肠杆菌对高浓度 ＮＨ
＋
４的耐受
性，以（ＮＨ４） ２ＨＰＯ４为 ＮＨ
＋
４供体，通过在连续培养装置中不断提高（ＮＨ４） ２ＨＰＯ４浓度，以获得可耐受 ０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ
ＮＨ＋４的产丁二酸大肠杆菌。 结果表明：突变株在 ０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ
＋
４胁迫下，摇瓶厌氧发酵 ７２ ｈ，细胞干质量浓度
（ＤＣＷ）可达 １􀆰 ８２ ｇ ／ Ｌ，丁二酸产量为 １１􀆰 ７２ ｇ ／ Ｌ，分别比出发菌株提高了 １􀆰 ６和 ４􀆰 ６倍。 进一步地，在 ５ Ｌ发酵罐上
考察其利用氨水调节 ｐＨ 生产丁二酸的能力，厌氧发酵 ９０ ｈ，丁二酸质量浓度达到 ２７􀆰 ３２ ｇ ／ Ｌ，生产强度为 ０􀆰 ３０
ｇ ／ （Ｌ·ｈ），比出发菌株分别提高 ８８􀆰 １％和 ８７􀆰 ５％。
关键词：进化代谢；耐铵；丁二酸；大肠杆菌
中图分类号：ＴＱ９２１　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０６－００５５－０６
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ⁃ｔｏｌｅｒａｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ
ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ
ＧＵＡＮ Ｚｈａｏ，ＷＵ Ｍｉｎｇｋｅ，ＣＨＥＮ Ｗｕｆａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｍｅｉｌｉ，ＭＡ Ｊｉａｎｇｆｅｎｇ，ＪＩＡＮＧ Ｍｉｎ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ａｍｍｏｎｉａ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ａｓ ｐＨ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒ， ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｃｏｕｌｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｕｔ ａｌｓｏ ａｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ． Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｈｉｇｈ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＨ＋４ ｗｏｕｌｄ ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ．Ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ
ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｏｗａｒｄｓ ｈｉｇｈ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＮＨ＋４， ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｍｍｏｎｉｕｍ⁃ｔｏｌｅｒａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＨ＋４ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｆｒｏｍ
（ＮＨ４） ２ＨＰＯ４ ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ａ ｍｕｔａｎｔ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｔ ０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ
＋
４ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｗｈｅｎ ｕｎｄｅｒ ０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ＋４ ｉｎ ｆｌａｓｋ，ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｒｅａｃｈｅｄ １􀆰 ８２ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｄ １１􀆰 ７２ ｇ ／ Ｌ ｗｉｔｈｉｎ ７２ ｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ １􀆰 ６⁃ ａｎｄ ４􀆰 ６⁃ｆｏｌｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ
ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｕｓｉｎｇ ａｍｍｏｎｉａ ａｓ ｐＨ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｆｏｒ
ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ａ ５⁃Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ．Ａｆｔｅｒ ９０ ｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｃｈｅｄ ２７􀆰 ３２ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ ０􀆰 ３０ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ８８􀆰 １％ ａｎｄ
８７􀆰 ５％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ； ａｍｍｏｎｉｕｍ⁃ｔｏｌｅｒａｎｔ； ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ； Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
　 　 丁二酸（琥珀酸）作为一种重要的 Ｃ４ 平台化合
物，是制备可降解生物材料的主要原料，被广泛应
用于食品、农业、医药等行业，具有广阔的市场前
景［１］。 目前，丁二酸的生产方法主要有化学合成和
生物合成法。 与化学合成法相比，生物合成法具有
对环境污染小、反应条件温和、能耗低等优点，因此
受到越来越多研究人员的关注［２－３］。 丁二酸生产的
优 良 菌 株 主 要 有 产 琥 珀 酸 厌 氧 螺 菌
（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ） ［４］、产琥珀酸
放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ） ［５］、产琥珀酸
曼氏杆菌（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ） ［６］及大肠
杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ［７］，其中大肠杆菌由于其遗传
背景清晰和营养成分需求简单等特点，已成为研究
的热点。
丁二酸是二元羧酸，发酵过程中大量积累会酸
化发酵培养基，因此需不断添加碱调节剂维持中性
的发酵环境。 常用的碱中和剂主要有钠盐、镁盐和
氨水等［８］。 相比于其他碱中和剂，利用氨水调节 ｐＨ
具有碱消耗量少、副产物单一、下游产物分离提取
简单等优点［９］。 此外，发酵液中的 ＮＨ＋４还可作为氮
源被大肠杆菌吸收利用［１０］，减少整个发酵过程中氮
源的供给。 然而，胞外高浓度 ＮＨ＋４会抑制菌株生长
及代谢。 黄静等［１１］报道，在大肠杆菌Ｅ． ｃｏｌｉ ＴＲＴＨ
发酵生产 Ｌ 色氨酸中，当发酵液中 ＮＨ＋４浓度达到
１２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ时，发酵液中丙酮酸、乳酸及乙酸浓度
有所增加，细胞质粒稳定性下降，导致菌体生长提
前结束，耗糖速率降低，色氨酸合成受阻。 Ｌｅｂｒｉｈｉ
等［１２］研究发现，大环内酯类抗生素生物合成亦受到
ＮＨ＋４浓度影响，５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＮＨ
＋
４浓度即可显著抑制
合成前体酸的酶系统，造成大环合成所需要的前体
酸供应不足，从而影响大环内酯类抗生素的生物合
成。 因此，为实现大肠杆菌利用氨水调节生产丁二
酸，需提高其对高浓度 ＮＨ＋４的耐受能力。
进化代谢是一种适应性进化的方式［１３］，在驯化
过程中，由于细菌具有传代速度快、数量大等优点，
因此适应新环境的细菌能够获得生长优势，从而在
新环境下生存，而不能适应新环境的菌体，由于生
长速度慢，很快被优势菌体所淘汰［１４－１５］。 此方法目
前主要适用于下面两个方面的菌种选育，一是筛选
能够抵抗某种物质或产物压力的抗逆菌株，如改善
大肠杆菌在丁二酸生产中 Ｎａ＋的抑制［１６］。 二是筛
选能快速利用一些廉价生物质的菌株，如改善菌株
对生物质的利用效率［１７］。
笔者以大肠杆菌 ＢＥＲ２０８ 为出发菌株，其在专
一性厌氧条件下，比大肠杆菌 ＡＦＰ１１１ 具有更快的
生长速率和更高的葡萄糖代谢能力。 采用适应性
进化的方法，以（ＮＨ４） ２ＨＰＯ４为筛选压力，通过逐渐
增加培养基中 ＮＨ＋４浓度，以得到高浓度 ＮＨ
＋
４耐受型
丁二酸生产菌株。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株
大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＥＲ２０８，由笔者所在实
验室成员自主筛选并保存，其保藏编号为 ＣＣＴＣＣ
Ｍ ２０１２３５１。
１􀆰 ２　 培养基
种子培养基（ ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０，酵母粉 ５，ＮａＣｌ
５，卡那霉素 ０􀆰 ０３，氯霉素 ０􀆰 ０２５。
筛选平板培养基（ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０，酵母粉 ５，
ＮａＣｌ ５，卡那霉素 ０􀆰 ０３，氯霉素 ０􀆰 ０２５，琼脂 ２０。 加入
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４调节 ＮＨ
＋
４终浓度为 ０􀆰 １２ ～ ０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ，
用 ＮａＯＨ调节 ｐＨ ６􀆰 ６～６􀆰 ８。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：一水合柠檬酸 ３􀆰 ０，Ｎａ２ＨＰＯ４·
７Ｈ２Ｏ ３􀆰 ０，ＫＨ２ＰＯ４ ８􀆰 ０，ＮＨ４Ｃｌ ０􀆰 ２，（ＮＨ４）２ＳＯ４０􀆰 ７５，
ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ １􀆰 ０，ＣａＣｌ２·２Ｈ２ Ｏ ０􀆰 ０１，ＣｏＣｌ２·６Ｈ２ Ｏ
０􀆰 ００１ ７５，ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０００ ５，ＣｕＣｌ２·２Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０００ ２５
ｍｇ ／ Ｌ，Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０００ ５，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００２ ５
ｍｇ ／ Ｌ，Ｈ３ＢＯ３ ０􀆰 ０００ １２，Ａｌ２（ＳＯ４）３·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００１ ７７，Ｆｅ
（ＩＩＩ）ｃｉｔｒａｔｅ ０􀆰 ０１６ １，ＶＢ１０􀆰 ０２，生物素 ０􀆰 ００２，卡那霉素
０􀆰 ０３，氯霉素 ０􀆰 ０２５。 １２１ ℃高压灭菌 １５ ｍｉｎ。
厌氧摇瓶发酵培养基：３０ ｍＬ发酵培养基，添加
１６ ｇ ／ Ｌ碱式 ＭｇＣＯ３，３０ ｇ ／ Ｌ葡萄糖。
１􀆰 ３　 培养方法
１）种子培养　 从保存在－８０ ℃冻存管中的菌株
中，按 １％的接种量接入装液量为 ５ ｍＬ 的试管中，
３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ过夜培养，作为一级种子。 将试管
中的一级种子，以 １％的接种量转接到装液量为 １００
ｍＬ的 ５００ ｍＬ 三角瓶中，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 ６ ｈ，
作为二级种子。
２）厌氧摇瓶发酵 　 将二级种子按照 １０％的接
种量接入到装有 ３０ ｍＬ 发酵培养基的血清瓶中，通
入无菌 ＣＯ２ ２ ｍｉｎ以维持厌氧环境，３７ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ
培养 ７２ ｈ。
３）发酵罐培养　 采用发酵培养基，在 ５ Ｌ 发酵
罐中进行，装液量为 ２ Ｌ，接种量为 １０％。 通入
１００％无菌过滤 ＣＯ２进行厌氧发酵，通气量为 ０􀆰 １
６５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
ｖｖｍ（每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值），
温度 ３７ ℃，搅拌转速 １５０ ｒ ／ ｍｉｎ，用 ５０％氨水控制
ｐＨ为 ６􀆰 ６。
４）突变株的筛选 　 将进化代谢装置中出现的
突变株进行无菌取样，然后在不同 ＮＨ＋４浓度的筛选
平板上涂布，放入厌氧培养箱中培养，选出菌落饱
满的单菌落，并进行多次传代培养，将生长迅速，生
长性能稳定的菌株进行厌氧摇瓶发酵，３７ ℃、２００
ｒ ／ ｍｉｎ培养 ７２ ｈ，ＨＰＬＣ检测各菌株发酵性能。
１􀆰 ４　 分析检测
１）葡萄糖的测定　 利用 ＳＢＡ２４０Ｃ型生物传感分
析仪（山东省科学院生物研究所）测定葡萄糖。
２）菌体密度测定　 Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｐ ７５２Ｓ 型紫外 可
见分光光度计（上海棱光技术有限公司），在波长 ６００
ｎｍ处测定吸光值。 细胞干质量浓度（ＤＣＷ）的计算
是 １０ ｍＬ的发酵液，１０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，蒸馏水
洗涤菌体 ２次，烘干至恒质量后称质量。 每个 ＯＤ６００
相当于 ０􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ ＤＣＷ。
３）发酵液中有机酸的测定 　 高效液相色谱法
（ＨＰＬＣ）检测，色谱分析仪为美国 Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ
３０００ 系列；色谱柱为 Ｐｒｅｖａｉｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄ，流动相
为 ２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ ２􀆰 ５，流速 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，
紫外检测波长 ２１５ ｎｍ；进样量 ２０ μＬ，控制柱温为
２５ ℃。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ＮＨ＋４ 浓度对 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＥＲ２０８ 产丁二酸的影响
采用厌氧血清瓶发酵，考察不同浓度 ＮＨ＋４对
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＥＲ２０８ 生长和发酵性能的影响，结果见图
１。 由图 １ 可知，当 ＮＨ＋４从 ０ 逐渐增加到 ０􀆰 ０３
ｍｏｌ ／ Ｌ时，菌株的生长和产酸性能不断提高，当
ＮＨ＋４浓度达到 ０􀆰 ０３ ｍｏｌ ／ Ｌ时，菌株 ＤＣＷ 和丁二酸
产量达到最高，此时 ＤＣＷ 为 １􀆰 ４９ ｇ ／ Ｌ，丁二酸产
量为 ２１􀆰 ３２ ｇ ／ Ｌ。 随着 ＮＨ＋４浓度的继续增加，菌株
的生长和产酸开始受到抑制。 当 ＮＨ＋４浓度达到
０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ 时，菌体 ＤＣＷ 和丁二酸产量分别为
０􀆰 ３６ ｇ ／ Ｌ和 ２􀆰 ５６ ｇ ／ Ｌ，与 ０􀆰 ０３ ｍｏｌ ／ Ｌ 的浓度下相
比，分别降低了 ７５􀆰 ８％和 ８８􀆰 ０％。 这结果说明，低
浓度的 ＮＨ＋４可以为菌体的生长提供氮源，从而有
利于菌体的生长。 而高浓度 ＮＨ＋４对 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＥＲ２０８
生长和产酸造成了抑制。 因此需提高菌体对 ＮＨ＋４
的耐受能力。
图 １　 ＮＨ＋４浓度对菌株 ＢＥＲ２０８生长和产酸性能的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＮＨ＋４ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ
ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＥＲ２０８
２􀆰 ２　 进化代谢选育耐铵型产丁二酸大肠杆菌突变株
进化代谢育种系统是一个连续培养装置，通过
不断补加含有高浓度 ＮＨ＋４的发酵培养基并逐步提
高 ＮＨ＋４的浓度筛选高浓度 ＮＨ
＋
４耐受型生产菌株，结
图 ２　 进化代谢连续培养过程
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ
果见图 ２。 菌体在 ０􀆰 １２ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ＋４胁迫下，丁二酸浓
度比 ０􀆰 ０３ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ＋４下低，抑制程度明显（图 １），故
以 ０􀆰 １２ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＮＨ＋４为筛选初始浓度。 由图 ２ 可
知：培养基中添加 ０􀆰 １２ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＮＨ＋４为初始筛选浓
度，经过不断的连续培养，在 ６５０ ｈ 时，菌体密度和耗
糖都达到最大，表明在此浓度下，菌体产生突变体，适
７５　 第 ６期 管　 钊等：进化代谢选育高浓度 ＮＨ＋４耐受型产丁二酸大肠杆菌
应当前培养基中的 ＮＨ＋４浓度，从而维持正常的生长状
况，此时培养基中的 ＮＨ＋４筛选浓度达到 ０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ。
从反应器中进行无菌取样，涂布在含有不同浓度 ＮＨ＋４
培养基的筛选平板上进行多次传代培养。 根据菌体
的生长速度和菌落的直径，筛选出 ５ 株菌株，进行血
清瓶厌氧发酵，结果见表 １。
表 １　 突变株与出发菌株产酸效果对比
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ
ｇ·Ｌ－１
菌株 ρ（ＤＣＷ） ρ（丁二酸） ρ（乙酸） ρ（丙酮酸） ρ（糖耗）
ＢＥＲ２０８ １􀆰 １４ ２􀆰 ５６ ０􀆰 ５１ ０􀆰 ９２ ８
ＢＥＲ５２８ １􀆰 ８２ １１􀆰 ７２ ２􀆰 ６９ ７􀆰 ３７ ２８
ＢＥＲ２２８ １􀆰 ２６ ６􀆰 ２７ １􀆰 ３２ ３􀆰 ６５ １７
ＢＥＲ００８ ２􀆰 ２８ １０􀆰 ７３ ０􀆰 ４８ ７􀆰 ７９ ２６
ＢＥＲ６０３ １􀆰 ７４ ８􀆰 ９７ ２􀆰 ９７ ８􀆰 ２７ ２６
ＢＥＲ５２４ １􀆰 ４９ ７􀆰 ５３ １􀆰 ６２ ３􀆰 ７７ １８
　 　 由表 １可知：在 ＮＨ＋４浓度为 ０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ的条件
下，出发菌株 ＢＥＲ２０８ 的生长明显受到抑制，ＤＣＷ
为 １􀆰 １４ ｇ ／ Ｌ，丁二酸的产量低下，仅为 ２􀆰 ５６ ｇ ／ Ｌ。 而
经适应性进化筛选的突变株，生长和发酵性能均明
显优于出发菌株。 其中突变株 ＢＥＲ５２８ 的 ＤＣＷ 可
达到 １􀆰 ８２ ｇ ／ Ｌ，丁二酸产量为 １１􀆰 ７２ ｇ ／ Ｌ，比出发菌
株分别提高了 １􀆰 ６０ 倍和 ４􀆰 ５８ 倍。 然而，所有突变
株代谢产物中均出现了丙酮酸积累，其中突变株
ＢＥＲ５２８的丙酮酸产量达到 ７􀆰 ３７ ｇ ／ Ｌ，是出发菌株
的 ８倍，可能原因为高浓度 ＮＨ＋４存在下，菌体通过代
谢产物分布变化提高胞内 ＡＴＰ 的供给水平，协助菌
株对抗 ＮＨ＋４胁迫。 由大肠杆菌葡萄糖代谢可知，１
分子磷酸烯醇式丙酮酸（ＰＥＰ）转化为 １ 分子丙酮酸
过程生成 １分子 ＡＴＰ，而大肠杆菌厌氧代谢过程中，
ＰＥＰ 转化为草酰乙酸主要由磷酸烯醇式丙酮酸羧化
酶（ＰＰＣ）催化，其过程中无 ＡＴＰ 的生成，故 １ 分子
ＰＥＰ 转化生成 １ 分子丁二酸过程中没有 ＡＴＰ 的生
成［１８］。 因此，菌体通过改变代谢流分布生成丙酮酸，
为菌体提供更多的能量供给，提高了菌体在高浓度
ＮＨ＋４胁迫下的耐受性能。
２􀆰 ３　 突变株 ＢＥＲ５２８传代稳定性的研究
考察突变株 ＢＥＲ５２８ 的遗传稳定性，将突变株
在平板上反复划线纯化，连续传代 ３０ 次，每隔 ５ 次
在添加了 ０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ＋４的血清瓶中厌氧发酵 ７２
ｈ，结果如图 ３ 所示。 由图 ３ 可知，突变株 ＢＥＲ５２８
具有比较稳定的生长和产酸遗传特性，可以用于进
一步的研究。
图 ３　 突变株 ＢＥＲ５２８遗传稳定性试验
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ＢＥＲ５２８ ｄｕｒｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
２􀆰 ４　 突变株和出发菌株在不同浓度的 ＮＨ＋４条件下
发酵产酸效果
　 　 进一步考察突变菌株 ＢＥＲ５２８ 和出发菌株
ＢＥＲ２０８在不同 ＮＨ＋４浓度下的发酵水平，结果如图 ４
所示。 由图 ４可知：对于出发菌株 ＢＥＲ２０８，在 ＮＨ＋４
浓度为 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ 时，丁二酸产量最高 （ １３􀆰 ２４
ｇ ／ Ｌ）。 当 ＮＨ＋４浓度上升至 ０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ 时，丁二酸产
量迅速降低为 ５􀆰 ６３ ｇ ／ Ｌ。 这表明 ０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ＋４已
对菌体造成较大的伤害。 随着 ＮＨ＋４浓度的继续上
升，丁二酸产量继续下降，但下降趋势变缓，在 ０􀆰 ５
ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ＋４浓度下，丁二酸质量浓度为 ２􀆰 ５６ ｇ ／ Ｌ，比
在 ０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ浓度下的结果下降了 ５４􀆰 ５％。 而突变
菌株 ＢＥＲ５２８ 对 ＮＨ＋４的耐受能力明显增强，在 ０􀆰 ２
ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ＋４浓度下，菌株丁二酸为 １３􀆰 ６６ ｇ ／ Ｌ，比出
发菌株提高了 ２􀆰 ４ 倍。 随着 ＮＨ＋４浓度的增加，突变
８５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
菌株丁二酸产量虽不断下降，但下降趋势较缓，进
一步表明该突变菌株在高浓度 ＮＨ＋４胁迫下的抗逆
性能有所提高。
图 ４　 ＮＨ＋４浓度对突变株 ＢＥＲ５２８和出发菌株
ＢＥＲ２０８产丁二酸生产性能的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＮＨ＋４ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｕｃｃｉｎｉｃ
ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＢＥＲ５２８ ａｎｄ ＢＥＲ２０８
２􀆰 ５　 氨水调节对菌株生长及产酸的影响
根据血清瓶厌氧摇瓶发酵的结果，采用氨水为
ｐＨ调节剂，考察菌株在 ５ Ｌ发酵罐中一步厌氧发酵
性能。 出发菌株 ＢＥＲ２０８ 和突变菌株 ＢＥＲ５２８ 发酵
结果分别如图 ５ 和图 ６ 所示。 由图 ５ 和图 ６ 可知：
出发菌株 ＢＥＲ２０８在 ６０ ｈ 处耗糖速率减慢，虽然生
物量并没有太大的变化，但菌株积累丁二酸开始变
得缓慢。 经计算，此时发酵液中的 ＮＨ＋４浓度为 ０􀆰 ２１
ｍｏｌ ／ Ｌ，已经达到出发菌株的 ＮＨ＋４耐受极限。 经 ９０ ｈ
发酵后，丁二酸终质量浓度达到 １４􀆰 ５２ ｇ ／ Ｌ。 而突变
菌 ＢＥＲ５２８生长及产酸性能明显优于出发菌株。 其
中发酵至 ６０ ｈ 时，菌株耗糖能力未出现明显下降，
计算得到此时发酵液中的 ＮＨ＋４浓度为 ０􀆰 ３５ ｍｏｌ ／ Ｌ，
低于菌株 ＮＨ＋４耐受极限 ０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ。 继续发酵至
９０ ｈ终止时，相关指标结果见表 ２。 由表 ２ 可知，突
　 　 　 　
变株 ＢＥＲ５２８丁二酸的产量为 ２７􀆰 ３２ ｇ ／ Ｌ，生产速率
为 ０􀆰 ３０ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），而出发菌株 ＢＥＲ２０８丁二酸产量为
１４􀆰 ５２ ｇ ／ Ｌ，生产速率为 ０􀆰 １６ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 这结果表明，
突变株 ＢＥＲ５２８的丁二酸产量和生产强度分别比出
发菌株提高 ８８􀆰 ２％和 ８７􀆰 ５％。 可见，经适应性驯化选
育所得菌株具备了利用氨水调节合成丁二酸的能力。
图 ５　 出发菌株 ＢＥＲ２０８生长及产酸结果
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｂｙ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＥＲ２０８
图 ６　 突变株 ＢＥＲ５２８生长及产酸结果
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｂｙ Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＥＲ５２８
表 ２　 出发菌株 ＢＥＲ２０８与突变株 ＢＥＲ５２８厌氧发酵产丁二酸结果对比
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＢＥＲ２０８ ａｎｄ ＢＥＲ５２８ ｄｕｒｉｎｇ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
菌株 ρ（丁二酸） ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（乙酸）
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（丙酮酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
丁二酸生产强度 ／
（ｇ·Ｌ－１·ｈ－１）
ＢＥＲ２０８ １４􀆰 ５２ １􀆰 ７４ ２􀆰 ４５ ０􀆰 １６
ＢＥＲ５２８ ２７􀆰 ３２ ４􀆰 ８３ ８􀆰 ０８ ０􀆰 ３０
３　 结论
１）利用适应性进化的方法，筛选得到 １ 株能够
耐受 ０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ＋４的一步厌氧高产丁二酸大肠
杆菌 Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＥＲ５２８。 经多次传代培养，其生长和产
酸能力稳定，可用于进一步研究。
２）突变株 ＢＥＲ５２８在添加 ０􀆰 ５３ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮＨ＋４的摇
瓶中厌氧发酵 ７２ ｈ，ＤＣＷ 达到 １􀆰 ８２ ｇ ／ Ｌ，丁二酸产
量为 １１􀆰 ７２ ｇ ／ Ｌ，生长能力和丁二酸合成能力分别是
出发菌株的 １􀆰 ６和 ４􀆰 ６倍。
９５　 第 ６期 管　 钊等：进化代谢选育高浓度 ＮＨ＋４耐受型产丁二酸大肠杆菌
３） 在 ５ Ｌ 发酵罐中进一步地考察突变株
ＢＥＲ５２８利用氨水调节 ｐＨ 发酵性能，厌氧发酵 ９０
ｈ，ＤＣＷ为 １􀆰 ２２ ｇ ／ Ｌ，丁二酸产量达到 ２７􀆰 ３２ ｇ ／ Ｌ，丁
二酸的生产速率为 ０􀆰 ３０ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 丁二酸产量和
生产速率分别比出发菌株提高 ８８􀆰 ２％和 ８７􀆰 ５％。
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（责任编辑　 荀志金）
０６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷