全 文 ：第 １３卷第 ４期
２０１５年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０４􀆰 ００６
收稿日期：２０１４－０７－２９
基金项目：海洋公益性行业研究专项 （２０１２０５０２０）
作者简介：李　 凯（１９８８—），男，山东聊城人，硕士研究生，研究方向：生物多糖；林学政（联系人），研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｎｘｚ＠ ｆｉｏ．ｏｒｇ．ｃｎ
南极细菌 Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ３ ３ １ ２产胞外
多糖条件优化
李　 凯１，２，杜宗军２，林学政１
（１． 国家海洋局 第一海洋研究所，海洋生物活性物质重点实验室，山东 青岛 ２６６０６１；
２． 山东大学（威海），海洋学院，山东 威海 ２６４２０９）
摘　 要：利用单因子试验和响应面法对南极细菌 Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ􀆰 ３ ３ １ ２ 产胞外多糖条件进行了优化。
通过单因子试验确定菌株 ３ ３ １ ２产胞外多糖的最佳碳源和氮源分别为蔗糖和 ＫＮＯ３，其最佳添加量分别为 ４０
ｇ ／ Ｌ和 １０ ｇ ／ Ｌ；最适培养温度为 １５􀆰 ０ ℃；最佳培养基盐度和初始 ｐＨ分别为 ４􀆰 ５％和 ９；并确定了对产糖有显著影响
的单因素———碳源（蔗糖）、氮源（ＫＮＯ３）和温度。 通过 Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ进行试验设计和 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ 响应面软件
分析，得到了菌株 ３ ３ １ ２产胞外多糖发酵条件的优化条件：蔗糖 ４３􀆰 １ ｇ ／ Ｌ、ＫＮＯ３ ９􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ和温度 １７􀆰 ２ ℃。 在
此优化条件下，菌株 ３ ３ １ ２发酵液的粗胞外多糖产量可达 ３􀆰 ０３ ｇ ／ Ｌ。
关键词：南极细菌；胞外多糖；响应面；Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ；条件优化
中图分类号：　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０４－００２９－０７
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔａｒｃｔｉｃ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ􀆰 ３⁃３⁃１⁃２
ＬＩ Ｋａｉ１，２， ＤＵ Ｚｏｎｇｊｕｎ２， ＬＩＮ Ｘｕｅｚｈｅｎｇ１
（１． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，Ｆｉｒｓｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ，Ｓｔａｔｅ Ｏｃｅａｎｉｃ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，
Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０６１，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｍａｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｗｅｉｈａｉ），Ｗｅｉｈａｉ ２６４２０９， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ （ＥＰＳ） ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ
Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ􀆰 ３⁃３⁃１⁃２ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ
ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｗｅｒｅ ｓｕｃｒｏｓｅ （４０ ｇ ／ Ｌ） ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ （１０ ｇ ／ Ｌ）， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ
ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｓａｌｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ｍｅｄｉａ ｗｅｒｅ １５ ℃，４􀆰 ５％ ａｎｄ ９，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｂｙ ｔｈｅ Ｂｏｘ⁃
Ｂｅｈｎｋｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｄｅｓｉｇｎ⁃Ｅｘｐｅｒｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｕｒｆａｃｅ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ＥＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ３⁃３⁃１⁃２ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ：
ｓｕｃｒｏｓｅ，４３􀆰 １ ｇ ／ Ｌ， ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ ９􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ １７􀆰 ２ ℃ ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ＥＰＳ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ３⁃３⁃１⁃２ ｗａｓ ｒｅａｃｈｅｄ ３􀆰 ０３ ｇ ／ Ｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ； ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ； Ｂｏｘ⁃Ｂｅｈｎｋｅｎ ｄｅｓｉｇｎ； ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ
ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
　 　 生物活性多糖因其具有调节生物体生理功能和 增强免疫力的作用而成为国内外的科学研究热点，其
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中极端环境细菌产生的胞外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，
ＥＰＳ）更是引起了人们广泛的关注［１－２］。 南极地区有
着光照辐射变化极大、海水含盐度高、南极海域常年
水温极低和光照时间呈季节性等独特的地理及气候
特征［３］，造就了独特的南极微生物生态系统。 南极海
冰中存在着大量的微生物及其产生的 ＥＰＳ，这些 ＥＰＳ
在南极海冰这一极端环境中的能源传输和细胞保护
等方面中起着重要作用［４］。
由于南极微生物产生的 ＥＰＳ 成分十分复杂且
含量都不高，这造成了对某种特定微生物的 ＥＰＳ 进
行研究和应用的困难，因此在实验室条件下对南极
微生物进行产 ＥＰＳ的条件优化，对于发现和研究南
极微生物活性 ＥＰＳ 均有着重要的意义［５］。 微生物
的 ＥＰＳ产量受到各种因素的影响，包括氮源、碳源、
盐度和装液量等；同时，随着渗透压和温度等物理
条件的改变， ＥＰＳ 产量也会改变［４］。 南极细菌
Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ３ ３ １ ２ 分离于南极普里
兹湾海域水样，经 １６Ｓ ｒＲＮＡ 分子鉴定属于假交替
单胞菌［６］，其产生的 ＥＰＳ 对大菱鲆的非特异性免
疫［６］，显著或极显著地提高黄盖鲽免疫器官（脾脏
和后肠）的淋巴细胞增殖和呼吸爆发活性；并对脾
脏、肝脏和后肠的 ＡＣＰ 活力和 Ｔ ＳＯＤ 活力均有着
明显的提高作用（尚未发表）。
响应面法是先利用合理的试验设计得出一定
的实验数据，再采用多元二次回归方程拟合因素与
响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析得
到预测模型，解决多元变量对实验结果影响的问
题［７］。 本文中笔者拟通过单因素试验、 Ｂｏｘ
Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计和 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ响应面分析等，
对南极细菌 Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ３ ３ １ ２ 产
ＥＰＳ条件进行优化，以期为活性 ＥＰＳ 的进一步研究
及其应用奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 试验材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种
南极细菌 Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ􀆰 ３ ３ １ ２ 由
国家海洋局第一海洋研究所海洋生物活性物质重
点实验室菌种库保存并提供。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
种子培养基为 Ｚｏｂｅｌｌ ２２１６Ｅ培养基：酵母膏 １􀆰 ０
ｇ ／ Ｌ，蛋白胨 ５􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ，Ｖ（过滤陈海水）：Ｖ（自来水）＝
２ ∶ １。 挑取经活化的菌株 ３ ３ １ ２ 单菌落，接入
５０ ｍＬ （１００ ｍＬ锥形瓶）液体种子培养基中，低温摇
床振荡培养 ７２ ｈ （１５０ ｒ ／ ｍｉｎ、１０ ℃），制成种子液。
１􀆰 ２　 试验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 测定方法
生物量测定：将菌液进行适当稀释，用 ７２２分光
光度计于 ６００ ｎｍ 处测定吸光度 ＯＤ６００，以未接菌的
培养基稀释相同倍数作空白对照。
ＥＰＳ测定：取 １ ｍＬ菌液于 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５
ｍｉｎ后，取 ０􀆰 ５ ｍＬ 上清液加入 ３ 倍体积的 ９５％乙
醇，于 ４ ℃自然沉降 ４ ｈ，再次 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５
ｍｉｎ后去上清液，沉淀物在室温条件下静置晾干后
加入 １ ｍＬ蒸馏水溶解，即为粗 ＥＰＳ 溶液；取适量该
溶液用苯酚—硫酸法［７］测定其 ＥＰＳ 含量，以未接菌
的培养基进行相同处理后做空白对照。
１􀆰 ２􀆰 ２　 碳源对南极细菌 ３ ３ １ ２生长和 ＥＰＳ产
量的影响
选择稀释 １０ 倍的 Ｚｏｂｅｌｌ ２２１６ Ｅ 培养基作为基
础培养基，以减少蛋白胨和酵母粉中碳源和氮源对
菌株利用外加碳源和氮源的影响。 分别在基础发
酵培养基中加入 １０􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ的果糖、蔗糖、麦芽糖、葡
萄糖、乳糖和可溶性淀粉，按接种量 １％接种种子
液，低温摇床振荡培养 ５ ｄ （１５０ ｒ ／ ｍｉｎ、１０ ℃），研究
不同碳源对菌株生长和 ＥＰＳ 产量的影响；确定最佳
碳源后，调整其添加量 （ １０、 ２０、 ３０、 ４０、 ５０ 和 ６０
ｇ ／ Ｌ），以确定最佳添加量。
１􀆰 ２􀆰 ３　 氮源对南极细菌 ３ ３ １ ２生长和 ＥＰＳ产
量的影响
选择稀释 １０ 倍的 Ｚｏｂｅｌｌ ２２１６ Ｅ 培养基作为基
础培养基，以 １０􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ 蔗糖为碳源，分别加入 １０􀆰 ０
ｇ ／ Ｌ的蛋白胨、（ＮＨ４） ２ＳＯ４、尿素、酵母浸膏、ＫＮＯ３、
酵母粉、ＮＨ４ＮＯ３和牛肉浸膏为氮源，按接种量 １％
接种种子液，低温摇床振荡培养 ５ ｄ （１５０ ｒ ／ ｍｉｎ、１０
℃），研究不同氮源对菌株生长和 ＥＰＳ 产量的影响；
确定最佳氮源后，调整其添加量（５􀆰 ０、１０􀆰 ０、１５􀆰 ０、
２０􀆰 ０、２５􀆰 ０和 ３０􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ），以确定最佳添加量。
１􀆰 ２􀆰 ４　 培养基盐度对南极细菌 ３ ３ １ ２ 生长和
ＥＰＳ产量的影响
以蒸馏水替代 Ｚｏｂｅｌｌ ２２１６ Ｅ 培养基中的过滤
陈海水和自来水，往其中添加不同量的 ＮａＣｌ，调整
其盐度分别为 １􀆰 ５％、３􀆰 ０％、４􀆰 ５％、６􀆰 ０％和 ９􀆰 ０％。
按 １％接种量接入种子液，低温摇床振荡培养 ５ ｄ
（１５０ ｒ ／ ｍｉｎ、１０ ℃），研究培养基盐度对菌株生长和
ＥＰＳ产量的影响。
０３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
１􀆰 ２􀆰 ５　 培养温度对南极细菌生长和 ＥＰＳ 产量的
影响
按 １％接种量接种种子液于 Ｚｏｂｅｌｌ ２２１６ Ｅ 培养
基中，分别在 ５、１０、１５ 和 ２０ ℃摇床振荡培养 ５ ｄ
（１５０ ｒ ／ ｍｉｎ），研究温度对菌株生长和 ＥＰＳ 产量的
影响。
１􀆰 ２􀆰 ６　 培养基初始 ｐＨ 对南极细菌 ３ ３ １ ２ 生
长和 ＥＰＳ产量的影响
用 ０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＨＣｌ 或 ＮａＯＨ 溶液调整 Ｚｏｂｅｌｌ
２２１６ Ｅ培养基的初始 ｐＨ 分别为 ５、６、７、８、９ 和 １０，
按 １％接种量接入种子液，低温摇床振荡培养 ５ ｄ
（１５０ ｒ ／ ｍｉｎ、１０ ℃），研究培养基初始 ｐＨ 对菌株生
长和 ＥＰＳ产量的影响。
１􀆰 ２􀆰 ７　 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ响应面试验及分析
根据单因素试验结果选择出影响菌株 ３ ３
１ ２产 ＥＰＳ 的主要因素，采用 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ 响应
面软件进行 Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面设计，以发酵液中
的产糖量为响应值，并对试验结果进行回归分析，
从而获得南极细菌 Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ３ ３ １
２产 ＥＰＳ的最佳条件。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 单因素试验结果
２􀆰 １􀆰 １　 碳源对南极细菌 ３ ３ １ ２生长和 ＥＰＳ产
量的影响结果
图 １　 不同碳源对菌株 ３ ３ １ ２生长和 ＥＰＳ产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ＥＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ３⁃３⁃１⁃２
考察碳源对菌株 ３ ３ １ ２ 的生长和 ＥＰＳ产
量的影响，结果见图 １。 由图 １ 可知：尽管在对照
培养基 Ｚｏｂｅｌｌ ２２１６ Ｅ 中菌株 ３ ３ １ ２ 的生长最
好，但其 ＥＰＳ产量却很低，表明菌体生物量的增加
并没有促进 ＥＰＳ相应的积累。 当在基础培养基中
添加葡萄糖或蔗糖为碳源时，菌株 ３ ３ １ ２ 的
菌体生物量虽然较低，但均提高了菌株 ＥＰＳ 产量；
尤其以蔗糖作为碳源时，其 ＥＰＳ 产量是对照培养
基 Ｚｏｂｅｌｌ ２２１６Ｅ 的 １７􀆰 ７５ 倍，极大地提高了菌体的
ＥＰＳ产量。 以淀粉为碳源时，其发酵液 ＥＰＳ 产量
未检测出，这可能与本实验 ＥＰＳ 含量测定时，以未
接菌的相同培养基作对照，而淀粉自身即为多糖
物质，菌体生长所消耗的多糖可能多于自身所产
ＥＰＳ所致。
２􀆰 １􀆰 ２　 蔗糖初始添加量的确定
考察蔗糖添加量对菌株 ３ ３ １ ２ 的生长和
ＥＰＳ产量的影响，结果见图 ２。 由图 ２ 可知：随着蔗
糖添加量的增加，菌体的生物量和 ＥＰＳ 产量都逐渐
增加；当蔗糖添加量在 ４０ ｇ ／ Ｌ 时，菌体生物量和
ＥＰＳ 产量最高；之后都随着蔗糖添加量的增加反而
有不同程度的降低，其中 ＥＰＳ 产量的下降幅度比生
物量更明显。 因此，确定最佳的蔗糖添加量为 ４０
ｇ ／ Ｌ。
图 ２　 蔗糖初始添加量对菌株 ３ ３ １ ２生长
和 ＥＰＳ产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｕｃｒｏｓｅ ａｄｄｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ ｏｎ ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ＥＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ３⁃３⁃１⁃２
碳源不仅为细菌生长提供碳素，而且碳源亦为
菌体提供能量。 不同的碳源可以明显影响微生物
的代谢过程，由于酶系统的差异，不同微生物对碳
源的利用情况也有所不同［８］。 不同碳源对 ＥＰＳ 的
产量和糖分子的大小会造成不同程度的影响［９－１０］，
如 Ｇｒｏｂｂｅｎ等［１０］将菌株 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ 分别
以果糖和葡萄糖作为碳源来培养，得到 ２ 种不同的
ＥＰＳ产物。 Ｃｈｅｎ 等［１１］研究发现，不同碳源对细菌
次级代谢产物的产量有明显的影响。 本试验结果
表明，菌株 ３ ３ １ ２ 生长所需的最佳碳源与产
ＥＰＳ所需的最佳碳源并不一致，蔗糖作为碳源时，菌
株 ３ ３ １ ２ 菌体生物量并不高，但 ＥＰＳ 产量最
高，这与 Ｇａｎｃｅｌ 等［８］ 研究结果相似，而与 Ｙｕａｎ
等［１２］研究结果（ＥＰＳ产量 ０􀆰 ９ ｇ ／ Ｌ）有所不同。
１３　 第 ４期 李　 凯等：南极细菌 Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．３ ３ １ ２产胞外多糖条件优化
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
２􀆰 １􀆰 ３　 氮源对南极细菌 ３ ３ １ ２生长和 ＥＰＳ产
量的影响
考察氮源对菌株 ３ ３ １ ２ 的生长和 ＥＰＳ产
量的影响，结果见图 ３。 由图 ３ 可知：以蛋白胨和
牛肉浸膏作为氮源时，菌体生物量均高于对照培
养基———Ｚｏｂｅｌｌ ２２１６ Ｅ 培养基，但其 ＥＰＳ 产量却
低于对照培养基；而以 ＫＮＯ３为氮源时，虽然菌体
生物量低于对照培养基，但是其 ＥＰＳ 产量却是对
照培养基中的 ９􀆰 ５ 倍，同时在尿素、酵母浸膏和酵
母粉作为氮源时，ＥＰＳ 产量分别约是对照培养基
的 ４ 倍、４ 倍和 ３ 倍。 由此可见，ＫＮＯ３是菌株产
ＥＰＳ的最佳氮源。
图 ３　 不同氮源对菌株 ３ ３ １ ２ 生长和 ＥＰＳ产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ＥＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ３⁃３⁃１⁃２
２􀆰 １􀆰 ４　 ＫＮＯ３初始添加量的确定
图 ４　 ＫＮＯ３初始添加量对菌株 ３ ３ １ ２ 生长
和 ＥＰＳ产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ ａｄｄｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ ｏｎ
ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ＥＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ３⁃３⁃１⁃２
考察 ＫＮＯ３的初始添加量对菌株 ３ ３ １ ２的
生长和 ＥＰＳ产量的影响，结果见图 ４。 由图 ４ 可知：
随着培养基中 ＫＮＯ３添加量的增加，菌体生物量逐
渐降低，说明过高浓度的 ＫＮＯ３不利于菌体的生长；
而菌体的 ＥＰＳ 产量呈先增加后减少的趋势，当
ＫＮＯ３添加量在 １０􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ 时，ＥＰＳ 产量最高，之后随
添加量的增加，ＥＰＳ 产量反而降低。 因此，ＫＮＯ３的
最佳添加量为 １０􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ。
氮源是组成蛋白质和核酸的必要元素之一。
有机氮源可以为菌体提供某些无机氮源无法合成
的氨基酸，而无机氮源可以更快地被微生物吸收利
用［１３］。 本试验结果表明，ＫＮＯ３作为氮源时，虽然菌
体生物量较低，但 ＥＰＳ 产量最高，这与李信等［１４］对
蛹虫草菌 ＥＰＳ的发酵工艺优化研究结果类似。
２􀆰 １􀆰 ５　 培养基盐度对南极细菌生长和 ＥＰＳ 产量的
影响结果
考察培养基盐度对菌株 ３ ３ １ ２ 生长和
ＥＰＳ产量的影响，结果见图 ５。 由图 ５ 可以看出：菌
株 ３ ３ １ ２ 在不同盐度（０ ～ ９􀆰 ０％）下均可生长
和产生 ＥＰＳ。 较低盐度（０～３􀆰 ０％）时，培养液中，菌
体生物量和 ＥＰＳ产量随着盐度的升高逐渐增加；在
较高盐度（３􀆰 ０％ ～ ９􀆰 ０％）培养液的菌体生物量和
ＥＰＳ产量相差不大，在盐度为 ４􀆰 ５％时，菌株 ３ ３
１ ２的 ＥＰＳ产量最高。
盐度主要影响细菌渗透压的调节［１５］。 本试验
结果表明，较高盐度（３􀆰 ０％～９􀆰 ０％）下，菌株 ３ ３ １
２ ＥＰＳ的产量比较低盐度（０～３􀆰 ０％）有所提高，这
与李江［５］研究发现高盐能促进南极细菌 Ｓ １５ １３
ＥＰＳ的积累相似。
图 ５　 不同盐度对菌株 ３ ３ １ ２生长和
ＥＰＳ产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｌｉｎｉｔｙ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ
ＥＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ３⁃３⁃１⁃２
２􀆰 １􀆰 ６　 培养温度对南极细菌 ３ ３ １ ２ 生长和
ＥＰＳ产量的影响结果
考察培养温度对菌株 ３ ３ １ ２ 生长和 ＥＰＳ
产量的影响，结果见图 ６。 由图 ６ 可知：温度对菌株
生长和 ＥＰＳ 产生有着不同的影响趋势。 菌体生物
量随着培养温度的升高而逐渐降低，可见低温有利
２３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
于菌体生物量的积累；ＥＰＳ 产量随着培养温度的升
高逐渐增加，在 １５􀆰 ０ ℃时，ＥＰＳ产量最高，之后又有
所降低。
培养温度对 ＥＰＳ 产量的影响主要体现在对菌
体生长的影响上，适当的温度可以提高菌体内各种
酶活性，提高新陈代谢的速度，从而提高 ＥＰＳ 的产
量。 培养温度过低会影响细菌的生长速度，不利于
ＥＰＳ 的合成与积累；而温度过高一方面使得部分酶
活性变低，另一方面菌体新陈代谢过快，培养基营
养物质消耗过度，大大降低 ＥＰＳ 前体物质的含
量［１６］，从而减少了 ＥＰＳ 的产生与积累。 本试验中
菌株 ３ ３ １ ２的最适生长温度和 ＥＰＳ 产量最高
时的培养温度不同，可能是因为激活 ＥＰＳ 合成系统
所需要酶的最适温度与其最适生长温度不同引起
的［８］。 结果表明，菌株 ３ ３ １ ２ 在 １５􀆰 ０ ℃培养
条件下的 ＥＰＳ 产量比低温条件下（５􀆰 ０ ℃和 １０􀆰 ０
℃）高，这与 Ｍａｎｃｕｓｏ 等［１７］ 研究发现南极细菌
ＣＡＭ０２５在 １０􀆰 ０ ℃时的 ＥＰＳ 含量比高温条件下
（２０􀆰 ０ 和 ３０􀆰 ０ ℃）高 ３０ 倍以上的研究结果有所
不同。
图 ６　 温度对菌株 ３ ３ １ ２ 生长和 ＥＰＳ产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ＥＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ３⁃３⁃１⁃２
２􀆰 １􀆰 ７　 培养基初始 ｐＨ 对南极细菌 ３ ３ １ ２ 生
长和 ＥＰＳ产量的影响结果
考察培养基初始 ｐＨ对菌株 ３ ３ １ ２生长和
ＥＰＳ产量的影响，结果见图 ７。 由图 ７ 可知：尽管初
始 ｐＨ为 ７ 时菌株的生长最好，ｐＨ 在 ７ ～ １０ 的范围
内，其培养液的菌体生物量均基本一致。 在初始 ｐＨ
为 ９时，菌株 ＥＰＳ的产量最高。
培养基的初始 ｐＨ 和培养过程中 ｐＨ 的控制，
对胞外多糖的合成具有显著影响［１８］ 。 Ｖａｎｉｎｇｅｌｇｅｍ
等［１９］ 研 究 发 现， 嗜 热 链 球 菌 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ １１１ 在培养基营养成分相同的条件
下，调控 ｐＨ条件下 ＥＰＳ 的产量是不调控 ｐＨ 条件
下产量的 ５ 倍。 其原因可能是环境 ｐＨ 变化可引
起细胞膜电荷的变化，影响细胞膜的功能，细胞的
形态和结构，进而影响菌体对营养物质的吸收和
代谢产物的生物合成［２０］ 。 结果表明，中性和弱碱
性环境有利于菌株的生长，而碱性环境更有利于
ＥＰＳ地产生和积累，这与 Ｋｕｍａｒ 等［９］研究发现大
多数菌株产 ＥＰＳ 要求的培养基 ｐＨ 为中性有所
不同。
图 ７　 初始 ｐＨ对菌株 ３ ３ １ ２生长和
ＥＰＳ产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ＥＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ３⁃３⁃１⁃２
２􀆰 ２　 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ 响应面法优化南极细菌 ３
３ １ ２产 ＥＰＳ条件
２􀆰 ２􀆰 １　 影响南极细菌 ３ ３ １ ２ 产 ＥＰＳ 的关键
因素
根据单因素试验结果确定蔗糖、ＫＮＯ３和温度为
菌株 ３ ３ １ ２产 ＥＰＳ的关键因素，３ 因素水平分
别选取蔗糖添加量 ３０􀆰 ０、４０􀆰 ０ 和 ５０􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ，ＫＮＯ３添
加量 ５􀆰 ０、１０􀆰 ０和 １５􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ，温度 １０􀆰 ０、１５􀆰 ０和 ２０􀆰 ０
℃。 采用 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ 响应面软件对其进行
Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面设计（表 １），以发酵液的产糖
量 Ｙ为响应值，对试验结果进行回归分析（表 ２），从
而研究菌株 ３ ３ １ ２产 ＥＰＳ的最佳条件。
２􀆰 ２􀆰 ２　 二次回归方程拟合及方差分析
利用 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ软件对表 ２ 数据进行多元
二次回归拟合，得到回归方程 Ｙ ＝ － ６􀆰 ２５４ １２ ＋
２􀆰 ９６３ ６２Ｘ１ ＋２􀆰 ８６６ ７５Ｘ２ ＋０􀆰 １８３ ５５Ｘ３ －０􀆰 ３４７ ５Ｘ１Ｘ２＋
０􀆰 ０１５Ｘ１Ｘ３＋０􀆰 ０７０ ４Ｘ２Ｘ３－０􀆰 ３３５ １２Ｘ２１－１􀆰 ３４０ ５ Ｘ２２－
０􀆰 ００９ １５Ｘ２３。
回归方程的方差分析和可信度分析如表 ２和表
３所示。 由表 ２ 和表 ３ 可以看出，蔗糖添加量对菌
３３　 第 ４期 李　 凯等：南极细菌 Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．３ ３ １ ２产胞外多糖条件优化
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
体产糖量影响显著（Ｐ ＝ ０􀆰 ０１１ ４＜０􀆰 ０５），ＫＮＯ３添加
量影响不显著（Ｐ ＝ ０􀆰 １５９ ４＞０􀆰 ０５），温度对菌体产
糖量极显著（Ｐ ＝ ０􀆰 ００４ ２＜０􀆰 ０１）；回归模型 Ｆ 值检
验显著（Ｐ ＝ ０􀆰 ００１ ３ ＜ ０􀆰 ０１），失拟项不显著 （Ｐ ＝
０􀆰 １０２ ３＞０􀆰 ０５），说明模型在被研究的整个区域具有
较好的拟合度。 从模型可信度分析可知，其决定系
数（Ｒ２）＝ ９４􀆰 ４８％＞８０􀆰 ００％，矫正决定系数（Ａｄｊ􀆰 Ｒ２）
＝ ８７􀆰 ３８％，说明模型对试验预测的准确性有
８７􀆰 ３８％；Ｙ的变异系数（Ｃ􀆰 Ｖ􀆰 ＝ ５􀆰 １２）较低，说明试
验的操作性高。 但预测决定系数 （ Ｐｒｅｐ􀆰 Ｒ２ ＝
０􀆰 ３１１ ０）较低，这可能与菌株 ３ ３ １ ２产 ＥＰＳ不
稳定有关。 总体来说，回归模型具有较好的拟合
度，在一定的条件下可以用回归方程对菌株 ３ ３
１ ２ ＥＰＳ产量进行分析和预测。
利用 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ软件对二次回归模型进行
规范分析，通过回归方程来分析绘制分析图，考察
所拟合的相应曲面形状，蔗糖浓度、ＫＮＯ３浓度和温
度之间的等高图和立体分析图分别如图 ８、９ 和 １０
所示。
表 １　 Ｂｏｘ Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计与结果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｂｏｘ⁃Ｂｅｈｎｋｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
试验号
Ｘ１
ρ（蔗糖） ／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｘ２
ρ（ＫＮＯ３） ／
（ｇ·Ｌ－１）
Ｘ３
温度 ／
℃
Ｙ
ρ（ＥＰＳ） ／
（ｇ·Ｌ－１）
１ ４０􀆰 ０ １０􀆰 ０ １５􀆰 ０ ２􀆰 ８９
２ ３０􀆰 ０ １０􀆰 ０ １０􀆰 ０ ２􀆰 １９
３ ５０􀆰 ０ ５􀆰 ０ ２０􀆰 ０ ２􀆰 ６９
４ ４０􀆰 ０ １５􀆰 ０ １５􀆰 ０ ２􀆰 ３４
５ ３０􀆰 ０ ５􀆰 ０ １５􀆰 ０ ２􀆰 ０２
６ ５０􀆰 ０ １０􀆰 ０ ２０􀆰 ０ ２􀆰 ８８
７ ３０􀆰 ０ １０􀆰 ０ ２０􀆰 ０ ２􀆰 ３６
８ ５０􀆰 ０ ５􀆰 ０ １５􀆰 ０ ２􀆰 ６４
９ ４０􀆰 ０ ５􀆰 ０ １０􀆰 ０ ２􀆰 ５７
１０ ４０􀆰 ０ １０􀆰 ０ １５􀆰 ０ ２􀆰 ９９
１１ ４０􀆰 ０ １０􀆰 ０ １５􀆰 ０ ３􀆰 １１
１２ ４０􀆰 ０ １０􀆰 ０ １５􀆰 ０ ３􀆰 ０５
１３ ３０􀆰 ０ １５􀆰 ０ １５􀆰 ０ ２􀆰 ４１
１４ ４０􀆰 ０ １５􀆰 ０ １０􀆰 ０ １􀆰 ８７
１５ ５０􀆰 ０ １０􀆰 ０ １０􀆰 ０ ２􀆰 ４１
１６ ４０􀆰 ０ １０􀆰 ０ １５􀆰 ０ ３􀆰 ０８
１７ ４０􀆰 ０ １５􀆰 ０ ２０􀆰 ０ ２􀆰 ７０
表 ２　 回归方程方差分析
Ｔａｂｌｅ ２　 ＡＮＯＶＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ＲＳＭ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
方差
来源
总偏差
平方和 自由度
平均方差
平方和 Ｆ值 Ｐ
Ｘ１ ０􀆰 ２１ １ ０􀆰 ２４ １１􀆰 ５７ ０􀆰 ０１１ ４
Ｘ２ ０􀆰 ０４ １ ０􀆰 ２１ ２􀆰 ４８ ０􀆰 １５９ ４
Ｘ３ ０􀆰 ３１ １ ０􀆰 ０４ １７􀆰 ４２ ０􀆰 ００４ ２
Ｘ１Ｘ２ ０􀆰 １２ １ ０􀆰 ３１ ６􀆰 ８１ ０􀆰 ０３４ ９
Ｘ１Ｘ３ ０􀆰 ０２ １ ０􀆰 １２ １􀆰 ２７ ０􀆰 ２９７ １
Ｘ２Ｘ３ ０􀆰 １２ １ ０􀆰 ０２ ６􀆰 ９９ ０􀆰 ０３３ ３
Ｘ２１ ０􀆰 ４７ １ ０􀆰 １２ ２６􀆰 ６７ ０􀆰 ００１ ３
Ｘ２２ ０􀆰 ４７ １ ０􀆰 ４７ ２６􀆰 ６７ ０􀆰 ００１ ３
Ｘ２３ ０􀆰 ２２ １ ０􀆰 ４７ １２􀆰 ４４ ０􀆰 ００９ ６
模型 ２􀆰 １２ ９ ０􀆰 ２２ ０􀆰 ２４ ０􀆰 ００１ ３
失拟项 ０􀆰 ０９ ３ ０􀆰 ２４ ４􀆰 １３ ０􀆰 １０２ ３
纯误差 ０􀆰 ０３ ４ ０􀆰 ０３
合计 ２􀆰 ２５ １６
表 ３　 模型可信度分析
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｄｌｅ
模型
平均值
决定
系数２ ／ ％
矫正决定
系数２ ／ ％
预测决定
系数
Ｙ的变异
系数％
２􀆰 ６２ ９４􀆰 ４８ ８７􀆰 ３８ ０􀆰 ３１１０ ５􀆰 １２
图 ８　 蔗糖和 ＫＮＯ３用量对 ＥＰＳ产量的交互影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ＥＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２􀆰 ２􀆰 ３　 各因素最优值的确定
利用 Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ 软件进行岭脊分析［２１］，得
４３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
图 ９　 蔗糖浓度和温度对 ＥＰＳ产量的交互影响
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ＥＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图 １０　 ＫＮＯ３浓度和对 ＥＰＳ产量的交互影响
Ｆｉｇ􀆰 １０　 Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ＥＰＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
到各因素的最佳添加量分别为蔗糖 ４３􀆰 １ ｇ ／ Ｌ，
ＫＮＯ３ ９􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ，温度 １７􀆰 ３ ℃ ，最佳响应值为 ３􀆰 ０９６
ｇ ／ Ｌ，可信度为 ９８􀆰 ８％。 再根据试验操作的合理性
和可操作性确定在基础培养基中添加蔗糖 ４３􀆰 １
ｇ ／ Ｌ，ＫＮＯ３ ９􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ，温度 １７􀆰 ３ ℃ ，转速 １５０ ｒ ／ ｍｉｎ，
ｐＨ ９，接种量 １％，进行 ３ 组试验，每组 ３ 个样本进
行发酵试验，得到 ３ 组的平均 ＥＰＳ 产量为 ２􀆰 ８９
ｇ ／ Ｌ、３􀆰 ０３ ｇ ／ Ｌ和 ２􀆰 ７８ ｇ ／ Ｌ。 试验结果与预测值较
为接近，说明回归方程能够较真切地反映各因素
对产糖量的影响。
传统的发酵条件优化大多采用单一的单因素
设计，或者较简单的正交试验，笔者针对单一使用
响应面法的不足之处，高效整合单因子试验和响应
面中心组合设计等统计学方法［２２］，准确快速地实现
了南极细菌 ３ ３ １ ２产 ＥＰＳ条件的优化，获得了
较理想的结果。 本研究从众多影响细菌产 ＥＰＳ 的
因素中筛选出了主要因素并实现了因素水平的优
化，极大地提高了南极细菌 ３ ３ １ ２ 的产糖量，
使其最高产量可高达 ３􀆰 ０３ ｇ ／ Ｌ，为以后 ＥＰＳ 的扩大
生产和工业化利用提供了一定的科学依据。
３　 结论
南极细菌 Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ􀆰 ３ ３ １ ２ 最
适生长条件和最佳产 ＥＰＳ 条件并不完全一致；产
ＥＰＳ发酵培养基的最佳碳源和氮源分别为蔗糖和
ＫＮＯ３，其最佳添加量分别为 ４３􀆰 １ ｇ ／ Ｌ 和 ９􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ，
最适温度为 １７􀆰 ２ ℃，最适 ｐＨ 为 ９，最适盐度为
４􀆰 ５％；优化后菌体粗多糖产量可达 ３􀆰 ０３ ｇ ／ Ｌ。
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ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｇａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｔｈｅ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ ｓｐ．
ｂｕｒｇｌａｒｉｏｕｓ ＮＣＦＢ ２７７２ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １９９６， ４６：
２７９⁃２８４．
（下转第 ５７页）
５３　 第 ４期 李　 凯等：南极细菌 Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．３ ３ １ ２产胞外多糖条件优化
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８