全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
-:@CE0E]BHFC,.BDY@B1FBIE00TCJ@CEEF@CJ
bB.2! +B2#
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GB@"&%2(/*/6_2@00C2&*$ =(*!2$%&%2%#2%&$
收稿日期"$%&% =%# =%&
基金项目"国家科技支撑计划资助项目#$%%Y53)Y%)$%国际科技合作项目#$%%!3U5(%&%$%广西科学院基本业务研究经费资助项目
#%%&%/L]&Q[%&$
作者简介"曾丽娟#&/!(&$女广西柳州人硕士研究生研究方向"微生物技术%黄日波#联系人$教授TRA,@."F8:H,CJcJ^,02IC
生淀粉酶生产菌株 3(%.:(#*;"19=的筛选和
酶的纯化及酶学性质
曾丽娟&杨"键&陈"英&王青艳&$黄日波&$
#&2广西大学 生命科学与技术学院南宁 )(%%%)%
$2广西科学院 国家非粮生物质能源工程技术研究中心南宁 )(%%%$
摘"要"分离得到 & 株产生淀粉酶的菌株通过扩增和测定 &*Q F3+5序列并进行比对发现是#$%&($)*+,属的细
菌( 液体摇瓶发酵结束后其产生的生淀粉酶比酶活达 &%!d) W6AV( 通过饱和#+4
#
$
$
Q>
#
沉淀)QE1:,IFK.Q (%%
层析的方法对其所产的生淀粉酶进行分离纯化得到纯化的酶蛋白比酶活为) &&$d%# W6AJ纯化倍数为 &#d&相
对分子质量约为 &d% j&%)( 该酶以木薯生淀粉为底物时最适 14)d*最适温度 )% e( 金属离子-,$l) J`$ l对该
酶具有激活作用PC$ l)-H$ l)UE$l)+@$l) C`$ l)-B$l和T3f5$=对该酶均具有抑制作用(
关键词"#$%&($)*+,012%生淀粉酶%分离纯化
中图分类号"7/(""""文献标志码"5""""文章编号"&*$ =(*!#$%&%$%# =%%*$ =%)
)1265F.2/2745L1F54:-VI.;01F./; 5GA6510942I3:./; 1F45./3(%.:(#*;"19=
5/I.F1934.7.:5F.2/5/I:-545:F04.H5F.2/
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FE01EI?@\E.K2
K0A L24I1"#$%&($)*+,012% ,AK.,0E% 1HF@D@I,?@BC
""由于近年来石油价格的不断增长各国政府和 实验室都在寻找能取代石油的能源比如利用木
薯)马铃薯淀粉等来生产燃料乙醇*&+ ( 工业上淀
粉颗粒转变为葡萄糖需要经过液化和糖化 $ 个步
骤此工艺需要对淀粉原料进行高温蒸煮( 基于减
少能源消耗和有效利用天然资源的需要生淀粉的
生物能转化过程引起了广大科研人员的关注并对
能降解生淀粉的酶类进行了研究*$ =*+ ( 已发现的能
产生淀粉酶的微生物种类较多报道最多的是黑曲
霉)根霉和芽孢杆菌* =!+ ( 本文介绍了从自然界中
分离得到产生淀粉酶的 #$%&($)*+,012并对其产
酶所需分离纯化及酶学性质进行了研究(
D?材料与方法
D=D?试样来源
""采自南宁某淀粉厂附近的腐殖土壤)排污口及
木薯田地(
D=B?主要酶和试剂
""f,X 酶)1 3`&! f载体购自大连 f,N,a,宝
生物工程公司%细菌基因组 3+5提取试剂盒);-a
产物纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公
司%交联丙烯基葡聚糖凝胶 QE1:,IFK.Q (%%购自
5AEF0:,A公司%其他试剂为国产或进口的分析纯和
生化试剂(
D=M?培养基和培养条件
&2(2&"富集及分离培养基#J6V$
""蛋白胨 &%牛肉膏 (+,-.)木薯生淀粉 &%(
&2(2$"种子培养基#J6V$
""葡萄糖 !蔗糖 !蛋白胨 &)酵母膏 (
N
$
4;>
#
$ J`Q>
#
%d*(
&2(2("发酵培养基#J6V$
""蛋白胨 &)酵母膏 (N
$
4;>
#
$ J`Q>
#
%d*木
薯生淀粉 &(
""其中木薯生淀粉需经过 &*% e干热灭菌 $ :
后无菌操作加入培养基中( 发酵的条件为 ( e
$%% F6A@C(
D=@?菌株的分离筛选
""采集的试样经过富集培养基多次富集后制成
菌悬液进行梯度稀释涂布于以木薯生淀粉为唯
一-源的分离培养基平板上( e恒温培养 ) G
后滴加稀碘液测定菌落周围透明圈和菌落直径
之比选择比值较大的菌落进一步划线分离纯化
进行产酶能力的测定选择酶活高的菌株作为目的
菌株(
D=P?酶活的测定方法
&2)2&"生淀粉酶活的测定方法
""参照文献*/+的方法来测定酶活(
""用 14*d%)%d$ AB.6V+,
$
4;>
#
和 %d& AB.6V柠
檬酸缓冲液配制成质量分数为 &i的木薯生淀粉悬
液作为底物( 首先在 )% AV三角瓶中加入 # AV底
物)% e预热 &% A@C然后加入 & AV经过适当稀释
的酶液)% e恒温振荡#&!% F6A@C$反应 (% A@C 后
加入 %d) AV)#i#质量分数下同$+,>4终止反
应最后取适当体积的反应液于 ) %%%F6A@C 离心
) A@C上清液用3+Q法测定还原糖量(
""酶活力#W$定义为在上述分析测定条件下
& A@C水解生淀粉产生 &
"
J的还原糖#以葡萄糖计$
所需的酶量(
&2)2$"糊化淀粉酶活的测定方法
""除作用底物换为糊化的淀粉外其余与生淀粉
酶活的测定方法相同(
D=Q?生淀粉降解能力#Y\*$计算
""根据文献*/+的方法a35m<69j&%%i其中
<为降解生淀粉酶活9为降解糊化淀粉酶活(
D=R?菌种鉴定
""首先提取该菌的总 3+5作为模板利用 &*Q
F3+5通用引物扩增得到 &*Q F3+5序列进行测序
分析然后将获得的序列在 OECY,Ch 数据库中进行
比对(
""&*Q F3+5引物序列"正向引物为 )vR5O5OfffR
O5f--fOO-f-5OR(v%反向引物为 )vRf5-OOff5-R
-ffOff5-O5-ffR(v(
"";-a扩增条件"/) e ) A@C/# e (% 0)) e
& A@C$ e /% 0循环 (% 次%$ e &% A@C(
D=>?酶的纯化
""发酵结束后发酵液经 ) %%% F6A@C离心 &) A@C
后上清液用 *%i饱和度的#+4
#
$
$
Q>
#
沉淀# e静
置 * :&% %%% F6A@C 离心 $% A@C收集沉淀用 14
*d%)%d$ AB.6V+,
$
4;>
#
和 %d& AB.6V柠檬酸缓冲液
溶解( 经过透析 $# : 后离心取上清液将之上样
到 QE1:,IFK.Q (%% 层析柱#&d* IAj!% IA$利用
5Nf51F@AE蛋白质纯化系统对收集的试样进行活
性测定合并活性部分用超滤管进行浓缩( 测定
酶活和蛋白含量( 最后用 Q3QR;5OT凝胶电泳
检测(
D=]?蛋白含量测定和!\!VW*%#凝胶电泳
""用YF,GDBFG法测定蛋白含量以牛血清蛋白绘
(*"第 # 期 曾丽娟等"生淀粉酶生产菌株#$%&($)*+,012的筛选和酶的纯化及酶学性质
制标准曲线( Q3QR;5OT方法参见文献*&%+浓缩
胶为 )i分离胶为 &%i(
D=DC?酶学性质研究
""将纯化得到的生淀粉酶进行以下性质的研究(
&2&%2&"温度的影响
""以 14*d%)%d$ AB.6V+,
$
4;>
#
和 %d& AB.6V柠
檬酸缓冲液配置质量分数为 &i的木薯生淀粉溶液
作为底物在不同的温度反应 (% A@C 后测定酶活
以确定该酶的最适反应温度( 以最高酶活为
&%%i其余酶活与之相比计算相对酶活(
为确定该酶的热稳定性将酶液在不同的温度
下放置 (% A@C 后即在冰浴中冷却测定酶活以未
保温的酶活为 &%%i(
&2&%2$"14的影响
""将不同 14的 %2$ AB.6V+,
$
4;>
#
和 %d& AB.6V
柠檬酸缓冲液配置成质量分数为 &i的木薯生淀粉
溶液该底物与酶液在 )% e反应 (% A@C 后测定酶
活( 以最高酶活为 &%%i其余酶活与之相比计算
相对酶活(
为确定该酶的 14稳定性室温下把酶液放置
在不同 14的缓冲液中 (% A@C 后测定酶活以未保
温的酶活为 &%%i(
&d&%d("离子的影响
""分别加入终浓度为 ) AAB.6V的离子包括
-,
$l
) J`
$ l
)PC
$ l
)-H
$ l
)UE
$l
)+@
$l
) C`
$ l
)-B
$l和
T3f5
$=
以未加离子条件下测定的酶活为 &%%i
其余酶活与之相比计算相对酶活测定各离子对该
酶的影响(
B?结果与分析
B=D?菌株的筛选
""对采集的试样经过多次富集后筛选到 & 株具
有较高生淀粉酶活的菌株发酵结束后比酶活达到
&%!d) W6AV测得其a35值为 )d!i(
B=B?菌株的 DQ!4\$*鉴定结果
""用 &*Q F3+5序列进行同源性比对分析确定
其分类地位( 在OECY,Ch 中进行同源比对分析发
现该菌株与 #$%&($)*+,属具有 /!i的同源性因
而可初步认为其属于 #$%&($)*+,属( 图 & 中的菌
落即为目的菌株(
B=M?生淀粉酶的分离纯化
""经筛选鉴定得到了 #$%&($)*+,012生淀粉
粗酶液通过#+4
#
$
$
Q>
#
沉淀)QE1:,IFK.Q (%%层析
图 D?分离培养基上3(%.:(#*;"19=对生淀粉的降解
N.;=D?\.;01F.2/2745L1F54:-JA 3(%.:(#*;"19=
;42L/2/.1265F.2/G0I.3G
柱分离纯化结果如表 & 所示(
表 D?生淀粉酶分离纯化结果
E5J60D?!09545F.2/5/I934.7.:5F.2/2745LV1F54:-VI.;01F./;
5GA6510273(%.:(#*;"19=
纯化结果 总酶活6
W
总蛋白6
AJ
比酶活6
#W!AJ
=&
$
回收率6
i
纯化
倍数
发酵液 ! *!% $# (*&d* &%% &
#+4
#
$
$
Q>
#
沉淀
# %!/d* # & %$$d#& #d& $d!
凝胶过滤 !&d/ %d&* ) &&$d%# /d# &#d&
""由表 & 可知实验获得纯化的酶蛋白比活为
) &&$d%# W6AJ纯化倍数为 &#d&回收率为 /d#i(
在 &%i Q3QR;5OT凝胶电泳中鉴定为相对分子质
量约为 &d% j&%)的蛋白质结果见图 $(
&&生淀粉酶% &`蛋白质标准品
图 B?3(%.:(#*;"19=生淀粉酶的!\!VW*%#凝胶电泳
N.;=B?!\!VW*%#27F-0934.7.0I45LV1F54:-VI.;01F./;
5GA6510273(%.:(#*;"19=
#* 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
B=@?酶学性质研究
$2#2&"最适温度及温度稳定性
""分别在 (%)#%)#)))%)*% 和 % e下按生淀粉
酶活的测定方法测定酶活结果如图 ( 所示( 由图
( 可知温度对该酶活的影响很大其最适温度为
)% e(
图 M?温度对生淀粉酶活性的影响
N.;=M?#70:F27F0G9045F3402/45LV1F54:-VI.;01F./;
5GA65105:F.Z.FA
""将酶液在以上各温度下保温 (% A@C 后测定剩
余酶活结果如图 # 所示( 由图 # 可知在 (% k
)% e时剩余酶活保持在 !%i以上即在此范围内
酶是稳定的而当温度高于 )% e时酶活迅速下降(
图 @?温度对生淀粉酶的稳定性的影响
N.;=@?#70:F27F0G9045F3402/1F5J.6.FA 27
45LV1F54:-VI.;01F./; 5GA6510
$2#2$"最适 14及 14稳定性
""分别用 14为 (2% k!d% 的缓冲液配制质量分
数为 &i的木薯生淀粉作为底物按生淀粉酶活测
定方法测定酶活结果如图 ) 所示( 由图 ) 可知"该
酶的最适 14为 )d*( 当 14大于 时酶活迅速下
降%而在 14为 # 时仍有 ((i的相对酶活(
""室温下将酶液在不同 14缓冲液中放置 (%
A@C然后在最适 14)d* 下测定剩余酶活结果如图
* 所示( 由图 * 可知在 14)d* kd* 范围内该酶
图 P?9"对生淀粉酶活性的影响
N.;=P?#70:F279"2/45LV1F54:-VI.;01F./;
5GA65105:F.Z.FA
有 !%i以上的剩余酶活表明其在该范围内较
稳定(
图 Q?9"对生淀粉酶稳定性的影响
N.;=Q?#70:F279"2/1F5J.6.FA 2745LV1F54:-V
I.;01F./; 5GA6510
$2#2("离子对酶活的影响
""分别加入 ) AAB.的离子包括 -,$l) J`$ l)
PC
$ l
)-H
$ l
)UE
$l
)+@
$l
) C`
$ l
)-B
$l和 T3f5$=以未
知离子条件下测定的酶活为 &%%i其余酶活与之
相比计算相对酶活来测定各离子对该酶的影响
结果如图 所示( 由图 可知"-,$l) J`$ l对该酶
具有一定的激活作用其中 -,$l的作用效果较强%
金属离子 PC$ l)-H$ l)UE$l)+@$l) C`$ l)-B$l和
T3f5
$=对该酶具有抑制作用其中 -H$ l)UE$l)
C`
$ l抑制作用较强UE$l对酶活的抑制高达 !/i(
M?结?论
""筛选到 & 株对木薯生淀粉有较强降解能力的菌
株经鉴定该菌株属于 #$%&($)*+,属( 液体摇瓶
发酵后#$%&($)*+,012的生淀粉比酶活达 &%!d)
W6AVa35值为 )d!i反映了该酶对生淀粉具有
较强的降解能力(
)*"第 # 期 曾丽娟等"生淀粉酶生产菌株#$%&($)*+,012的筛选和酶的纯化及酶学性质
图 R?金属离子及#\E*Bd对生淀粉酶活性的影响
N.;=R?#70:F127Z54.231G0/F56156F15/I#\E*
Bd
2/F-05:F.Z.FA 2745LV1F54:-VI.;01F./;
5GA6510
""通过饱和#+4
#
$
$
Q>
#
沉淀)QE1:,IFK.Q (%% 层
析的方法对 #$%&($)*+,012所产生淀粉酶进行分
离纯化经 Q3QR;5OT鉴定获得纯化的酶蛋白比活
为 ) &&$d%# W6AJ纯化倍数为 &#d&相对分子质量
约为 &d% j&%)并对纯化后的生淀粉酶进行了酶学
性质的研究结果表明"其最适温度为)% e最适
14为 )d*( -,$l) J`$ l对该酶具有激活作用PC$ l)
-H
$ l
)UE
$l
)+@
$l
) C`
$ l
)-B
$l和T3f5$=对该酶具有
不同程度的抑制作用(
参考文献"
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*$+"潘明周永进张强等2产生淀粉糖化酶菌株的分离以及酶性
质的初步研究*]+2四川理工学院学报"自然科学版$%%*&/
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*+"O,CJ,G:,F,C 3 ,`G:,\,C +,A1BB?:@F@NQ@\,F,A,hF@0:C,C QE?
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*+,*]+2TC9KAE,CG @`IFB8@,.fEI:CB.BJK&///$)"#((R#(!2
*/+"李凤玲张璐刘连成等2生淀粉糖化酶产生菌 1%*+*0,7:
)/0(+7012Q3T的分离鉴定及酶学性质的研究*]+2工业微生
物$%%!&%#)$"#)R#/2
V@UECJ.@CJP:,CJVHV@H V@,CI:ECJE?,.2M0B.,?@BC BDaQO5R
1FBGHI@CJ0?F,@C 1%*+*0,7)/0(+7 012Q3T,CG @?0EC9KA,?@I
1FB1EF?@E0*]+2MCGH0?F@,.` @IFB8@B.BJK$%%!&%#)$"#)R#/2
*&%+ 汪家政范明2蛋白质技术手册*N+2北京"科学出版社$%%%"
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R/$2
最新专利文摘
-+&%&*/(/&%5"一种微生物酶法生产纤维低聚糖的新工艺
一种微生物酶法生产纤维低聚糖的工艺是以经过预处理的纤维素为原料真菌纤维素酶为初始酶制
剂采用纤维素-底物原位吸附 固液分离拆分 定向水解法.酶解制备纤维低聚糖由于拆分去除了纤维素
酶系中大量的
#
葡萄糖苷酶水解体系中的
#
葡萄糖苷酶含量大大降低提高了纤维低聚糖的得率降低
了产品中无生理活性的单糖葡萄糖含量( 与未拆分处理的普通纤维素酶解工艺相比水解产物中纤维低聚
糖占总糖的百分数可以提高 & 倍左右为低成本生产微生物酶法纤维低聚糖提供了一个新的途径(
#文伟河$
** 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"