全 文 ：第 ! 卷第 # 期
#$%% 年 & 月
生"物"加"工"过"程
9=QCJ(JTDIOCBEDN\QD)ODHJ((@CMQCJJOQCM
2DE*! -D*#
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KDQ"%$*&!7!:e*Q((C*%78# 6&783*#$%%*$#*$%&
收稿日期"#$%$ 6$7 6%#
基金项目"科技部资助项目##$$!WTY%$$08$(天津市科委资助项目#$3V1914.$&&$!V9V^ 4[$0#$$$
作者简介"李"敏#%!3%$&女&内蒙古包头人&硕士研究生&研究方向"电化学生物传感器(张娟琨#联系人$&教授&博士生导师&@FPBQE"
<=BCMecfAI(A*JKI*HC
分子印迹技术应用于血清中地高辛的快速检测
李"敏%&张娟琨%&张子怡#&张彬彬%&范"婷%&吴"萍%
#%*天津科技大学 生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室&天津 &$$08(
#*天津体育学院 运动人体科学系&天津 &$$&3%$
摘"要"应用分子印迹的方法制备对地高辛有特异性吸附性能的印迹聚合物颗粒&再将颗粒与琼脂糖混合并固定
于玻碳电极上制备成地高辛分子印迹聚合膜传感器&传感器可以特异性地结合模板分子地高辛且其电化学信号与
模板浓度相关&再用它来检测血清中地高辛的含量 结果表明"分子印迹传感器具有制作简便)成本低)检测快速)
特异性高)稳定性好等优点&检测下限为 %j#3 CPDE:U&检测时间为 PQC
关键词"分子印迹传感器(地高辛(聚合物(血清(快速检测
中图分类号"d+#%#*&""""文献标志码"Y""""文章编号"%78# 6&783##$%%$$# 6$$70 6$0
5`9.HH0E0:E.2/27H.;2G././1043J15J9601KM J260:3654.J94./E0HK.210/124
U,` QC
%
&V.Y-WTIBCcIC
%
&V.Y-WVQXQ
#
&V.Y-W\QC;QC
%
&[Y-dQCM
%
&RS>QCM
%
#%*_JXUB;DOBADOXDN,CKI(AOQBE` QHOD;QDEDMXDNA=J` QCQ(AOXDN@KIHBAQDC&9DEJMJDN\QDJCMQCJJOQCM&
dQBCeQC SCQZJO(QAXDN4HQJCHJBCK dJH=CDEDMX&dQBCeQC &$$08&9=QCB( #*^ J)BOAPJCADN.JBEA= BCK
@GJOHQ(J4HQJCHJ&dQBCeQC SCQZJO(QAXDN4)DOA&dQBCeQC &$$&3%&9=QCB$
*K1E45:E"d=J;QD(JC(DOLB()OJ)BOJK ;XPDEJHIEBOQP)OQCAJK AJH=CQaIJLQA= KQMDGQCF()JHQNQHBK(DO)AQDC
)OD)JOAQJ(*[QO(AEXA=JQP)OQCAJK )DEXPJO)BOAQHEJ(LJOJ)OJ)BOJK*d=JC& )BOAQHEJ(BCK A=JBMBOD(JLJOJ
PQGJK QC )OD)DOAQDC*d=JPDEJHIEBOQP)OQCAJK )DEXPJONQEP(JC(DONDOA=JKQMDGQC LB(NQGJK ;XA=JPQGAIOJ
DC BMEB((XHBO;DC JEJHAODKJ#W9$*d=J(JC(DO=BK ()JHQNQHHDP;QCBAQDC DNAJP)EBAJPDEJHIEJFKQMDGQC BCK
QA(JEJHAODH=JPQHBE(QMCBE(B((DHQBAJK LQA= A=JAJP)EBAJHDCHJCAOBAQDC*d=I(&QAHDIEK ;JI(JK ADKJAJHAKQF
MDGQC EJZJE(QC (JOIP*d=JPDEJHIEBOQP)OQCAJK ;QD(JC(DO=BK BKZBCABMJ(DN(QP)EJ&EDLHD(A&OB)QK KJAJHF
AQDC&=QM= ()JHQNQHQAX& BCK MDDK (AB;QEQAX*d=JKJAJHAQDC EQPQADNA=J;QD(JC(DOLB(%j#3 CPDE:UBCK KJAJHF
AQDC AQPJLB( PQC*
L0M I24H1"PDEJHIEBOQP)OQCAJK (JC(DO( KQMDGQC( )DEXPJO( (JOIP( OB)QK KJAJHAQDC
""地高辛来源于毛花洋地黄#毛地黄$的叶子和
种子&是一种类固醇毒素&自 %3 世纪以来&一直用于
治疗充血性心力衰竭)心房颤动和心房扑动等疾
病*%+ 虽然地高辛作为强心苷类药物已有 #$$ 多年
的历史&但是&地高辛的治疗浓度范围很窄#$j h
#j$ CM:PU$&它的使用需要对血液最低毒性进行严
格的监控*# 6&+
""已有多种检测方法被用来检测血液和尿液中
地高辛的浓度&其中包括放射性免疫测定#b,Y$ *0+ )
酶扩大免疫测定 # @` ,d$ *+ )荧光极化免疫测定
#[>,Y$
*7+和液相层析质谱*8+等 然而&使用放射性
核素存在特异性问题&高效液相色谱在地高辛含量
很低时不太敏感&液相层析质谱不仅费时而且昂
贵*3+ 因此&需要一种快速简便&灵敏度又高的检
测地高辛的方法 分子印迹是合成具有特异性位
点聚合物的一种新兴技术&功能单体在模板分子存
在的情况下聚合在一起 分子印迹聚合物# ,`>($
可以用于层析分离*!+ )固相萃取*%$+ )催化反应*%%+ )
免疫分析*%#+以及传感器技术*% 6%0+ &它可以在水相
或非水相的环境中制备&还可以制备成各种形状以
方便用于传感器的设计*%+ 分子印迹在结合生物
分子时具有高选择性&又使交联聚合物的稳定性
好&这对地高辛浓度分析是理想的方法
本研究利用分子印迹颗粒物制作一种膜状的测
定地高辛浓度的传感器&将分子印迹颗粒与琼脂糖混
合后固定到电极上制备成电化学传感器&同时对该传
感器的特异性)选择性)稳定性等方面进行评价
C?材料与方法
CNC?试剂与仪器
%j%j%"试剂
""地高辛标准品#KQMDGQC$)乙二醇二甲基丙烯酸
酯#@^ Y`$&4QMPB公司(甲基丙烯酸# Y`Y$)甲醇&
天津市瑞金特化学品有限公司(偶氮二异丁腈
#Y,\-$&天津市化学试剂六厂(铁氰化钾&天津市永
大化学试剂开发中心(不含有地高辛的健康人血
清 使用的试剂除 Y,\-是化学纯外&其余试剂均
为分析纯
%j%j#"仪器
""U_#$$Y型电化学工作站&天津兰力科化学电子
高技术有限公司(三电极系统"玻碳电极为工作电极&
YM:YM9E电极为参比电极&铂电极为对电极(S2>9
#0$%型紫外可见光分光光度计&日本岛津公司
CN@?方法
%j#j%"地高辛印迹聚合物颗粒的制备
""使用热聚合的方法制备印迹聚合物颗粒 取# p
%$
60
PPDE:U地高辛溶液 &!$
"
U&加入 $j# PPDE:U功
能单体 Y`Y83$
"
U&再加入溶剂甲醇& PU放置在摇
床上 %#$ O:PQC)#! k预作用 7 =&使模板分子与功能
单体充分作用形成复合物 然后加入 % PPDE:U交联
剂 @^ Y`# PU&$j% M致孔剂 Y,\-&混匀后转入 %
PU试管中&通-
#
脱氧 %$ PQC&真空下密封后放入恒
温水浴槽中&7$ k反应#0 =形成棒状聚合物 用同样
条件制备无模板分子的空白聚合物#-,>$ 然后将
聚合物用研钵粉碎研磨后过 $j& PP筛&得到粒径均
一的印迹聚合物颗粒*%0+
"" ,`>(颗粒使用甲醇 乙酸#体积比 !i%$的溶液
进行超声洗涤&直到洗脱液用紫外分光光度计检测
不到模板分子地高辛 之后用甲醇洗去多余的乙
酸&再用蒸馏水反复多次洗去多余甲醇&最后将颗
粒放入真空干燥器干燥至恒质量
%j#j#"涂膜量的优化
""涂膜量对试验有一定的影响 #
"
U制膜溶液
不足以覆盖电极表面&分别取 &))3)%$
"
U制备传
感器&用其对地高辛分别进行电化学检测 #见
%j#j0$&分析涂膜量对实验结果的影响#每个试验
重复 & 次$
%j#j&"地高辛印迹聚合膜的制备
""取 #$ PM地高辛印迹颗粒加入到 % PU)$j3g
的琼脂糖溶液中&制成 #$ PM:PU的印迹颗粒溶液
备用 将直径 & PP的玻碳电极打磨抛光后&依次
用乙酸)乙醇)丙酮超声清洗 & PQC&再用蒸馏水超声
清洗 # 遍&每遍 & PQC 洗好的电极放入 ).7*$ 的
磷酸盐#>\4$溶液中&在 6$j3 h#j$ 2电位下进行
活化&直到得到稳定的循环伏安响应 处理好的电
极待表面干燥后&取 &
"
U印迹聚合物颗粒均匀涂于
电极表面&水分蒸发后即在电极表面形成一层印迹
聚合物颗粒膜 非印迹聚合膜使用同样的方法制
备&用非印迹聚合物颗粒替换印迹聚合物颗粒即可
%j#j0"电化学检测及标准曲线的绘制
""用 % PPDE:U的铁氰化钾溶液来表征电极表面
电流的变化 用制备好的地高辛印迹聚合膜对地
高辛模板进行吸附来检测印迹聚合膜的性能&取地
高辛浓度分别为 %j#3)7*0)%#j3)%!j#)#*7)&3*0)
70)%$#)%#3)#7)&30)%#)70$ CPDE:U作为检测浓
度&每个浓度的稳定时间为 PQC#通过做时间 电
流曲线确定&每加入一个浓度的模板分子平均需要
PQC左右吸附稳定$&检测玻碳电极表面电流的变
化#每个试验重复 & 次$
""地高辛作为强心苷类药物&一般检测环境是血
清&所以本实验也对血清试样做了同样的检测
%j#j"印迹聚合膜的特异性研究
""印迹聚合物制备过程中&功能单体 Y`Y与模
板分子地高辛的羟基结合形成聚合物&实验中选用
四环素对印迹膜的特异性进行研究&因为四环素含
有多个羟基#%5.$&与地高辛的功能基团一致&而
7"第 # 期 李"敏等"分子印迹技术应用于血清中地高辛的快速检测
且四环素含有多个苯环&与地高辛的结构类似
%j#j7"稳定性
""用最优的方法制备地高辛分子印迹膜&将其放
置在 0 k冰箱中保存&每隔一段时间检测 % 次其在
铁氰化钾溶液中的电流响应#循环伏安法$&以氧化
峰电流来判断该传感器的稳定性
@?结果与讨论
@NC?涂膜量的影响分析
""涂膜量越大&膜中含有的印迹聚合物颗粒越多
不同涂膜量制备的传感器在地高辛吸附前后电流变化
与涂膜量的关系如图 % 所示 由图 % 可知"颗粒太多
使其不能均匀地平铺于电极表面&阻碍了模板分子与
孔穴的结合&使传感器对电流响应不是很敏感 在涂
膜量由 &
"
U增加到 %$
"
U的过程中&吸附#%j#3 h%#3
CPDE:U$前后电流变化越来越小&说明传感器对模板分
子的响应越来越小 所以&本实验选用涂膜量为 &
"
U&
以便膜对模板分子有最大吸附
图 C?涂膜量与电流变化的关系
U.;=C?a.7040/E.J94./E0HJ0JK45/0E-.:b/01101W04131
:3440/E:-5/;0K0EI00/E-05H1249E.2/1
@N@?电化学检测及标准曲线的绘制
""制备好的印迹聚合膜依次检测 %& 个浓度
#%j#3 h70$ CPDE:U$的地高辛&待检测的地高辛用
# 种溶剂配制#甲醇和血清$&配制过程及浓度完全
相同&以不加任何溶剂的地高辛作为对照 检测环
境是 % PPDE:U铁氰化钾 记录电极表面电流值&对
其进行分析&结果如图 # 所示 由图 # 可知"地高辛
印迹聚合膜对模板分子有较好的吸附效果&非印迹
聚合膜对模板分子的吸附很少&可以忽略不计 在
%j#3 h%#3 CPDE:U中&电流对浓度的变化基本是直
线#C# r$j!$&所以标准曲线的绘制选用 %j#3 h
%#3 CPDE:U这 ! 个浓度 #图 &$ 地高辛浓度在
%j#3 h70$ CPDE:U的循环伏安图如图 0 所示
图 @?地高辛印迹聚合膜传感器对不同浓度地高辛的吸附
U.;=@?*H1249E.2/27E-0.J94./E0H926MJ04
J0JK45/0K.210/124724H.7040/E
:2/:0/E45E.2/127H.;G.2/
图 O?地高辛浓度对电流标准曲线
U.;=O?!E5/H54H:34W01275H1249E.2/5115M
注"图中左侧为完整的循环伏安曲线&右侧是将左边图中的氧化
峰位置放大的效果图&印迹聚合膜对电流的响应随着地高辛
浓度的增大而逐渐减小
图 P?印迹聚合膜吸附试验的循环伏安图
U.;=P?,M:6.:W26E5JJ0E4M 275H1249E.2/5115M
@NO?印迹聚合膜特异性分析
""实验选用与地高辛结构类似并有相同功能基
团的四环素与地高辛对比&检测印迹聚合膜的特异
性&浓度范围为 %j#3 h%#3 CPDE:U&检测环境为
%PPDE:U铁氰化钾&结果如图 所示 由图 可知"
印迹聚合膜对四环素几乎不吸附&印迹聚合物孔穴
对模板分子是特异性结合的&这种结合不仅取决于
功能基团&同时也取决于模板分子的结构
77 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 Q?地高辛印迹聚合膜传感器对不同浓度地
高辛和四环素的吸附
U.;=Q?*H1249E.2/27H.;2G./.J94./E0H
926MJ04J0JK45/0K.210/124724
H.;G.2/5/HE0E45:M:6./0
@NP?印迹聚合膜稳定性研究
""将制备好的印迹聚合膜放于冰箱中保存&每隔
一段时间检测其对电流的响应&以此来考察印迹聚
合膜的稳定性&结果如图 7 所示 由图 7 可知"在
0 k的条件下&%7$ K 内传感器是基本稳定的&不会
影响检测的灵敏度
图 R?印迹聚合膜放置时间与电流关系
U.;=R? 0`65E.2/1-.9K0EI00/10/124965:0H
E.J05/H:3440/E1
@NQ?试样分析
""表 % 显示了对地高辛血清试样的检测结果 由
表 % 可知&该方法用于检测血清试样中的地高辛含
量是可靠的#变异系数qg$
表 C?检测人血清试样中地高辛含量结果分析
D5K60C? 0`136E127-3J5/1043J15J9605/56M1.1
编号
4#标准$:
#CPDE!U
6%
$
4#检测$:
#CPDE!U
6%
$
平均值:
#CPDE!U
6%
$
标准
偏差
变异系
数:g
% % $j!& & $j!87 8 $j$&& &j&3
# %$ %$j%# 7 %$j#7 & $j&7# &j&
& $ #j%&& 0 %j$77 8 %j$3 #j!
0 %$$ !8*!!# % !3j!!7 % %j0%! 3 %j0&
O?结论
""通过玻碳电极固定地高辛分子印迹膜&制备了
可快速现场检测的新型生物传感器 通过循环伏
安扫描对地高辛进行特异性检测&获得了地高辛浓
度与电流变化的规律&确定了检测限可达 %j#3
CPDE:U&线性检测范围为 %j#3 h%#3 CPDE:U
""对血清试样的检测结果表明&该方法检测血清
中地高辛浓度是可靠的
参考文献"
* % +"李优鑫&毛静远&李惠芬*地高辛血药浓度检测方法的分析
*T+*中国中药杂志&#$$0&&##0$"#3F#33*
* # +"Y=PJK Y&>QA\&bB=QPADDEB4 .&JABE*@NJHA(DNKQMDGQC BAEDL
(JOIPHDCHJCAOBAQDC(DC PDOABEQAXBCK =D()QABEQIOJ"B)OD)JC(QAXFPBAH=JK (AIKXDNA=J^ ,WFAOQBE*T+*,CAT9BOKQF
DE&#$$3&%#&"%&3F%07*
* & +"WJDOMQD)DIEDI 22&_BEDMJOD)DIED(Y>&WQBPDIMDGQC A=JOB)XKDJ(CDAQP)ODZJDIAHDPJ(QC )BAQJCA(LQA= BKF
ZBCHJK =JBOANBQEIOJDC HDCAJP)DOBOXPJKQHBEA=JOB)X*T+*9QOH
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* 0 +"9=JC ,R&.JPQCMJOUY*^QMDGQC BCK KQMQADGQC* +`
$
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T&_B)EBC UY*` JA=DK(QC 9EQCQHBE9=JPQ(AOX*4AUDIQ("92 D`(F
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* +"[JOCvCKJ<>& I^OBCK T4&>wOJJOPBCJCAEXDOQF
JCAJK BCAQ;DKXQPPD;QEQNEDLFA=ODIM= NEIDODQPPICD(JC(DO*T+*YCBE\QDBCBE9=JP&#$$&&
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* 7 +">DOAJOR.&.BZJO2 &`\I(= \Y*@NJHADN)ODAJQC HDCHJCAOBAQDC
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* 8 +"]BD` &V=BCM.&9=DCM4&JABE*YOB)QK BCK (JC(QAQZJU9:`4:
4` B((BXNDOaIBCAQABAQZJKJAJOPQCBAQDC DNKQMDGQC QC OBA)EB(PB
*T+*\QDPYCBE&#$$&&&#"%%3!F%%!8*
* 3 +" J^EBADIOd&WOJPBIK b& D`AQJO>&JABE*>OJ)BOBAQDC DN(AB;EJQ(DAD)JF
EB;JEJK #FCQAOD;JCOBC BCAQ;QDAQH(BCK A=JQOHDP)OJ=JC(QZJH=BOBHAJOQBCK -` bAJH=CQaIJ(*T+*[DDK 9=JP&#$$&&%"7&8%F7&8!*
* ! +"dBPBXD[W&dQAQOQHQ` &` B`OAQCF@(AJ;BC Y&JABE*4XCA=J(Q(BCK
JZBEIBAQDC DNCJL)OD)B(ABAQDCBOX)=B(J(QC EQaIQK H=ODPBADMOB)=X*T+*YCBE9=QPYHAB&
#$$&0#"&3F07*
*%$+"V=I 1&]BCMT&4I +&JABE*4JEJHAQZJ(DEQKF)=B(JJGAOBHAQDC I(QCM
PDEJHIEBOEXQP)OQCAJK )DEXPJONDOA=JBCBEX(Q(DN)DEBODOMBCDF
)=D()=DOI()J(AQHQKJ(QC LBAJOBCK (DQE(BP)EJ(*T+*T9=ODPBADMO
Y&#$$&%$!#"%7%F%7!*
*%%+"RIENW*@C*T+*9=JPbJZ&#$$#&%$##%$"%F#8*
*%#+"UBZQMCBH-&YEJCKJO9T&\OBQC _b*9IOJCA(ABAI(DNPDEJHIEBOF
EXQP)OQCAJK )DEXPJO(B(BEAJOCBAQZJ(ADBCAQ;DKQJ(QC (DO;JCAB(F
(BX(*T+*YCBE9=QPYHAB&#$$0&%$##$"%&!F%0*
*%&+" Q^HcJOA[U&[DOA= >&UQJ;JO&JABE*` DEJHIEBOQP)OQCAQCMQC
H=JPQHBE(JC(QCMKJAJHAQDC DNBODPBAQHBCK =BEDMJCBAJK =XKODHBO;DC(
B(LJEB()DEBO(DEZJCAZB)DO(*T+*YCBE9=JP&%!!3&&7$"8!F87#*
*%0+"V=BCMT_&RBCM.*4XCA=J(Q(DNPDEJHIEBOEXQP)OQCAJK )DEXPJO
NDO(JC(QAQZJ)JCQHQEQC KJAJOPQCBAQDC QC PQEc *T+*YCBEXAQHBE
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*%+"UBc(=PQ^ &>OB(BK \\&4=BOPB>4*9OJBAQCQCJ(JC(DO;B(JK DC B
PDEJHIEBOEXQP)OQCAJK )DEXPJOFPDKQNQJK =BCMQCMPJOHIOXKOD) JF
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87"第 # 期 李"敏等"分子印迹技术应用于血清中地高辛的快速检测