全 文 ：第 １２卷第 ３期
２０１４年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０３􀆰 ０１０
收稿日期：２０１３－０５－０７
基金项目：国家大学生创新训练计划（２０１２１０２９５０８０）
作者简介：朱文杰（１９９２—），男，广东韶关人，学士，研究方向：生物制药工程；金　 坚（联系人），教授， Ｅ⁃ｍａｉｌ：Ｊｉｎｊｉａｎ３１＠ １６３􀆰 ｃｏｍ
融合蛋白 ＣＢＤ ＳＰＡ“Ｚ”基因的构建、表达与
活性鉴定
朱文杰１，马　 军２，张　 妍２，金　 坚１
（１􀆰 江南大学 药学院 无锡 ２１４１２２； ２􀆰 江南大学 生物工程学院
教育部工业生物技术重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：针对金黄色葡萄球菌蛋白 Ａ（ＳＰＡ）层析柱的应用问题，将 ＳＰＡ 的 Ｚ 结构域基因与纤维素结合结构域
（ＣＢＤ）重组，并在 Ｚ结构域 Ｃ端引入 １个半胱氨酸（Ｃｙｓ），构建并表达出一种新型免疫亲和材料。 利用基因工程技
术将质粒 ｐＥＺＺ１８中的 Ｚ基因插入到含有 ＣＢＤ 的质粒 ｐＥＴ３５ｂ（＋）质粒中，构建出原核表达载体 ｐＥＴ３５ｂ（ ＋） Ｚ
Ｃｙｓ，经 ＩＰＴＧ诱导表达，获得 ＣＢＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ融合表达蛋白。 ｐＥＴ３５ｂ（＋） Ｚ Ｃｙｓ在 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１中正确表达，所表
达的融合蛋白具有与哺乳动物 ＩｇＧ抗体结合的生物学活性和与纤维素结合的活性。 结果证明 ＣＢＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ蛋白
具有 Ｚ结构域与 ＣＢＤ结构域的活性，预计能在免疫亲和层析中用于 ＩｇＧ抗体的纯化。
关键词：纤维素结合结构域；免疫亲和层析；金黄色葡萄球菌蛋白 Ａ；Ｚ结构域；ＩｇＧ纯化
中图分类号：Ｑ７８４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０３－００５２－０６
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｏｆ
ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＢＤ⁃ＳＰＡ Ｚ
ＺＨＵ Ｗｅｎｊｉｅ１，ＭＡ Ｊｕｎ２，ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ２，ＪＩＮ Ｊｉａｎ１
（１􀆰 Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ； ２􀆰 Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｓｏｌｖｅ ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｏｆ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＳＰＡ） ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（ＣＢＤ） ｗｉｔｈ Ｚ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ＳＰＡ，ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｔ ｔｈｅ Ｃ⁃ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｏｆ Ｚ ｐｅｐｔｉｄｅ，ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｅｒｉａｌ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ􀆰 Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ３５ｂ（＋）⁃Ｚ⁃Ｃｙｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｃｌｏｎｅ ｔｈｅ Ｚ ｇｅｎｅ
ｏｆ ｐＥＺＺ１８ ｐｌａｓｍｉｄ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐＥＴ３５ｂ（＋） ｐｌａｓｍｉｄ ｗｉｔｈ ＣＢＤ ｇｅｎｅ，ｔｈｕｓ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＢＤ⁃ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ ｂｙ ＩＰＴＧ􀆰 Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ３５ｂ（＋）⁃Ｚ⁃Ｃｙｓ ｗａｓ ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ａｎｄ
ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｔａｉｎｅｄ ｔｈｅ ｂｉｏ⁃ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｚ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ＣＢＤ􀆰 ＣＢＤ ｃｏｕｌｄ ｂｉｎｄ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ
Ｚ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ） ｏｆ ｍａｎｙ ｍａｍｍａｌｉａｎｓ，ｖｉａ Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ； ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ； ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ； Ｚ
ｐｅｐｔｉｄｅ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ
　 　 各种微生物来源的纤维素酶普遍具有类似的 结构， 其中包括没有催化功能的纤维素结合结构域
（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ＣＢＤ） ［１］，其功能在与生物
工程技术相关的研究中已经被广泛应用［２］。 金黄
色葡萄球菌蛋白 Ａ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ，ＳＰＡ）中
含有 Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ和 Ｃ ５ 个高度同源的免疫球蛋白 Ｇ
（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ，ＩｇＧ）结合结构域，都能独立地与
ＩｇＧ的 Ｆｃ 片段结合，其中 Ｂ 结构域稳定性最好，与
ＩｇＧ的结合能力最强［３－５］。 由于只结合 Ｆｃ 段，所以
不会影响抗体的免疫学活性［６］，这使得利用 ＳＰＡ 亲
和层析柱纯化 ＩｇＧ 成为可能。 为了提高 ＳＰＡ 及纯
化蛋白的稳定性，基于 Ｂ 结构域的优势，研究者们
对其进行改造，使结构域中螺旋之间的角度产生改
变［７］，降低其与 ＩｇＧ的结合强度，使洗脱条件变得温
和，最终将其命名为 Ｚ结构域［８］。
长期以来，木质生物质被公认为是 １ 种潜在的
具有可持续来源的生物多糖材料，在过去近 １ 个世
纪研究中，目标明确的是如何在现今的市场中发挥
其成本竞争力［９］。 纤维素作为自然界中分布最广、
含量最多的 １ 种多糖，应用成本低廉。 而随着研究
重心转移的需求，若能把其与 ＣＢＤ之间的关系与应
用广泛的抗体纯化分子 ＳＰＡ有机结合，则不仅能为
研究开发提供所需材料，同时在生物工程工业生产
中还能产生巨大的经济效益［１０］。
由于 ＳＰＡ能与 ＩｇＧ 的 Ｆｃ 端特异性结合，一直
以来都被广泛应用于抗体纯化工作中，现在应用较
为广泛的是把 ＳＰＡ 连接到经 ＨＢｒ 活化的葡聚糖凝
胶而制成的层析柱。 由于 ＳＰＡ被包裹在基质里，活
性部位的分布具有不确定性，使得在纯化过程中与
抗体结合具有随机性，导致 ＳＰＡ 的使用效率低。 另
外葡聚糖等传统基质的抗压性能相对较差［１１］，使得
上样流速不能过快，导致纯化时间较长，影响工作
效率。 此外 ＨＢｒ有剧毒［１２］，处理不当将会严重影响
纯化产品的质量。 针对上述问题，笔者把 ＳＰＡ 改造
后的 Ｚ基因和 ＣＢＤ基因进行融合，构建了一种新型
表达载体。
有研究者做过将 ＳＰＡ 的 ５ 个结构域与 ＣＢＤ 或
其他活性结构进行融合的工作［１３－１４］，也有将 ＳＰＡ改
造后的 Ｚ 结构域与其他活性结构进行融合的成
果［１５］，但没有发现把 ＣＢＤ 与 Ｚ 结构域融合的相关
研究。 笔者尝试将单个 Ｚ结构域与 ＣＢＤ进行融合，
并在末端新添了 １个半胱氨酸（Ｃｙｓ），建立 １种新型
ＳＰＡ改良层析材料，以期为在亲和层析方面的应用
奠定基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
带有 ＣＢＤ基因的质粒 ｐＥＴ３５ｂ（ ＋）和带有 Ｚ 基
因的质粒 ｐＥＺＺ１８由药学院药物设计与分子药理研
究室保存；Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态
细胞购自 ＴＩＡＮＧＥＮ 公司；１ ｋｂ ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ 和
ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ购自 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 公司，标准蛋白
Ｌａｄｄｅｒ和预染蛋白 Ｌａｄｄｅｒ 购自 Ｔｈｅｒｍｏ 公司；限制
性核酸内切酶 ＳａｃⅡ购自 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 公司，限制性核
酸内切酶 ＸｈｏⅠ购自 Ｔｈｅｒｍｏ公司；实验所用引物由
Ｓａｎｇｏｎ公司合成；Ｔａｑ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰｓ、Ｔ４
ＤＮＡ连接酶、硫酸卡那霉素、质粒 ＤＮＡ 小量抽提试
剂盒、ＤＮＡ胶回收试剂盒和 ＰＣＲ 产物纯化试剂盒
购自 Ｓａｎｇｏｎ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记山羊
抗兔 ＩｇＧ购自 Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司；微晶纤维素（Ｔｙｐｅ ５０）
购自 Ｓｉｇｍａ⁃Ａｌｄｒｉｃｈ公司。
１􀆰 ２　 重组表达载体 ｐＥＴ３５ｂ（＋） Ｚ Ｃｙｓ的构建
１􀆰 ２􀆰 １　 引物设计
根据质粒 ｐＥＺＺ１８ 上 Ｚ基因片段的编码序列设
计引物扩增序列，引物如下。 上游引物 ＵＺ：５′ ＴＣ⁃
ＣＣＣＧＣＧＧＣＧＧＴＡＧＡＣＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣ ３′，下游
引物 ＤＺ： ５′ ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＣＡＴＴＴＣＧＧＣＧＣＣＴＧＡＧ⁃
ＣＡＴＣ ３′。 根据质粒 ｐＥＴ３５ｂ（＋）的多克隆位点，在
上游引物中引入 ＳａｃⅡ酶切位点，为保证开放阅读
框（ＯＲＦ）不变，在 ＳａｃⅡ酶切位点后添加 ２ 个碱基
ＣＧ；在下游引物中引入 ＸｈｏⅠ酶切位点，并在 ＸｈｏⅠ
酶切位点后引入 Ｃｙｓ反密码子 ＡＣＡ。
根据质粒 ｐＥＴ３５ｂ（ ＋）上 ＣＢＤ 基因片段的编码
序列设计引物扩增序列，引物如下。 上游引物 ＵＣ：
５′ ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＣ⁃
ＴＣＴＡＡＣ ３′，下游引物 ＤＣ：５′ ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴ⁃
ＧＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＴ ３′。
１􀆰 ２􀆰 ２　 ＰＣＲ扩增 Ｚ序列
将合成的引物用超纯水稀释成终浓度为 １０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，进行温度梯度 ＰＣＲ，通过琼脂糖凝胶电泳
分析扩增产物，选择确定最佳退火温度。 质粒
ｐＥＺＺ１８ ６ μＬ，引物 ＵＺ和 ＤＺ各加入 １２ μＬ，１０×ＰＣＲ
缓冲溶液（含 ＭｇＣｌ２ ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ） ３０ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ） ６ μＬ，Ｔａｑ ｐｌｕｓ ＤＮＡ 聚合酶 （ ５ Ｕ ／ μＬ） ６
μＬ，加超纯水补足 ３００ μＬ，分 ６ 管进行 ＰＣＲ 扩增。
扩增条件：９５ ℃预变性 ５ ｍｉｎ，随后进行 ９５ ℃ ３０ ｓ，
５９ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ３０ ｓ，共 ３５个循环，结束前 ７２ ℃延
３５　 第 ３期 朱文杰等：融合蛋白 ＣＢＤ ＳＰＡ“Ｚ”基因的构建、表达与活性鉴定
伸 ５ ｍｉｎ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 目的片段的连接
合并扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳。 由于质
粒 ｐＥＺＺ１８中有连续的 ２ 段 Ｚ 序列，预计扩增结果
会产生 Ｚ和 ＺＺ 大小 ２ 条条带，用 ＤＮＡ 胶回收试剂
盒回收扩增产物中的 Ｚ条带；分别用 ＳａｃⅡ和 ＸｈｏⅠ
双酶切扩增产物及质粒 ｐＥＴ３５ｂ（＋），用 ＰＣＲ产物纯
化试剂盒纯化酶切产物；将回收的片段和载体用 Ｔ４
ＤＮＡ连接酶于 １６ ℃连接过夜。
构建的重组表达载体命名为 ｐＥＴ３５ｂ（ ＋） Ｚ
Ｃｙｓ，其质粒图谱如图 １所示。
图 １　 重组 ｐＥＴ３５ｂ（＋） Ｚ Ｃｙｓ质粒图谱
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｍａｐ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ３５ｂ（＋） ⁃Ｚ⁃Ｃｙｓ
１􀆰 ２􀆰 ４　 转化与筛选
取 １００ μＬ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＤＨ５α感受态细胞于冰浴上融
化，加入连接液，轻轻吹打混匀，继续冰浴 ３０ ｍｉｎ，将
菌液放入 ４２ ℃水浴中热激 ９０ ｓ，立即放入冰浴中 ２
ｍｉｎ，加入 ９００ μＬ ＬＢ培养基（提前预热至 ３７ ℃），于
３７ ℃恒温摇床上温育 １ ｈ， 将菌液离心，留 ２００ μＬ
上清将菌体打散，均匀涂布于含 ０􀆰 １ ｍｇ ／ ｍＬ 硫酸卡
那霉素的 ＬＢ琼脂平板表面，平板于 ３７ ℃倒置培养
过夜。 用菌液 ＰＣＲ筛选阳性菌落，将鉴定呈阳性的
菌液用质粒 ＤＮＡ 小量抽提试剂盒提取质粒，利用
ＰＣＲ进一步验证筛选，排除假阳性菌落后，将鉴定
呈阳性的对应菌液送至 Ｓａｎｇｏｎ 公司测序，并将测序
正确的重组质粒命名为 ｐＥＴ３５ｂ（＋） Ｚ Ｃｙｓ。
１􀆰 ３　 重组质粒 ｐＥＴ３５ｂ（＋） Ｚ Ｃｙｓ的表达
将阳性重组质粒转化 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）感受
态细胞，涂布于含 ０􀆰 １ ｍｇ ／ ｍＬ 硫酸卡那霉素的 ＬＢ
琼脂平板表面。 挑取单菌落接种于含有硫酸卡那
霉素（０􀆰 １ ｍｇ ／ ｍＬ）的 １０ ｍＬ ＬＢ液体培养基中，于 ３７
℃培养过夜。 按 １ ∶１００的比例取过夜培养液转接到
含有硫酸卡那霉素（０􀆰 １ ｍｇ ／ ｍＬ）的新鲜 ＬＢ 液体培
养基中，于 ３７ ℃摇床培养至 ＯＤ 值为 ０􀆰 ６ ～ １􀆰 ０，分
别加入浓度为 ０、０􀆰 ６、０􀆰 ８、１􀆰 ０、１􀆰 ２ 和 １􀆰 ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
的 ＩＰＴＧ，于 ３７ ℃下诱导培养 ５ ｈ。 离心收集菌体，
以 １０ ｍＬ ／ ｇ（湿质量）加入破碎缓冲液（５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
Ｔｒｉｓ、１５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ ８􀆰 ３）重悬，在冰水混合液
中进行超声破碎（４００ Ｗ，破碎 ６ ｓ，停 １０ ｓ），离心取
上清液，进行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳分析。
１􀆰 ４　 重组蛋白的活性鉴定
重组菌于 ３７ ℃恒温摇床培养至 ＯＤ值为 ０􀆰 ６ ～
１􀆰 ０后，加入一定浓度的 ＩＰＴＧ，在 ３７ ℃下诱导培养
５ ｈ。 离心收集菌体，以 １０ ｍＬ ／ ｇ（湿质量）加入破碎
缓冲液进行重悬，在冰水混合液中进行超声破碎，
离心取上清液。
１􀆰 ４􀆰 １　 重组蛋白与 ＩｇＧ结合活性的鉴定
取蛋白上清液稀释至一定倍数，进行 ＳＤＳ
ＰＡＧＥ电泳分析，进而将蛋白转移到硝酸纤维素膜
上。 使用浓度为 ５％ 的蛋白液封闭后，用 １ ０００ 倍
稀释的 ＨＲＰ 标记的山羊抗兔 ＩｇＧ 作为示踪抗体孵
育 ２ ｈ，用 ＴＢＳＴ （０􀆰 ０１ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ、 ０􀆰 １５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＮａＣｌ、体积分数 ０􀆰 ０５％ 吐温 ２０，ｐＨ ７􀆰 ５）洗涤后，用
二氨基联苯胺（ＤＡＢ） 作为显色底物进行显色，观察
结果。
１􀆰 ４􀆰 ２　 重组蛋白与纤维素结合活性的鉴定
用磷酸缓冲液（ＰＢＳ） （１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ 、３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＫＣｌ，
ｐＨ ７􀆰 ４）作为平衡液，利用恒流泵以流速 ２ ｍＬ ／ ｍｉｎ
进行校准洗涤微晶纤维素层析柱。 待电脑核酸蛋
白检测仪的 ２８０ ｎｍ的吸光度值稳定以后，破碎菌体
上清液以流速 ２ ｍＬ ／ ｍｉｎ 上样，待流穿峰过后，用
ＰＢＳ洗涤层析柱至吸光度值稳定。 利用 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
Ｔｒｉｓ ／ ＮａＯＨ（ｐＨ １２􀆰 ５）进行洗脱，收集吸光度值最大
峰值处的蛋白洗脱液。 把收集的洗脱液和原上清
液、流穿液稀释到一定浓度后进行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 电
泳分析。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 目的基因片段的获得及阳性克隆的鉴定
以质粒 ｐＥＺＺ１８ 为模板， ＵＺ ／ ＤＺ 为引物进行
ＰＣＲ扩增的 Ｚ 基因片段，预计有 ２ 条长度分别为
３５１和 １７７ ｂｐ的 ＤＮＡ 条带（图 ２）。 在琼脂糖凝胶
电泳泳道 １ 中， 在 １００ ～ ５００ ｂｐ 间有 ２ 条明显的条
带（图 ２ （ ａ））。 该结果与预期的相符，说明质粒
４５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
ｐＥＺＺ１８中带有 Ｚ基因片段。 以质粒 ｐＥＴ３５ｂ（＋）为
模板，ＵＣ ／ ＤＣ 为引物进行 ＰＣＲ 扩增的 ＣＢＤ 基因片
段， ＤＮＡ长度应为 ４７１ ｂｐ。 在琼脂糖凝胶电泳泳道
２中，在 ５００ ｂｐ附近有 １条明显的条带（图 ２ （ａ）），
该结果与预期的相符，说明质粒 ｐＥＴ３５ｂ（ ＋）中带有
ＣＢＤ基因片段。
把构建好的重组质粒 ｐＥＴ３５ｂ（ ＋） Ｚ Ｃｙｓ 在
１６ ℃下进行双酶切，结果见图 ２（ｂ）。 由图 ２（ｂ）可
知，在 １００～２５０ ｂｐ间有 １ 条明显的条带，说明构建
的重组质粒中成功连接入了 Ｚ 基因片段。 以重组
质粒 ｐＥＴ３５ｂ（＋） Ｚ Ｃｙｓ为模板，ＵＣ ／ ＤＺ为引物进
行 ＰＣＲ扩增的 ｐＣＢＤ Ｚ基因片段，其 ＤＮＡ 长度应
为 ６９０ ｂｐ。 结果如琼脂糖凝胶电泳泳道 ２ 所示，在
５００～ ７５０ ｂｐ 间有 １ 条明显的条带（图 ２ （ｂ））。 结
果与预期的相符，说明成功构建了含有 ｐＣＢＤ Ｚ目
的基因片段的重组质粒。
（ａ） Ｍ—ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ； １—以质粒 ｐＥＺＺ１８为模板的 ＰＣＲ产物；２—以质粒 ｐＥＴ３５ｂ（＋）为模板的 ＰＣＲ产物
（ｂ） Ｍ１—１ｋｂ ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ；１—重组质粒 ｐＥＴ３５ｂ（＋） Ｚ Ｃｙｓ双酶切产物；
２—重组质粒 ｐＥＴ３５ｂ（＋） Ｚ Ｃｙｓ 的 ＰＣＲ产物；Ｍ２—ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ
图 ２　 ＰＣＲ电泳分析及重组质粒 ｐＥＴ３５ｂ（＋） Ｚ Ｃｙｓ的双酶切分析
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
　 　 ＳＰＡ的 Ｂ结构域通过 Ｃ 末端残留的多肽链，结
合邻近 ＩｇＧ的 Ｆｃ 端［１６］。 因而，选择将 ＳＰＡ 改造后
的 Ｚ结构域插入到质粒 ｐＥＴ３５ｂ（＋）中 ＣＢＤ 的 Ｃ 末
端，并新增 １个 Ｃｙｓ，设计了全长为 ６９０ ｂｐ 的基因重
组序列，成功构建了 ｐＥＴ３５ｂ（ ＋） Ｚ Ｃｙｓ 融合表达
载体。
２􀆰 ２　 ＣＢＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ融合蛋白的表达
载有重组质粒 ｐＥＴ３５ｂ（ ＋） Ｚ Ｃｙｓ 的 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
ＢＬ２１ 在 ＯＤ 值达到 ０􀆰 ６ ～ １􀆰 ０ 后，经不同浓度的
ＩＰＴＧ诱导表达 ５ ｈ 后，超声破碎并收集菌体蛋白，
稀释至一定浓度后进行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 电泳分析。 结
果表明，在 ＩＰＴＧ 的诱导下，目的蛋白得以表达，与
预期的蛋白相对分子质量 ２􀆰 ５３ ×１０４相符（图 ３）。
由图 ３可知：随着 ＩＰＴＧ 浓度的增加，重组蛋白的表
达量也随之增加，在浓度为 ０􀆰 ８ ～ １􀆰 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，表
达量最高，并且不随 ＩＰＴＧ 浓度的增大而继续增加，
表达量基本不变。 实验最后确定本重组菌在 ＯＤ 值
达到 ０􀆰 ６～ １􀆰 ０ 后，选用浓度为 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＩＰＴＧ
进行诱导表达的结果最佳。
Ｍ—标准蛋白；１～６—不同浓度 ＩＰＴＧ诱导融合表达的蛋白
图 ３　 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳分析不同 ＩＰＴＧ浓度诱导
ＣＢＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ融合蛋白的表达量
Ｆｉｇ􀆰 ３　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＢＤ⁃Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ ｆｕｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ
ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＩＰＴＧ
２􀆰 ３　 ＣＢＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ融合蛋白与 ＳＰＡ结合活性鉴定
为证明 ＣＢＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ 融合蛋白具有与 ＩｇＧ的
结合活性，选取了 ＨＲＰ 标记的山羊抗兔 ＩｇＧ 进行
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析，结果见图 ４，如果存在能被显色
５５　 第 ３期 朱文杰等：融合蛋白 ＣＢＤ ＳＰＡ“Ｚ”基因的构建、表达与活性鉴定
且蛋白相对分子质量与预期相符的蛋白条带，则说
明表达的融合蛋白具有与 ＩｇＧ 结合的活性。 由图 ４
可知：在蛋白相对分子质量为 ２􀆰 ５×１０４的附近，有 １
条与目的蛋白相对分子质量相符的明显显色条带，
说明经 ＩＰＴＧ诱导表达后的重组蛋白具有与 ＩｇＧ 的
结合活性。
Ｍ—标准蛋白；１—重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ 菌体
上清可溶性蛋白；２—Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１空菌上清蛋白
图 ４　 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 鉴定 ＣＢＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ融合
蛋白与 ＩｇＧ的结合活性
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＢＤ⁃Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ
ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＩｇＧ
重组质粒可表达相对分子质量为 ２􀆰 ５３ ×１０４的
重组蛋白。 这种 ＳＰＡ重组蛋白相对分子质量小，易
表达的同时能降低菌体生产强度。 该重组蛋白具
有与 ＩｇＧ 结合的特异性，末端带有的 Ｈｉｓ 肽段并不
影响 Ｚ 结构域的生物活性，可用于表达蛋白的纯
化，事后可以用酶切除。 改造后的 Ｚ 结构域能使
ＩｇＧ的洗脱条件变得温和，保护 ＩｇＧ 的蛋白质活性
不受影响，可作为一种较为理想的分离和纯化 ＩｇＧ
的材料。
２􀆰 ４　 ＣＢＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ融合蛋白与纤维素结合活性
鉴定
　 　 重组菌超声破碎上清中的 ＣＢＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ融合
蛋白通过微晶纤维素亲和层析柱，结果见图 ５，如果
在流穿液中的目的蛋白条带消失或变淡，且洗脱液
中存在目的蛋白条带，则说明表达的蛋白具有与纤
维素结合的活性。 由图 ５ 可知：在与纤维素作用后
的流穿液中，重组蛋白条带明显变淡，而洗脱液中
存在蛋白相对分子质量与目的蛋白相符的蛋白条
带，说明经 ＩＰＴＧ 诱导表达后的蛋白具有与纤维素
结合的活性。
Ｍ—标准蛋白；１—重组菌超声破碎上清可溶性蛋白泳道
２—流穿液；３—洗脱液
图 ５　 ＣＢＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ融合蛋白与
纤维素的结合活性鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＢＤ⁃Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ ｆｕｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
重组质粒表达的融合蛋白在 ＣＢＤ 的活性作用
下作为亲和层析配基使用时，能定向伸展在基质外
侧，这样的顺向分子能够提高 ＩｇＧ 的载量。 据相关
研究发现，末端新引入的—ＳＨ 能结合并活化介质，
增加对 ＩｇＧ的吸附容量［１７］，提高蛋白配基的使用效
率。 使用的基质纤维素具有一定的刚性，抗压性能
良好，上样流速能有一定幅度的提高，能够缩短纯
化时间，提高工作效率。 这些效能可以通过与单纯
的 ＳＰＡ或 Ｚ结构域蛋白的比较得以体现。
３　 结　 论
针对传统 ＳＰＡ亲和层析存在的使用效率低、抗
压性能较差以及毒性残留等问题，设计出一种新的
免疫亲和材料。 构建的含有 ＣＢＤ和 Ｚ基因的质粒，
经转化得到的重组菌表达出的重组融合蛋白 ＣＢＤ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ，其活性检测结果证明具有 ＩｇＧ 和纤维素
的结合活性。
对于将来作为工程菌的蛋白表达条件，本研究
仅具体探究了诱导剂浓度对蛋白表达作用的影响，
并没有对其他表达条件做深入探究。 本研究也为
利用基因工程等技术生产应用型 ＳＰＡ 提供了一条
新的借鉴思路。
６５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
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（责任编辑　 荀志金）
７５　 第 ３期 朱文杰等：融合蛋白 ＣＢＤ ＳＰＡ“Ｚ”基因的构建、表达与活性鉴定