全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&& 年 && 月
生"物"加"工"过"程
)8DEAJA+B=@EG>BC-DBU@BXAJJ0EFDEAA@DEF
fB>;! ,B;#
,Ba;$%&&
IBD%&%;!#!2P;DJJE;$ <#43;$%&&;%#;%%1
收稿日期%$%&& <%( <%
基金项目%国家重点基础研究发展计划 "!4 计划#资助项目 "$%%4)-4&1%1#&教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目
"$%&%$$&&$%%%4#
作者简介%陈"飞"&!3$#$男$河南汝南人$博士研究生$研究方向%有机酸发酵的代谢调控&徐"虹"联系人#$教授$0*HGD>% =`8gEP=?;AI=;XE
低成本绿色循环工艺发酵生产丙酸联产维生素 8
DB
陈"飞&$张"力$$冯小海&$吴"波&$徐"虹&
"&;南京工业大学 食品与轻工学院 材料化学工程国家重点实验室$南京 $&%%%!&
$;北京三鸣中食科技发展有限公司$北京 &%%%$4#
摘"要%对提取维生素-
&$
后的费氏丙酸杆菌废菌体进行水解处理$考察以菌体水解液作为,源用于丙酸发酵的可
行性( 利用正交设计得到了提取维生素-
&$
后的废菌体水解优化条件( 基于此$构建利用植物纤维床反应器固定
化生产丙酸联产维生素 -
&$
的低成本绿色循环工艺( 结果表明%在 1c( .的发酵体系中$单批次总糖质量浓度为
$%% F2.$发酵进行了 ( 批次共 & &!$ 8$丙酸生成总量为$ $3c4( F$单批次丙酸质量浓度 &%c(% F2.$丙酸生产效率
达 %c1 F2".$8#$干菌质量浓度达到 &!c($ F2.( 将菌体注入微好氧发酵罐中发酵获得 &&$c3 HF2.维生素-
&$
(
关键词%植物纤维床反应器&费氏丙酸杆菌&丙酸&维生素-
&$
&废菌体
中图分类号%b5!$&$ b5!$1""""文献标志码%L""""文章编号%$ <#43"$%&&#%# <%%&( <%#
%400/5/G./0Z90/1.A0:.4:365F.2/942:0117249429.2/.:5:.G5/GA.F5I./8
DB
942G3:F.2/JL 7%$3+$4+829&%+):;%&)1&4%&+2"+,,E,,RBC\CDW
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GEI .DF8?OEI=J?@V$ ,GEPDEFREDaA@JD?VBCbAX8EB>BFV$ ,GEPDEF$&%%%!$ )8DEG& $;-ADPDEF
Y=EHAEX8DEG]BBI bAX8EB>BFV/AaA>BUHAE?)B;.?I;$ -ADPDEF&%%%$4$ )8DEG#
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JB=@XACB@U@BUDBEDXGXDI CA@HAE?G?DBE;b8ABU?DHD7DEFXBEID?DBEJBC6GX?A@DG8VI@B>VJDJ\A@AIA?A@HDEAI
6V?8AB@?8BFBEG>IAJDFE;-GJAI BE ?8AG6BaA@AJ=>?J$ GE DHHB6D>D7AI CA@HAE?G?DBE =ED?\D?8 U>GE?CD*
6@B=J*6AI 6DB@AGX?B@"9]-# XBH6DEAI \D?8 HAH6@GEAJAUG@G?DBE \GJXBEJ?@=X?AI GEI GUU>DAI DE ?8APBDE?
U@BI=X?DBE BCU@BUDBEDXGXDI GEI aD?GHDE -
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&$
&
\GJ?AXA>J
""丙酸作为一种重要的大宗化学品$与其衍生物
被广泛应用于食品)饲料)橡胶和医药等领域*&+ (
目前$丙酸的工业化生产方法主要是化学合成法$
而发酵法制备丙酸具有环境温和)原料来源丰富$
因此受到越来越多的关注( 但是$发酵法制备丙酸
的生产效率较低及过程经济性较差使该法受到诸
多限制( 如何提高丙酸生产效率与生产过程的整
体经济性是当前研究的重点( 生物法制丙酸的主
要菌种为丙酸杆菌$该菌在产丙酸的同时可以在胞
内富集高附加值副产物维生素 -
&$
"f-
&$
#
*$+
( 但两
者生产条件差异较大"前者厌氧发酵$后者微需氧
发酵#$之前很多研究一般都将两者分开生产$舍弃
其一$造成很大浪费*$ <1+ ( 5=AJGIG等*(+ 利用厌
氧 微通氧两步发酵构建了一种游离细胞连续发酵
丙酸联产f-
&$
的装置$结果丙酸和f-
&$
的质量浓度
分别达到 &4c4 F2.和 1! HF2.( 但该过程中获得的
$ 种产物产量和产率都较低$与工业化目标相距甚
远$所以仍需开发出更高效的工艺来提高产品的系
统经济性(
笔者所在课题组在前期研究中构建了一种植
物纤维床反应器"9]-#与膜分离结合生产丙酸的装
置*#+ $分别利用9]-提高菌体耐受能力与膜分离消
除终产物抑制的优点$显著提高了批次发酵丙酸的
生产效率$同时菌体也得以大量累积( 菌体浓度的
增加使得胞内f-
&$
的产量也相应增加$因此利用该
装置可以在生产丙酸的同时联产 f-
&$
( 此外$在提
取f-
&$
的过程中需要破碎细胞$而提取后的废液中
含有丰富的,源$如果任其排放$会造成大量有机,
源的损失和环境的污染( 若能将废细胞加以处理
作为,源用于丙酸与f-
&$
的生产$不仅能大量减少
发酵成本$还可在一定程度上减少环境污染$从而
达到丙酸联产 f-
&$
的绿色清洁生产( 目前已有利
用菌体自身水解液做 ,源进行相关代谢物合成的
报道*4 <3+ (
笔者通过对丙酸杆菌废菌体水解液的研究$
使其能被自身细胞利用生产丙酸并且联产 f-
&$
$
以期显著提高这一生物炼制过程的系统经济性(
D?材料与方法
DND?菌株及其培养基
费氏 丙 酸 杆 菌 " 4%$1+$5+607&%+)8 9%&)/&5A
%&+0"+#$由笔者所在实验室筛选并保藏于中国典型
培养物保藏中心$登记号为 ))b))T$%4%&($目前
该菌株已获国家发明专利授权*!+ ( 培养基配方及
培养条件参考文献*#$&%+(
DNB?<8
DB
提取与菌体水解条件
f-
&$
发酵结束后$发酵液离心$然后用纯水将沉
淀菌体按 &p1"F2.#稀释$沸水浴 &3 HDE后再离心$其
中上清液为f-
&$
液$沉淀为废菌体( 通过对稀释倍数
"&p$)&p1)&p#和 &p3"F2.##$UN"&c%)c%)!c% 和
&$c%#)温度"#%)3%)&%% 和 &$% l#以及水解时间
"&()%)#%和 &$% HDE#进行正交试验$进一步研究废
菌体的水解条件$得到最佳的菌体水解条件$使菌体
水解液能较好地被丙酸杆菌作为发酵,源利用(
DNQ?丙酸联产<8
DB
低成本绿色循环工艺的构建
""按照文献*#+构建9]-反应器与中空纤维膜联
用发酵生产丙酸的装置$在此基础上加上生产 f-
&$
的微好氧发酵罐与提取 f-
&$
的沸水浴装置$从而构
建了丙酸联产f-
&$
的低成本绿色循环工艺装置"图
&#$操作流程如下%&#在上一批的f-
&$
发酵完成后$
将提取 f-
&$
后的废菌体按照 &c$ 优化后的水解条
件进行水解$菌体水解液做 ,源"加入量参考原培
养基中氨基氮与总氮的量#$其他操作类似于文献
*#+( 重复以上操作在9]-反应器中进行 ( 批次的
丙酸发酵( $#待 ( 批次丙酸发酵全部结束后$开启
中空纤维膜将厌氧发酵罐中的发酵液排出$利用恒
流泵将含有 1% F2.葡萄糖的新鲜培养基通过中空
纤维膜组件泵入微好氧发酵罐中"通入 %c& .2HDE
的 &p&的,
$
与空气混合气体#$进行f-
&$
的发酵$利
用恒流泵维持葡萄糖质量浓度在 &% F2.左右$直到
葡萄糖总质量浓度达到 $%% F2.时$停止补料( 发
酵液离心)收集菌体$沸水浴破碎菌体)离心$上清
液提取f-
&$
$沉淀物再次水解作为下一批发酵用的
,源$依次循环(
#& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 D?丙酸联产<8
DB
低成本绿色循环装置
O.;=D?!T0F:-I592762MHA5630]2./F;400/:.4H704I0/F5F.2/279429.2/.:5:.G5/G<8
DB
DNV?分析方法
葡萄糖)游离细胞干质量及有机酸含量的检测
参照文献*&%+$氨基氮和总氮量的检测分别采用甲
醛滴定法与凯氏定氮法( 采用 LFD>AE?&$%% 型高效
液相色谱仪测定f-
&$
$色谱柱为SG?A@JL?GE?DJI)&3
柱 "(
$
H$1c# HH o$(% HH#&流动相
"
为乙腈$
流动相
%
为 N^
$
9[
1
缓冲液 "N
9[
1
调 UN$c3#&梯
度洗脱%% k( HDE 为体积分数 &(h乙腈恒速洗脱$
( k&( HDE为 &(h k%h乙腈&流动相流速 &c%
H.2HDE&进样量 $%
$
.&柱温 % l(
B?结果与讨论
BND?丙酸杆菌废菌体做$源发酵生产丙酸的可行
性分析
""称取提取f-
&$
后的废菌体$根据课题组的前期
相关实验数据$废菌体用量为 4c% F2.$加 & 倍体积
水稀释$然后将稀释液调 UN至 &c%$在 !% l下水解
% HDE后$调 UN至 #c!)1% F2.的葡萄糖作为 )源
摇瓶厌氧发酵 &#% 8$结果如表 & 所示(
表 D?菌体水解液和普通氮源为$源的发酵结果
E5J60D?,2I954.12/27704I0/F5F.2/40136F131./; M51F0:06-LG426L15F024:2II2//.F42;0/1234:051/.F42;0/1234:0
,源
"
"细胞干质量#2"F!.<&# 发酵时间28
"
"丙酸#2"F!.<&#
"
"乙酸#2"F!.<&#
"
"琥珀酸#2"F!.<&#
废菌体水解液 !c&$ &#% &&c3( &c33
普通氮源 3c%( &$% &1c(3 c&& &c%&
"注%$ 种批次发酵所用)源均为 1% F2.葡萄糖&普通氮源为 &% F2.酵母浸膏和 ( F2.酪蛋白胨(
""由表 & 可知%以菌体水解液为 ,源时$丙酸质
量浓度为 &&c3( F2.$副产物中只有少量的乙酸$丙
酸占总有机酸比例达 3#c$!h&而相同条件下$采用
普通有机,源发酵时$丙酸质量浓度为&1c(3 F2.$
高于前者$但丙酸所占总有机酸比例为 44c!4h$低
于菌体水解液做,源的结果( 值得注意的是$菌体
水解液做,源可以得到更高的菌体浓度$而研究发
现较高的菌体浓度对于丙酸发酵是有利的*&$+ ( 结
果表明$丙酸杆菌废菌体做 ,源发酵生产丙酸在方
案上是可行的(
BNB?正交试验优化废菌体水解条件
因此$进一步优化水解条件$使废菌体水解液
能够更好的被丙酸杆菌利用$发酵生产丙酸是有必
要的( 根据 &c$ 的方法进行正交水解后$将废菌体
配制至 4 F2.并调 UN至 #c!$加入无机盐于 &$% l
灭菌 &( HDE$以 1% F2.葡萄糖作为)源发酵生产丙
酸$结果如表 $ 所示(
根据表 $ 结果$作B值图"图 $#对其结果进行
分析( 由图 $ 可知%最佳水解条件 #% l)UN&c%)水
解时间 % HDE)水解稀释倍数 &p1"F2.#( 其中$水
4&
"第 # 期 陈"飞等%低成本绿色循环工艺发酵生产丙酸联产维生素-
&$
解 UN和稀释倍数是显著的影响因子$水解温度中
#% l略优于 &$% l$考虑到 &$% l能将水解和灭菌
一步完成$根据正交试验可推测在 &$% l水解的产
酸效率高于 #% l$且根据图 $ 需要进一步确认低于
#% l水解情况是否更优以及需要进一步确认最佳
水解条件( 在 UN&c%)温度 #% 和 &$% l下稀释倍
数&p)&p1)&p("F2.#水解 % HDE 后$调 UN至 #c!
后$&$% l灭菌 &( HDE&&$% l)&p1"F2.#同等条件
水解后直接在无菌环境下$调 UN至 #c! 后不再灭
菌做,源的发酵比较$结果如表 ( 由表 可知%
&$% l$&p1"F2.#同等条件水解后直接在无菌环境
下调 UN至 #c! 后不再灭菌与水解后再次灭菌的结
果近似( 此次实验得到相对较优的菌体水解条件%
UN&c%$稀释倍数&p( "F2.#$水解温度 &$% l(
BNQ?水解时间和废菌体用量的确定
由于常规灭菌为 &$% l$&% k&( HDE$为了能够
达到成本最小)效率最高的优化条件$需要对以上
条件中水解时间进行确定$能否减少高温水解的时
间$达到操作成本的最优化$所以在 UN&c% 下$稀释
倍数为 &p( "F2.#$在 &$% l水解 &%)&()$%)$( 和
% HDE$以 1% F2.葡萄糖为)源发酵 $&# 8( 由图
"G#可知%当水解时间为 $% HDE 时$丙酸产量最高$
生物量也比较理想$因此确定水解时间为 $% HDE(
表 B?菌体水解液做$源发酵生产丙酸正交试验结果
E5J60B?+4F-2;2/560Z904.I0/F27704I0/F5F.2/27
9429.2/.:5:.GM.F-J5:F04.56-LG426LS5F0
51F-0/.F42;0/1234:0
试验号
因素
温度2
l
UN
时间2
HDE
稀释倍数2
"F!.
<&
#
"
"丙酸#2
"F!.
<&
#
& #% & &( &p$ &$c%#
$ 3% % &p1 &&c%%
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1 &$% &$ &$% &p3 !c##
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&# &$% & #% &p1 &1c%1
图 B?菌体水解液为$源发酵生产丙酸的正交试验<值图
O.;=B?<5630K2724F-2;2/560Z904.I0/F27704I0/F5F.2/279429.2/.:5:.GM.F-J5:F04.56-LG426LS5F0
""以菌体水解液为 ,源时丙酸的生产效率较低
"表 &#$而通过凯氏定氮法和甲醛法检测常规 ,源
中的质量分数 &%h酵母膏和 (h的酪蛋白胨$在发
酵培养基中的总氮量和氨基氮量分别为 &c#( 和
%c#$( F2.$而 4 F2.菌体水解液中的总氮量和氨基
氮仅为 %c#%4 和 %c$3 F2.( 因此判定%是由于废菌
体使用量不足造成发酵效率低( 以 1% F2.葡萄糖
为)源$对废菌体的使用量作了进一步的确定$分
别使用 4)&&)&()&! 和 $ F2.的菌体浓度以确认最
佳菌体使用量( 由图 "6#可知%最适水解废菌体用
量为 &( F2.$此时丙酸产量与生物量都是令人满
意的(
3& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 Q?进一步优化水解条件的发酵结果
E5J60Q?O04I0/F5F.2/27F-0734F-0429F.I.S5F.2/27-LG426L1.1:2/G.F.2/1
灭菌方法 温度2l
稀释倍数2
"F!.
<&
#
"
2"F!.
<&
#
丙酸 乙酸 细胞量
水解后
灭菌
&p &1c($ $c&3 4c%3
#% &p1 &1c3 $c%# 4c(1
&p( &1c( &c3! 4c%#
&p &#c#$ $c(3 1c34
&$% &p1 &#c#1 $c#4 1c$3
&p( &3c% $c33 1c!
只水解
不灭菌 &$% &p1 &(c34 $c#$ 4c$
图 Q?水解时间优化及菌体用量的确定
O.;=Q?+9F.I.S5F.2/27-LG426L1.1F.I05/GF-05I23/F127J5:F04.56-LG426LS5F0
图 V?XO8反应器与膜组件联用以菌体水解液作为
$源的多批次丙酸发酵曲线
O.;=V?R36F.HJ5F:-:2396./; 704I0/F5F.2/M.F-XO85/G
-262M7.J04I0IJ04M.F-J5:F04.56-LG426LS5F0
51/.F42;0/1234:0
BNV?低成本绿色循环工艺发酵生产丙酸联产<8
DB
按照 &c 所示方式发酵联产丙酸 f-
&$
并进行
菌体碎片收集$将得到的f-
&$
菌体沸水浴 &3 HDE后
离心$上清液为 f-
&$
液$将沉淀稀释 &p( "F2.#倍
后$调 UN至 &$于 &$% l水解 $% HDE 作为 ,源$废
菌体用量为 &( F2.( 使用 9]-反应器与膜组件联
用$利用以上条件处理后的菌体水解液为 ,源$葡
萄糖为)源进行多批次丙酸发酵$结果如图 1 所
示( 单批次葡萄糖质量浓度为 $%% F2.$发酵
& &!$ 8"含 1 次中空纤维膜分离及新鲜培养基泵入
时间$约 # 82次#$丙酸生成总量达 $ $3c4( F"发
酵体积 1c( .#$单批次丙酸质量浓度 &%c(% F2.$
丙酸生产效率 %c1 F2".!8#( 丙酸对葡萄糖转化
率为 (&c4(h$丙酸占总有机酸比例高达 !%c%$h(
随着分离联用发酵的进行$菌体浓度逐渐增加$干
菌质量浓度达到 &!c($ F2.$将菌体注入微好氧发酵
罐中$并在培养基中添加适量前体物质 ($# 二甲基
苯并咪唑和甘氨酸发酵生产 f-
&$
*(+
$&&# 8 后得到
&&$c3 HF2.f-
&$
"图 1 中未显示#(
此结果与文献*(+相比不但改进了丙酸生产单
元$大幅提高了丙酸的产量$也使得 f-
&$
生产单元
的生产水平有了质的提高( 推测绿色循环工艺高
效的原因$除了装置本身分别具有提高菌体对于有
机酸耐受能力和膜分离消除终产物抑制的优点外$
可能还要部分归因于利用自身菌体水解液为 ,源$
可以很大程度上满足菌体自身代谢以及目标产物
!&
"第 # 期 陈"飞等%低成本绿色循环工艺发酵生产丙酸联产维生素-
&$
丙酸和f-
&$
合成的需求(
Q?结?论
对提取f-
&$
后的废弃菌体碎片进行水解并发酵
生产丙酸,源的条件进行研究$由此构建丙酸联产
f-
&$
低成本绿色循环工艺反应器( 以提取f-
&$
后的
废菌体水解液做,源$葡萄糖做)源$使用9]-反应
器与膜分离联用装置发酵单批次总糖质量浓度为
$%% F2.$发酵 ( 批次 & &!$ 8$单批次丙酸质量浓度
&%c(% F2.$丙酸生产效率%c1 F2".!8#( 丙酸对葡
萄糖转化率达 (&c4(h$丙酸占总有机酸比例达
!%c%$h( 随着分离联用发酵的进行$菌体浓度逐渐
增加$干菌质量浓度达到 &!c($ F2.$将菌体注入微好
氧发酵罐中发酵生产 f-
&$
$得到 &&$c3 HF2.f-
&$
(
该工艺以菌体水解液为,源$原料成本十分低廉$不
仅能够大幅度降低丙酸联产f-
&$
的发酵成本$还可以
在一定程度上减少环境污染$从而达到丙酸联产f-
&$
的低成本绿色循环生产$相信对于促进大宗化学品丙
酸生物炼制的工业化将会产生一定的积极作用(
参考文献%
* & +"9GDW N/$M>G?7-L;9@BUDBEDXGXDI U@BI=X?DBE 6VDHHB6D>D7AI
XA>JBCGU@BUDBEG?A*?B>A@GE?J?@GDE BC4%$1+$5+607&%+)80+/+1%$A
1+$5+0*++;LUU>TDX@B6DB>-DB?AX8EB>$&!!1$1$"&#%$$*$4;
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?GHDE -
&$
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HDE -
&$
C@BHU@BUDBEDXGXDI 6GX?A@DG=EIA@UA@DBIDXaG@DG?DBE BC
IDJJB>aAI B`VFAE XBEXAE?@G?DBE*++;+]A@HAE?-DBAEF$&!!#$3$
"(#%131*1!&;
* 1 +"9DGBKZ$KGHGJ8D?GT$ G^\G@GDX8D,$A?G>;9@BI=X?DBE BCaD?GHDE
-
&$
DE FAEA?DXG>VAEFDEAA@AI 4%$1+$5+607&%+)8 9%&)/&5%&+0"+
*++;+-DBJXD-DBAEF$$%%1$!3"#%*&4;
* ( +"5=AJGIG*)8GE?BL$LCJX8G@LY$SGFEA@];TDX@B6DG>U@BI=X?DBE
BCU@BUDBEDXGXDI GEI aD?GHDE -
&$
=JDEFHB>GJJAJB@J=FG@*++;
LUU>TDX@B6DB>-DB?AX8EB>$&!!1$1&"1#%43*3;
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联用的丙酸发酵工艺研究*++;高校化学工程学报$$%&%$$1
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* 4 +"姚洪文$范玉梅$郭素格;纳米级微生物细胞破碎机在酱油生
产中的应用*++;中国酿造$$%%("(#%%*1;
* 3 +"白雪飞$陈可泉$叶贵子$等;发酵丁二酸过程中废弃细胞的
循环利用*++;生物工程学报$$%&%$$#"!#%&$4#*&$3%;
* ! +"徐虹$洪厚胜$李莎$等;利用费氏丙酸杆菌,Q*1 制备丙酸及
联产维生素 -
&$
的方法%中国$$%%4&%%$%(4!;3 *9+;$%%!*
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国内简讯
郭雄等筛选出大骨节病特征性蛋白
西安交通大学医学院郭雄教授指导博士生马玮娟$与芬兰 =^BUDB大学 TDWWB.GHHD教授合作$在世界
前沿杂志,9e[b0[TO)Y-以.9@B?ABHDXX8GEFAJDE G@?DX=>G@XG@?D>GFABC8=HGE AEIAHDXBJ?ABG@?8@D?DJDE )8DEG/
为题发表了封面论文( 该研究在蛋白水平上阐述了大骨节病与正常人之间的表达差异$筛选出大骨节病特
征性蛋白质及机制通路$为发病机制和分子机制提供了研究基础$并为早期诊断生物标志的发现和治疗靶
标的选择提供了理论依据$具有实际的科学价值(
辽宁省阜新市打造生物柴油林
辽宁省阜新市与香港向威发展有限公司共同开发文冠果生物质能源林产业项目正式签订协议$计划投
资 1c( 亿元( 从文冠果种苗繁育)栽植示范到深加工$进行系列开发$形成产业体系( 文冠果油是一种优良
的生产生物柴油的原料$经水解)甲醇酯化后可提取)转化为生物柴油$用以替代石油能源( 阜新与香港共
同开发的文冠果生物质能源林产业项目$一期投资 &c1 亿元$建设 3 8H$ 的优良文冠果种苗繁育基地$###c4
8H
$ 的高标准文冠果示范林基地$启动建设文冠果深加工基地$可生产生物质柴油和食用油( 一期工程计划
$%&$ 年初破土施工(
"胡晓丽#
%$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"