全 文 ：第 １３卷第 ５期
２０１５年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０５􀆰 ００１
收稿日期：２０１４－０９－２０
基金项目：国家自然科学基金（２１０３６００５）；科技部中欧政府间国际合作专项（１０１７）；浙江省自然科学基金（ＬＺ１４Ｂ０６０００１）
作者简介：丰文飞（１９８７—），女，安徽桐城人，硕士研究生，研究方向：微生物制药；欧志敏（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｏｏｚｚｍｍ＠ ｚｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
冻融产氨棒杆菌细胞转化法制备三磷酸腺苷
丰文飞１，欧志敏１，沈绍传２，贠军贤２
（１􀆰 浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 ３１００３２； ２􀆰 浙江工业大学 化工学院 绿色化学合成技术
国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 ３１００３２ ）
摘　 要：微生物发酵和酶转化法是工业上制备三磷酸腺苷（ＡＴＰ）的有效途径。 以腺嘌呤为关键底物，用冻融通透
化处理的产氨棒杆菌细胞转化制备 ＡＴＰ，用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）法检测 ＡＴＰ 含量，考察各种转化条件对 ＡＴＰ 产
率的影响，确定最优转化条件：菌体用量 ４０ ｇ ／ Ｌ，底物 ６ ｇ ／ Ｌ，葡萄糖 ６０ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４ １５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，
反应液 ｐＨ ７􀆰 ４，反应温度 ３５ ℃。 在最优转化条件下，ＡＴＰ 产率达到 ８５􀆰 ００％，比优化前提高了 ５８％，细胞用量大幅
度降低，优化条件稳定可行。
关键词：产氨棒杆菌；三磷酸腺苷；生物转化；腺嘌呤
中图分类号：ＴＱ９２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０５－０００１－０７
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＴＰ ｂｙ ｐｅｒｍｅａｂｌｅ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ｃｅｌｌｓ
ｗｉｔｈ ｆｒｏｚｅｎ⁃ｔｈａｗｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
ＦＥＮＧ Ｗｅｎｆｅｉ１，ＯＵ Ｚｈｉｍｉｎ１，ＳＨＥＮ Ｓｈａｏｃｈｕａｎ２，ＹＵＮ Ｊｕｎｘｉａｎ２
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３２，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｂａｓｅ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ， ＡＴＰ ｃａｎ ｂｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｒ
ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｎｚｙｍｅｓ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ，ｐｅｒｍｅａｂｌｅ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｆｒｏｚｅｎ⁃
ｔｈａｗｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ＡＴＰ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｉｎｅ ａｓ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ． Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ａｎｄ ＡＴＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｒｏｔｈ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ
ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （ＨＰＬＣ）． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ， ｉ． ｅ．，ｗｅｔ ｃｅｌｌｓ ４０
ｇ ／ Ｌ，ａｄｅｎｉｎｅ ６ ｇ ／ Ｌ，ｇｌｕｃｏｓｅ ６０ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４ １５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ｐＨ ７􀆰 ４ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｔ ３５ ℃ ．Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ，ａｄｅｎｉｎｅ ｗａｓ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｉｎｔｏ ＡＴＰ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ａｂｏｕｔ
８５􀆰 ００％，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ５８％ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｎｅｅｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ
ｐｒｅｓｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｆｒｏｚｅｎ⁃ｔｈａｗｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｅｒｅ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｆｅａｓｉｂｌｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ；ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ａｄｅｎｉｎｅ
　 　 三磷酸腺苷（ＡＴＰ）是生物体内能量交换的中心
物质，在临床上被广泛用于肌肉萎缩、心肌梗塞、肝
炎等疾病和各种急救病症的治疗［１－３］，还具有抗疲
劳的功效，有助于运动员增加能量［４］。 此外，ＡＴＰ
在环保［５］及卫生监测［６］等领域也有广泛应用。 ＡＴＰ
的国内外需求量大，对其进行生物体外合成的研究
具有重要意义。
ＡＴＰ 的传统制备方法有动物肌肉提取法［７］、光
合磷酸法［８］、酶催化合成法［９－１０］ 及一磷酸腺苷
（ＡＭＰ）化学合成法［１１］等，但成本或环境污染等问
题限制了其在工业领域的广泛应用。 近几年，工业
化制备主要集中于微生物转化法或酶转化法，如以
腺苷或 ＡＭＰ 等为主要底物，用啤酒酵母、面包酵母、
产氨棒杆菌和霉菌等微生物可以合成 ＡＴＰ ［１２－１３］。
张国睿等［１４］以腺嘌呤为底物，用固定化酵母转
化合成 ＡＴＰ，细胞用量 ４００ ｇ ／ Ｌ。 Ｔａｎａｋａ等［１５］将产氨
短杆菌 ＡＴＣＣ６８７２接入培养基，在培养的第 ３天投入
腺嘌呤，在上清液中分别生成了 １􀆰 ３７ ｍｇ ／ ｍＬ 的 ＡＴＰ
和一定量的二磷酸腺苷（ＡＤＰ）、ＡＭＰ。 朱家荣等［１６］
用固定化酵母转化腺嘌呤合成 ＡＴＰ。 Ｋａｄｏｗａｋｉｂ
等［１７］用细菌和面包酵母混合发酵，６５％的腺嘌呤转
化为 ＡＴＰ。 程金芬等［１８］用短杆菌 Ｂ１ ７８７和酵母混
合发酵腺嘌呤生产 ＡＴＰ。 Ｆｕｊｉｏ 等［１９－２０］和 Ｍａｒｕｙａｍａ
等［２１］曾用产氨短杆菌 ＫＹ１３５１０ 转化腺嘌呤，细胞用
量 １００ ～ １２０ ｇ ／ Ｌ，又通过添加聚氧乙烯硬脂胺
（ＰＯＥＳＡ）和二甲苯起始酶促反应，以 Ｎａ２ＨＰＯ４作磷
酸基团供体，用发酵法制备 ＡＴＰ，产率为 ８２％。 Ｚｈｕ
等［２２］用霉菌以腺嘌呤为底物合成 ＡＴＰ。 但是，发酵
法生产 ＡＴＰ 反应时间过久，需定时定量投加各种反
应物，为增加细胞通透性还需添加表面活性剂，大量
菌体发酵会消耗过多培养原料，增加投入成本，同时
发酵产物复杂，增加产物的分离难度，整个发酵过程
不可控因素较多，对设备要求较高。 转化法相对来说
简单易行，产物也比较单一，便于后续分离。
笔者以腺嘌呤为底物，不使用表面活性剂，用
冻融通透化处理的产氨棒杆菌 （ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）转化法制备 ＡＴＰ，采用高效液相色谱
（ＨＰＬＣ）法监测产物生成动态。 用单因素试验考察
初始细胞用量、底物浓度、葡萄糖浓度、ＭｇＳＯ４浓度、
ＫＨ２ＰＯ４浓度、反应液 ｐＨ 和反应温度等多种因素对
ＡＴＰ 产量的影响，并设计正交试验优化转化条件，
以提高 ＡＴＰ 产率和底物转化率。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种
Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＣＩＣＣ１０１６８购自中国工业微生
物菌种保藏管理中心。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
固体培养基［２１］（ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０，ＮａＣｌ ５，牛肉
膏 ５，琼脂 ２５。 ｐＨ ７􀆰 ２～７􀆰 ４，１２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。
种子培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０，蛋白胨 １０，酵母
膏 １０，ＮａＣｌ ２􀆰 ５，ＭｇＳＯ４２，ＫＨ２ ＰＯ４１，尿素 ２􀆰 ５。 ｐＨ
７􀆰 ２～７􀆰 ４，１１５ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ。
发酵培养基 （ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ８０，酵母膏 １０，
ＫＨ２ＰＯ４ １５， Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １５， ＭｇＳＯ４ １０， ＣａＣｌ２
０􀆰 １，尿素 ４，ＭｎＳＯ４ ０􀆰 ０２。 ｐＨ ７􀆰 ２～７􀆰 ４，１１５ ℃灭菌
２０ ｍｉｎ。
１􀆰 １􀆰 ３　 主要试剂及仪器
腺嘌呤和 ＡＴＰ 二钠盐，上海生工生物工程有限
公司；色谱纯甲醇，Ｓｉｇｍａ⁃Ａｌｄｒｉｃｈ 公司；其余试剂均
为市售国产分析纯。
Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０型高效液相色谱仪（ＨＰＬＣ），美国
安捷伦公司；ＴＧ１６ ＷＳ 型台式高速离心机，上海卢
湘仪离心机仪器有限公司；ＨＺ ２０１１Ｋ Ａ 型恒温
摇床，太仓市华利达实验设备有限公司。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＣＩＣＣ１０１６８生长曲线
冻干管种子 Ｆ０接种固体培养基，经斜面活化后
作为 Ｆ１代种子，再经斜面活化作为 Ｆ２代。 从 Ｆ２代斜
面挑取少量菌体，接种于种子培养基中，平行 ３个样，
每小时取样 ５００ μＬ，稀释 １０倍至 ５ ｍＬ，于 ６００ ｎｍ处
测定吸光值（ＯＤ６００），绘制菌体生长曲线［２３］。
１􀆰 ２􀆰 ２　 菌种的扩大培养
将处于对数生长期的菌体作为种子，以 １０％的
接种量接种于液体发酵培养基中，于 ３０ ℃摇床 １６０
ｒ ／ ｍｉｎ培养 ４８ ｈ，８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ后，湿菌体
－２０ ℃保存备用。
１􀆰 ２􀆰 ３　 冻融法提高细胞的通透性
离心后的菌体置于－２０ ℃冰箱冷冻 ４ ｄ，取出后
室温下融解，再放置于－２０ ℃冰箱冷冻，稍后取出，
室温融解，此过程重复 ３次。
１􀆰 ２􀆰 ４　 冻融细胞转化法制备 ＡＴＰ 单因素试验
将经过冻融处理后的产氨棒杆菌接种于反应
液中，接种量为 ４０ ｇ ／ Ｌ。 在文献［２４］基础上稍加改
进，反应液组成： 葡萄糖 ８０ ｇ ／ Ｌ， ＫＨ２ＰＯ４ ２４０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４ ２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，腺嘌呤 ６ ｇ ／ Ｌ，ＫＯＨ 调
ｐＨ ７􀆰 ０。 将 １０ ｍＬ转化液置于 ５０ ｍＬ锥形瓶中放入
摇床 （ ３２ ℃，１６０ ｒ ／ ｍｉｎ）反应。 取样离心 （ ８ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ，５ ｍｉｎ），稀释后采用 ＨＰＬＣ法检测含量。
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
其他组分不变，分别改变底物和葡萄糖的质量
浓度以及 ＫＨ２ ＰＯ４和 ＭｇＳＯ４的浓度，进行单因素
试验。
１􀆰 ２􀆰 ５　 正交试验设计优化转化条件
在单因素试验的基础上，选取最佳底物浓度、
最佳葡萄糖浓度、最佳 ＫＨ２ＰＯ４浓度、最佳 ＭｇＳＯ４浓
度 ４个因素为考察对象，采用“四因素三水平”方案
进行正交试验，研究影响 ＡＴＰ 产率的因素，以期获
得最佳的转化条件。
１􀆰 ２􀆰 ６　 分析方法
采用高效液相色谱法检测 ＡＴＰ 含量，色谱柱为
Ｃ１８柱（５ μｍ，４􀆰 ６ ｍｍ×１５０ ｍｍ）。 流动相为磷酸盐
缓冲液（Ａ）和甲醇（Ｂ）（体积比 ９５ ∶ ５），磷酸盐缓冲
液为 ３５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４和 １５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ
６􀆰 ５。 检测波长 ２５９ ｎｍ。 流动相的流速为 ０􀆰 ３
ｍＬ ／ ｍｉｎ、柱温 ２５ ℃、进样量 ２０ μＬ。
在文献［２５］分析条件基础上，用梯度洗脱模
式，设置时间程序：０ ｍｉｎ，Ｖ（Ａ） ∶ Ｖ（Ｂ） ＝ ９５ ∶ ５；７
ｍｉｎ，Ｖ（Ａ） ∶ Ｖ（Ｂ）＝ ９５ ∶ ５；８ ｍｉｎ， Ｖ（Ａ） ∶ Ｖ（Ｂ）＝ ７０ ∶
３０；２０ ｍｉｎ，Ｖ（Ａ） ∶ Ｖ（Ｂ） ＝ ７０ ∶ ３０；２５ ｍｉｎ， Ｖ（Ａ） ∶
Ｖ（Ｂ）＝ ９５ ∶ ５。
１􀆰 ２􀆰 ７　 ＡＴＰ 收率和底物转化率的计算
分别配制不同浓度的 ＡＴＰ 标准液和腺嘌呤标准
液，ＨＰＬＣ 分析，绘制标准曲线，ＡＴＰ 的回归方程为
Ｙ１ ＝９１􀆰 ５２１Ｘ１＋４７􀆰 ２７６，ｒ１ ＝ ０􀆰 ９９９；腺嘌呤回归方程为
Ｙ２ ＝３５９􀆰 ９６Ｘ２－２􀆰 ７３３，ｒ２ ＝０􀆰 ９９９。 计算 ＡＴＰ 和腺嘌呤
浓度，再计算 ＡＴＰ 收率和腺嘌呤转化率。
ＡＴＰ 产率 ＝ ＡＴＰ 摩尔生成量 ／腺嘌呤摩尔转化
量×１００％ （１）
腺嘌呤转化率 ＝腺嘌呤摩尔转化量 ／腺嘌呤初
始物质的量×１００％ （２）
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 Ｃ． ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＣＩＣＣ１０１６８ 的生长曲线和
对数期的确定
　 　 实验前，首先对产氨棒杆菌的生长曲线进行测
定。 根据测定结果，菌体对数生长期为 ８ ～ ２０ ｈ。
０～８ ｈ 是菌体生长的延迟期，２０ ｈ 后菌种生长达到
稳定期。 采用对数生长期的菌种进行接种，用于菌
种的大规模培养，本文中，采用生长 １８ ｈ 的菌体作
为种子用于扩大培养。
２􀆰 ２　 底物浓度的影响
在 ＨＰＬＣ条件下，发现两目标物的分离效果良
好。 选取腺嘌呤质量浓度为 ３、４、５、６、７ 和 ８ ｇ ／ Ｌ 分
别进行转化试验，基础反应液其他成分不变，反应
结果如图 １ 所示。 由图 １ 可知：底物质量浓度从 ３
ｇ ／ Ｌ增加到 ６ ｇ ／ Ｌ，ＡＴＰ 的生成随之增加，６ ｇ ／ Ｌ时达
到峰值，再继续增加底物的量，对产物 ＡＴＰ 生成不
利，可能过量的底物对产物的生成有抑制作用；从
底物腺嘌呤转化率指标分析，虽然低浓度时接近完
全转化，但 ＡＴＰ 产量和产率不高，因为低浓度时底
物反应量不充足。 综上考虑，选择底物质量浓度为
６ ｇ ／ Ｌ进行进一步研究。
图 １　 底物浓度对 ＡＴＰ浓度和产率的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ＡＴＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ
图 ２　 葡萄糖浓度对 ＡＴＰ浓度和产率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ＡＴＰ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ３　 葡萄糖浓度的影响
葡萄糖作为产氨棒杆菌生长和产酶的碳源，对
底物的转化效率有重要影响。 基础反应液其他成
分不变，改变葡萄糖质量浓度（２０、４０、６０、８０、１００ 和
１２０ ｇ ／ Ｌ）进行转化试验，考察 ＡＴＰ 产量和产率的变
化，结果如图 ２所示。 由图 ２可知：葡萄糖质量浓度
从 ２０ ｇ ／ Ｌ 增至 ６０ ｇ ／ Ｌ，ＡＴＰ 的生成量随之增加，在
６０ ｇ ／ Ｌ 葡萄糖时达到峰值，ＡＴＰ 产量和产率均较
高；继续增加葡萄糖的量，对产物生成不利，葡萄糖
３　 第 ５期 丰文飞等：冻融产氨棒杆菌细胞转化法制备三磷酸腺苷
质量浓度超过 ６０ ｇ ／ Ｌ 时，ＡＴＰ 的含量反而降低，其
主要原因可能是微生物代谢葡萄糖需消耗 ＡＴＰ。
因此，选择葡萄糖质量浓度为 ６０ ｇ ／ Ｌ。
２􀆰 ４　 Ｍｇ２＋浓度的影响
Ｍｇ２＋是很多酶的辅酶或辅助因子，是影响酶活
的主要离子之一。 Ｌｕｔｈｉ 等［２６］研究发现，Ｍｇ２＋会螯
合等摩尔的 ＡＴＰ，因此，产氨棒杆菌对底物进行转
化的过程中保证 Ｍｇ２＋的供给非常重要。 考察 ５ ～ ３０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ范围内不同 Ｍｇ２＋浓度对 ＡＴＰ 生成的影响，
结果如图 ３ 所示。 由图 ３ 可知： Ｍｇ２＋浓度为 ２０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ时，产物的产量和产率达到峰值。
图 ３　 Ｍｇ２＋浓度对 ＡＴＰ浓度和产率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍａｇｎｅｓｉａｎｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ＡＴＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ５　 ＫＨ２ＰＯ４浓度的影响
产氨棒杆菌转化腺嘌呤合成 ＡＴＰ 是连续的磷
酸化过程，因而 ＫＨ２ＰＯ４的浓度是影响转化反应过
程中 ＡＴＰ 产率的重要因素之一。 笔者采用 ＫＨ２ＰＯ４
作为磷酸基团的供体，研究 ４０～ ２４０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 范围内
ＫＨ２ＰＯ４浓度对 ＡＴＰ 生成的影响，结果如图 ４ 所示。
由图 ４可知：随着 ＫＨ２ＰＯ４浓度的增加，产物 ＡＴＰ 的
量也在不断增加，ＫＨ２ＰＯ４浓度为 １２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ时，
　 　 　 　
ＡＴＰ 的产量达到最佳值，此后磷酸盐浓度继续增
加，ＡＴＰ 的产量不会继续提高。 因此，ＫＨ２ＰＯ４的最
佳浓度为 １２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
图 ４　 ＫＨ２ＰＯ４浓度对 ＡＴＰ浓度和产率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＫＨ２ＰＯ４ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ＡＴＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ６　 正交试验优化转化条件
在单因素试验的基础上，选取最佳的底物浓
度、葡萄糖浓度、ＫＨ２ＰＯ４浓度及 ＭｇＳＯ４浓度这 ４ 个
因素为考察对象，采用“四因素三水平”方案进行正
交试验，以期获得最佳的转化条件。 试验设计结果
及分析如表 １和表 ２所示。
极差值的大小表明该因素水平的改变对结果
的影响大小，极差值越大，该因素对 ＡＴＰ 产率的影
响越大。 由表 ２可知：各因素对 ＡＴＰ 产率的影响从
大到小依次为腺嘌呤、葡萄糖、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４。 为
了获得最大的产率，应选择的最优组合是腺嘌呤 ６
ｇ ／ Ｌ、葡萄糖 ６０ ｇ ／ Ｌ、ＭｇＳＯ４ １５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 和 ＫＨ２ ＰＯ４
１２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，采用此组合进行转化试验，ＡＴＰ 平均
产率达到 ７８％，比优化前（基础反应液，ＡＴＰ 产量
１２􀆰 ３０ ｇ ／ Ｌ，产率 ５４％）提高了 ４６％。
表 １　 正交试验设计与结果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
样品号 Ａρ（葡萄糖） ／ （ｇ·Ｌ－１）
Ｂ
ｃ（ＫＨ２ＰＯ４） ／ （ｍｍｏｌ·Ｌ
－１）
Ｃ
ｃ（ＭｇＳＯ４） ／ （ｍｍｏｌ·Ｌ
－１）
Ｄ
ρ（腺嘌呤） ／ （ｇ·Ｌ－１） ＡＴＰ 产率 ／ ％
１ ５０ １００ １５ ５ ６７
２ ５０ １２０ ２０ ６ ７０
３ ５０ １４０ ２５ ７ ５６
４ ６０ １００ ２０ ７ ６１
５ ６０ １２０ ２５ ５ ６７
６ ６０ １４０ １５ ６ ６８
７ ７０ １００ ２５ ６ ６３
８ ７０ １２０ １５ ７ ５８
９ ７０ １４０ ２０ ５ ６１
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
表 ２　 正交试验极差分析
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｒａｎｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
误差项 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
均值 １ ６４􀆰 ３３ ６３􀆰 ６７ ６４􀆰 ３３ ６５􀆰 ００
均值 ２ ６５􀆰 ３３ ６５􀆰 ００ ６４􀆰 ００ ６７􀆰 ００
均值 ３ ６０􀆰 ６７ ６１􀆰 ６７ ６２􀆰 ００ ５８􀆰 ３３
极差 ４􀆰 ６７ ３􀆰 ３３ ２􀆰 ３３ ８􀆰 ６７
２􀆰 ７　 初始 ｐＨ的影响
产氨棒杆菌 Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＣＩＣＣ１０１６８的最适生
长 ｐＨ为 ７􀆰 ２～７􀆰 ４（菌种保藏中心提供），因此，笔者在
ｐＨ ６􀆰 ８～７􀆰 ８范围内取 ６个梯度来考察 ｐＨ对产物生成
的影响，结果如图 ５所示。 由图 ５可知：在菌体最适生
长 ｐＨ范围内，产物的生成几乎不受影响；而超出最适
生长 ｐＨ范围，ｐＨ都对产物的生成不利，所以菌体最适
生长 ｐＨ也是 Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＣＩＣＣ１０１６８制备 ＡＴＰ 最
优的 ｐＨ。 因此，确定产 ＡＴＰ的最佳 ｐＨ为 ７􀆰 ４。
图 ５　 ｐＨ对 ＡＴＰ浓度和产率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ＡＴＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ８　 转化温度的影响
Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＣＩＣＣ１０１６８最高耐热温度为 ４２
℃，因此，考察 ３０～ ４２ ℃范围内不同温度对转化的
影响，结果见图 ６。 由图 ６ 可知：温度超过 ４０ ℃后，
ＡＴＰ 的产量下降，可能是部分酶活性受到了影响，
从而阻碍了产物的生成。 由此可见，３５ ℃对产物的
生成最为有利。
２􀆰 ９　 最佳接种量的选择
选择冻融菌体量分别为 ２０、３０、４０、５０ 和 ６０
ｇ ／ Ｌ，其他条件不变，研究接种量对 ＡＴＰ 浓度和产率
的影响，结果如图 ７所示。 因腺嘌呤溶解度限制，菌
体用量 ２０ ｇ ／ Ｌ时反应结束，然而腺嘌呤并未完全溶
解，所以转化量不能确定，产物产率无法计算，故图
７中没有相应数据。 从图 ７ 可以看出：菌体用量 ４０
ｇ ／ Ｌ时，已经完成底物的最大转化，继续增加菌体用
量对产物生成不利，可能是因为过量的菌体自身代
谢消耗了转化液中原料，阻碍了底物的转化，所以
选取 ４０ ｇ ／ Ｌ为菌体的最佳用量。
图 ６　 温度对 ＡＴＰ浓度和产率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ＡＴＰ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ
图 ７　 菌体用量对 ＡＴＰ浓度和产率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｎ ＡＴＰ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ
图 ８　 最优条件下转化反应过程中 ＡＴＰ含量、
菌体量和 ＡＴＰ产率的动态变化
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＡＴＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ａｎｄ ＡＴＰ ｙｉｅｌｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｕｎｄｅｒ
ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
２􀆰 １０　 最优转化条件下的转化反应
按上述试验得到的最优条件，即腺嘌呤 ６ ｇ ／ Ｌ、葡
萄糖 ６０ ｇ ／ Ｌ、ＭｇＳＯ４１５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、
ｐＨ ７􀆰 ４和 ３５ ℃，投加 ４０ ｇ ／ Ｌ 冻融菌体进行反应，取
样检测 ＡＴＰ 含量及菌体量的变化，结果如图 ８所示。
５　 第 ５期 丰文飞等：冻融产氨棒杆菌细胞转化法制备三磷酸腺苷
由图 ８ 可见：随着反应的进行，产物 ＡＴＰ 在逐渐积
累，在 ８ ｈ 时左右达到最大积累量（１９􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ），ＡＴＰ
产率 ８５％。 菌体量随反应进行在缓慢增加，这是因
为冻融法处理细胞只是增加了细胞的通透性，并没
有破坏细胞结构，细胞亦没有凋亡。 底物进入细胞
后，利用细胞内呼吸链的酶系统进行一系列酶促反
应转化得到 ＡＴＰ。 未衰亡的细胞接受底物利用葡
萄糖、磷酸盐和 Ｍｇ２＋实现有氧呼吸，产生 ＡＴＰ 的过
程也出现细胞的生长现象（一般情况下细胞的生长
是利用营养要素和呼吸作用提供的能量来实现细
胞体积的增加），所以在转化反应的过程中，细胞量
呈现出了缓慢的增长趋势。 新增长的细胞因通透
性差，几乎不参与底物的转化反应。 转化起始阶段
与转化完成后的反应液的 ＨＰＬＣ 色谱图如图 ９ 所
示。 由图 ９可知：转化产物比较单一，为后续的分离
提供了很大的便利，满足工业化生产的需求。
图 ９　 反应初始阶段与完成后的 ＨＰＬＣ谱图
Ｆｉｇ􀆰 ９　 ＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＴＰ ａｎｄ ａｄｅｎｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ａｎｄ ｆｉｎａｌ ｓｔａｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ
　 　 在条件优化后，反应液中 ＡＴＰ 质量浓度为
１９􀆰 ４６ ｇ ／ Ｌ，相对原始对照 （ １２􀆰 ３０ ｇ ／ Ｌ）提高了
５８％。 比较本研究结果与国内外文献报道结果
的差异，结果见表 ３。 由表 ３ 可知：本研究中，
ＡＴＰ 产率达 ８５􀆰 ００％，腺嘌呤转化率为 ９０％，冻
融菌体接种量 ４０ ｇ ／ Ｌ，这些工艺条件在国内外都
处于较优水平，为 ＡＴＰ 的工业生产提供良好
借鉴。
表 ３　 腺嘌呤转化合成三磷酸腺苷成果比较
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＡＴＰ ｆｒｏｍ ａｄｅｎｉｎｅ ｉｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
酶源 生物量 ／（ｇ·Ｌ－１）
ρ（腺嘌呤） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（ＡＴＰ） ／
（ｇ·Ｌ－１） ＡＴＰ 产率 ／ ％
Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ６８７２［１５］ — ２􀆰 ００ １􀆰 ３７ １５􀆰 ００
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｙｅａｓｔ［１６］ １ ０００ ２􀆰 ２０ ２􀆰 ３２ ２８􀆰 ００
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｂａｋｅｒ′ｓ ｙｅａｓｔ［１７］ — ２０􀆰 ２５ ５０􀆰 ００ ６５􀆰 ００
Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ Ｂ１ ７８７ ａｎｄ ｙｅａｓｔ［１８］ — ２􀆰 ００ ６􀆰 ００ ８０􀆰 ００
Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＫＹ１３５１０［２１］ １００～１２０ １９􀆰 ００ ７０􀆰 ００ ８２􀆰 ００
Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ ｅｌｅｇａｎｓ［２２］ ５００ ３􀆰 ００ １０􀆰 １３ ８２􀆰 ７５
Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＣＩＣＣ１０１６８ ４０ ６􀆰 ００ １９􀆰 ４６ ８５􀆰 ００
３　 结论
本研究不使用表面活性剂，直接用冻融细胞转
化腺嘌呤制备 ＡＴＰ，通过单因素试验和正交试验确
定了 ＡＴＰ 的最优转化条件：菌体接种量 ４０ ｇ ／ Ｌ、底
物腺嘌呤 ６ ｇ ／ Ｌ、葡萄糖 ６０ ｇ ／ Ｌ、ＭｇＳＯ４１５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、
ＫＨ２ＰＯ４ １２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、反应液 ｐＨ ７􀆰 ４ 和反应温度
３５ ℃。 最优转化条件下，ＡＴＰ 产率可达 ８５􀆰 ００％，底
物转化率为 ９０％。 该优化条件稳定可行，所用菌体
量少，菌体处理容易，转化耗时短，过程简单容易控
６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
制，实现了原料定量投入与 ＡＴＰ 较高产出的目标。
这表明 Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ在制备 ＡＴＰ 方面有优势，可
为 ＡＴＰ 的工业生产提供良好借鉴。
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ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｐｅｒｍｉｎｅ， ｔｈｅ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｍｇ２＋
ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ，ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｏｎｉｚｅｄ Ｍｇ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｇ２＋ ｂｙ ３１Ｐ⁃ＮＭＲ［ Ｊ］ ．Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９９，
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（责任编辑　 管　 珺）
７　 第 ５期 丰文飞等：冻融产氨棒杆菌细胞转化法制备三磷酸腺苷