全 文 ：两株芽胞菌对烟草废料烟碱与绿原酸降解的研究
李雪梅!，陈育如，骆跃军，魏 霞
（南京师范大学 生命科学学院微生物工程重点实验室，南京 !"##$%）
摘 要：为综合利用烟草废料，筛选得到能有效降解烟碱与绿原酸的两株芽胞菌，考察了所选菌株对烟碱与绿原酸
的降解特性。实验结果表明，菌株 !"#$%%&’ &’( )* 表现出较高降解烟碱能力，培养 +* ,可将含烟碱 * (#- ./ 0 /烟草物
料中的烟碱降解 *# (+1，%! ,降解率可达 2% (*1；对绿原酸降解效果最好的是菌株 !"#$%%&’ &’( )3，培养 -2 , 将含绿
原酸 "# (4% ./ 0 /烟草物料中的绿原酸降解了 4# (41，%! ,可将绿原酸降解 *! (!1。
关键词：废烟草；烟碱；绿原酸；降解；芽胞菌
中图分类号：56-"" 文献标识码：7 文章编号："*%! 8 +*%2（!##4）#- 8 ##42 8 #-
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我国烟草资源丰富，每年都有大量的低次烟草、
烟筋、烟茎和碎烟末等卷烟下脚料急待处理和利用，
否则将造成资源浪费和环境污染［"］。烟草废料通过
微生物转化处理是其综合利用的有效途径之一［!］。
烟碱是烟草中主要的剧毒生物碱，一般占总生
物碱组分的 $#1以上，在农药、医药等行业有广泛
的应用。绿原酸是烟叶中含量最高的多酚［+］，具有
很广泛的用途［-，4］。在对烟草废料进行微生物转化
的过程中发现烟碱和绿原酸对微生物生长有抑制作
用，且烟碱作为危险毒害的对象，必须将其量降解至
安全的程度。因此，有必要对其降解进行研究。从
改善卷烟品质的方面出发，前人对烟碱的生物降解
进行了一些研究［*，%］，本工作主要是以利用微生物
对烟草废料降害为目的，进行烟碱及绿原酸的降解
作用研究，以期将烟草废料用于绿色无公害有机肥
的生产。
! 收稿日期：!##4=#*="4
基金项目：江苏省高校高新技术产业发展项目（X@#!=#2!）及国家烟草总局横向课题资助
作者简介：李雪梅（"$2#=），女，山东莱芜人，硕士研究生，研究方向：应用微生物。
联系人：陈育如，A=.J>R：Q,BMS W !##4
·42·
生 物 加 工 过 程
?,>H<&< XM;DHJR MO Z>M’DMQ<&& AH/>H<H/
第 + 卷第 - 期
!##4 年 "" 月
万方数据
! 材料和方法
! "! 菌株与材料
芽胞菌（!"#$%%&’ #$ "）%&、%’、%!(、%)!、*!，本实
验室分离、保藏，烟草废料（合作烟厂提供），降解实
验前均用溶剂先抽提一部分烟碱与绿原酸，以回收
提取物和降低其对接种微生物的抑制作用。
! ") 试 剂
烟碱（+,-./,01）标准品：22 "34（5,678 9.）。绿原
酸标准品（中国药品生物制品检定所）。乙醇、乙醚、
丙酮、氯仿等，均为国产分析纯试剂。
! ": 培养基
液体种子培养基：) ";4 玉米粉，!4 豆粉，$<
= ";，!)! >灭菌 :3 7,0。
固体培养基：?34乙醇浸提过的烟草（干燥）
!; 6，麦麸 ’ 6，水 :3 7@，营养液 !; 7@，989A: ) 6，
$< = ";，!)! > 灭菌 ?; 7,0。营养液：+89B ; 6，
C)胨 ! "); 6，（实际生产中为降低成本可用豆粕代替蛋
白胨作氮源）定容至 );3 7@，$< = ";。
! "? 仪器与设备
=))型紫外可见分光光度计（上海第三分析仪
器厂）；司）；DF%GH<5G;3%’;G5 型隔水式电热恒温培养箱
（上海跃进医疗器械厂）；IJ!33? 型电子分析天平
（上海天平仪器厂）；KH2335@):G) 型格兰士微波炉
（格兰士公司）。
! "; 样品处理与测定方法
! "; "! 样品前处理
按照我国烟草行业标准 F9 L M:!G!22’（烟草及
烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法）测定烟叶
样品含水率和制备烟末。以 ?34（体积分数）乙醇
作为浸提剂，料液比 ! N 2，微波处理 23 #，提取绿原酸
和烟碱。
! "; ") 测定方法
烟碱的测定用甲基橙显色法［(］。绿原酸测定采
用紫外分光光度法［2］。
! "; ": 生物量测定
均匀取出一定量发酵后的物料，精确称量，加入
!3 7@水，搅拌均匀，将菌液稀释到适当倍数后，用
血球计数板计数，重复 : 次，取平均值，计算出每 6
干物料含菌量。
" 结果与讨论
) "! 烟碱、绿原酸的浸提与含量的测定
) "! "! 废弃烟草中烟碱、绿原酸的浸提
废弃烟草中含有大量的烟碱、绿原酸，对微生物
的生长有普遍的抑制作用，有必要将其中大部分的
烟碱、绿原酸提取出来。提取出来的烟碱、绿原酸成
为高附加值产品，浸提后的烟草残渣可以用于微生
物降解烟碱、绿原酸的研究。
分别用丙酮和水（体积比 ! N )）、?34（体积分
数）乙醇浸提废弃烟草，用分光光度法测定绿原酸、
烟碱的含量。结果如表 ! 所示。
表 ! 不同浸提液浸提烟碱、绿原酸的效果比较
M8OB1 ! PQ/R8-/,06 0,-./,01 80S -TB.R.610,- 8-,S U,/T S,VV1R10/ B18-T,06 #.BW/,.0 VR.7 /T1 /.O8--. #.B,S R1#,SW1#
浸提液 料液体积比
烟碱质量浓度
（干重）L（76 L 6）
烟碱含量 L
4
绿原酸质量浓度
（干重）L（76 L 6）
绿原酸含量 L
4
(（丙酮）N (（水）X ! N ! ! N 2 !( "( ! "((4 ?: "? ? ":?4
?34乙醇（体积分数） ! N 2 )? "’ ) "?’4 ): "’ ) ":’4
由表 ! 可看出，用丙酮和水的混合溶剂浸提法
测定的原料中绿原酸量为 ? ":?4，用 ?34乙醇浸提
的绿原酸量为 ) ":’4。烟草中绿原酸的含量有
; "’24（优质烟草）［:］和 ) "3’4（一种烤烟）的报
道［!3］，本实验所用烟草废料中绿原酸属中等水平。
我国烤烟烟碱平均含量为 :4 Y ?4［!!］，本实验
中用 ?34 乙醇浸提法得到的烟草中烟碱量为
) "?’4，用 ?34乙醇浸提的烟碱量（) "?’4）比用丙
酮和水混合溶剂浸提的量（! "((4）要高一些，因此
乙醇体系更适合提取烟碱。烟碱是剧毒物质，为了
尽可能降低烟草废料中烟碱的含量，在后续实验中
选用 ?34乙醇作为浸提溶剂。
) "! ") 烟碱、绿原酸总含量的测定
烟碱量测定：准确称取烟草 3 "; 6，加 3 "; 7.B L @
盐酸 )3 7@，加热煮沸 : 7,0，用蒸馏水定容至
!33 7@。过滤，取滤液，在分光光度计 ?)3 07 处测定
)33; 年 !! 月 李雪梅等：两株芽胞菌对烟草废料烟碱与绿原酸降解的研究 ·;2·
万方数据
吸光度，则得烟草中总烟碱量为 !" #$" %& ’ &。
绿原酸量测定：利用紫外分光光度法测定烟草
中总绿原酸为 !( #)* %& ’ &。
+ #+ 不同菌株对烟碱和绿原酸的降解效果
从烟草废料中筛选出多株菌株。分别将选出的
菌株 ,$-、.$、,+$、,/、,0 分别接入固体培养基培
养，接种量每瓶 ! %1，菌量为 + #"- 2 $)-个 ’ %1。充
分混匀后于 !/ 3培养箱中培养。分别取样涂片观
察，发现物料中有大量的菌体和芽胞，可见这些菌能
在烟草培养基中很好生长，培养 *+ 4 后，测定烟草
培养基中烟碱和绿原酸的含量，结果见图 $ 和图 +
所示。
图 $ 不同细菌对烟草中烟碱的降解效果比较
56& #$ 78%9:;6<8= 8> ?@&;:?6=& =6A8B6=@ 8> ?6>>@;@=B C:AB@;6D%
图 + 不同细菌对烟草中绿原酸的降解效果比较
56& #+ 78%9:;6<8= 8> ?@&;:?6=& A4E8;8&@=6A :A6?
8> ?6>>@;@=B C:AB@;6D%
从图 $ 可见，所选用的菌株对烟碱都有较明显
的降解作用，与接种前相比，接种培养基中烟草的烟
碱量大幅度减少。其中，以菌株 ,/ 降解烟碱的效
果最为显著，降解量为 ( #+" %&，降解率为 -/ #-F。
菌株 ,$-、.$ 的降解效果仅次于菌株 ,/，菌株 ,+$、
,0的降解效果也比较明显。由图 + 可见，与降解前
绿原酸的量相比，各株细菌都有一定的降解绿原酸
效果，效果最好的是 ,0 菌株，降解量为 / #($ %&（浸
提后烟渣中绿原酸含量为 $) #(* %& ’ &），降解率为
/$ #/F。与烟碱的结构相比，绿原酸的结构较为复
杂，加大了降解难度。各菌株按降解效果的大小排
序分别为 ,0 G .$ G ,$- G ,/ G ,+$。
据以上实验结果，后续实验选择菌株 ,/ 对烟
碱降解和菌株 ,0对绿原酸降解作进一步的研究。
+ #! 菌株 ,/ 对烟碱的降解特性
将菌株 ,/ 接入固体培养基培养，接种量每瓶
! %1，菌量约为 + #"- 2 $)-个 ’ %1。充分混匀，于 !/
3培养箱中培养。定时取样，测定烟草废料中烟碱
的含量与菌量。结果如图 ! 所示。
—!—烟碱含量；—"—菌量
图 ! 烟草废料中烟碱含量随菌株 ,/ 生长的变化
56& #! H6%@ A8D;<@ 8> =6A8B6=@ A8=B@=B 6= B8C:AA8 ;@<6?D@<
I6B4 B4@ &;8IB4 8> C:AB@;6D%
由图 ! 可见，在培养的前 +" 4 以内，菌株 ,/ 对
烟碱的降解作用较慢，以后降解量大幅度增加，!/ 4
后降解速度减缓，此降解趋势与其生长曲线基本一
致。在培养的前期 +" 4，经静置期和菌体的生长期，
参与烟碱代谢的酶系开始得到诱导，菌体对生长环
境逐步适应，此时的烟碱降解率相对较小。
在 +" 4 到 !/ 4 期间，烟草废料中烟碱的含量急
剧降低，此时菌体生长迅速，降解烟碱酶系的活性与
质量也快速增加，培养到 !/ 4 时，菌株 ,/ 降解烟碱
的质量就已达到 ! #/" %&，降解率为 /) #!F。继续培
养至 *+ 4，降解率达 -* #/F。这与袁勇军［$+］报道的
细菌生长和对烟碱的降解有短暂的延滞期，菌体生
长和对烟碱的降解同步，进入对数期后达到最大生
长量与最高的烟碱降解率的结果相一致。
在 !/ 4 后，菌体逐渐老化，培养基中的烟碱绝
对量也大为减少，因此烟碱降解速度也相应减少。
+ #" 菌株 ,0对绿原酸的降解特性
将菌株 ,0 接入固体培养基培养，接种量每瓶
! %1，菌量约为 + #"- 2 $)-个 ’ %1。充分混匀，于 !/
3培养箱中培养。定时取样，测定烟草废料中绿原
·/)· 生物加工过程 第 ! 卷第 " 期
万方数据
酸的含量。结果如图 ! 所示。
—!—烟碱含量；—"—菌量
图 ! 烟草废弃物中绿原酸含量随菌株 "#生长的变化
$%& ’! (%)* +,-./* ,0 +12,.,&*3%+ 4+%5 +,36*36 %3 6,74++,
.*/%5-*/ 8%61 61* &.,861 ,0 74+6*.%-)
由图 ! 可见，在培养的 9: 1 之前，烟草废料中
的绿原酸的降解速度不快，因为此时菌体的生长量
不大，处于对环境的适应期。在之后 :! 1到 ;< 1期
间，烟草废料中的绿原酸量急剧减少，说明此时细菌
对环境已经适应，生长迅速，绿原酸的降解机制得到
激活，呈现出最大的降解量。培养 != 1 后，菌株 "#
降解绿原酸的量为 > ’;! )& ? &，降解率为 >@ ’>A左
右。之后，由于菌体老化与烟草中绿原酸绝对量的
减少，降解速度降低。到 B: 1 后，降解率达到
<: ’:A。
: ’> 两株菌混合培养的降解效果
将菌株 "<，"#按 9 C 9 的菌量接入固体培养基培
养，接种量每瓶共 ; )D（各 9 ’> )D），菌量分别为 : ’>
E 9@=个 ? )D。与培养基充分混匀，于 ;< F培养箱中
培养。定时取样测定烟草废料中烟碱和绿原酸的量
及总菌量，结果如图 > 所示。
—!—烟碱含量；—#—绿原酸含量；—$—菌量
图 > 混合培养时培养基中烟碱、绿原酸量及菌量的变化
$%& ’> (%)* +,-./* ,0 3%+,6%3*，+12,.,&*3%+ 4+%5 435
74+6*.%4 3-)7*. %3 )*5%4
由图 > 可见，两菌混合培养总接种量增加 9 倍，
烟碱、绿原酸降解的量却没有明显增加；而混合菌株
的生物量增殖不如单一菌株，菌体的总量较单菌培
养时要少一些，这可能是因两株菌在营养利用上有
相似性，在生长上有一定的竞争抑制作用。
! 结论
通过对使用不同溶剂浸提烟碱、绿原酸效果的
比较，选取 !@A乙醇作为浸提剂，初步浸提烟碱、绿
原酸后，接入的微生物能在浸提料中生长并对目标
物降解。
从烟草废料中筛选的多株能降解烟碱与绿原酸
的细菌，在烟草培养基中培养后，测定其中烟碱和绿
原酸的含量，结果表明降解烟碱效果最好的细菌是
"<菌株，培养 ;< 1 时，将含烟碱 < ’@! )& ? & 烟草物
料中的烟碱降解了 ; ’B: 1 后，降解率达到 =B ’的是菌株 "#，培养 != 1 后，将含绿原酸9@ ’>B )& ? &
烟草物料中的绿原酸降解了 > ’;! )&，降解率为
>@ ’>A，继续培养至 B: 1，菌株 "# 对绿原酸的降解
率达 <: ’:A。可见这两株菌降解烟碱、绿原酸的效
率较高。而两菌混合培养有竞争现象。
本研究所用菌株在降解烟碱、绿原酸进而有效
利用烟草废料方面具有很大的应用潜力。
致谢：生物技术班的政金海同学参加了论文的部分
试验工作。
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:@@> 年 99 月 李雪梅等：两株芽胞菌对烟草废料烟碱与绿原酸降解的研究 ·<9·
万方数据
化等复合变性而成。田培善［!］等对其浆膜性能进行
了测试，结果表明："#$#%&’& 芭蕉芋醚化淀粉用于
纺织上浆可部分取代 ()*，能显著减少浆纱分绞毛
羽，在纺织厂用于细号高密纯棉织物上浆可降低成
本，提高织造效率，并且生物降解性好，减轻了退浆
废水对环境的影响。吴春华［+,］等以芭蕉芋淀粉
（-.）和聚乙烯醇（()*）为原料，在甲醛、明胶、硼砂
交联剂的作用下制备得到耐水性能良好的可生物降
解的塑料薄膜。该膜的拉伸强度为 +/ 0+! 1 +2 0!2
3(4，延伸率为 256 1 +/+6，已达到和超过 7899/&$
:9 标准；吸水率为 ’&6 1 &+6。而日本人则从芭蕉
芋根茎中提取出类苯丙酸糖酯和四种咖啡酸，可以
作为残渣利用［++］。
! 小 结
以芭蕉芋为原料，研究实施更加高效、节能、节
粮和无污染的酒精生产新工艺和资源的综合利用，
大幅度地降低发酵酒精生产成本，为西部地区的贵
州省、云南省和广西自治区芭蕉芋作物资源的开发
和深加工，寻找一条适合西部地区特别是少数民族
地区脱贫致富的芭蕉芋燃料乙醇产业化发展的的新
工艺和新途径将具有重要的现实意义。而将芭蕉芋
淀粉经一系列处理，用于纺织和可降解塑料薄膜以
及从芭蕉芋根茎中提取各种有用成分则为芭蕉芋的
研究应用提供了新的方向。
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·2,· 生物加工过程 第 ’ 卷第 9 期
万方数据