全 文 ：第 １３卷第 ５期
２０１５年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０５􀆰 ０１３
收稿日期：２０１４－１０－０８
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢＡ００８０７）
作者简介：花卫俊（１９９０—），男，江苏盐城人，硕士研究生，研究方向：功能成分及功能食品；缪冶炼（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｌｍｉａｏ＠ ｎｊｔｅｃｈ．
ｅｄｕ．ｃｎ
产脑苷脂鸡枞菌 Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌｙｐｅａｔｕｓ ＣＴＭ １的
分子生物学鉴定及生长特性研究
花卫俊１，缪冶炼１，陈介余２，尤业兵１，孙　 唱１，袁丽红３，许　 琳３
（１􀆰 南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 ２１１８００； ２􀆰 日本秋田县立大学 生物资源学部，
日本 秋田 ０１０ ０１９５；３􀆰 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：脑苷脂 Ａ和 Ｂ具有显著的镇痛作用和脑神经保护作用。 鸡枞菌（Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌｙｐｅａｔｕｓ）子实体含有脑苷脂
Ａ和 Ｂ，但是野生鸡枞菌子实体资源稀少。 笔者在前期研究中以野生鸡枞菌子实体为原料，通过组织分离、菌种纯
化及筛选，培育出菌株 ＣＴＭ １。 本研究中，采用分子生物学方法鉴定了菌株 ＣＴＭ １与鸡枞菌的菌种同源性，测定
了该菌株平板培养、液体培养中菌丝体的生长速率和脑苷脂含量。 实验结果表明：菌株 ＣＴＭ １及其出发野生子实
体与 Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌｙｐｅａｔｕｓ的同源性为 ９９％。 在 ＰＤＡＹ平板培养中，菌落直径的增长速率在 ２７ ｄ内基本稳定在 １􀆰 ５
ｍｍ ／ ｄ。 比菌落直径增长速率在 １ ｄ时为 ０􀆰 ２１ ｄ－１，然后逐渐下降。 在 ＤＰ ｔ液体培养中，９ ｄ 以后为菌丝体生长的稳
定期，此时的生物量为 ３􀆰 ５７ ｇ ／ Ｌ。 比菌丝体生长速率在 １ ｄ时为 ２􀆰 ００ ｄ－１，然后逐渐下降。 菌丝体的脑苷脂 Ａ、Ｂ含
量分别为 ０􀆰 １５２％、０􀆰 ０６６％。 由此可见，鸡枞菌 ＣＴＭ １的大规模培养可以成为脑苷脂 Ａ、Ｂ原料生产的有效途径。
关键词：鸡枞菌；菌丝体；脑苷脂；平板培养；液体培养
中图分类号：Ｑ９３９􀆰 ９９　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０５－００６７－０７
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌｙｐｅａｔｕｓ ＣＴＭ⁃１
ＨＵＡ Ｗｅｉｊｕｎ１，ＭＩＡＯ Ｙｅｌｉａｎ１，ＣＨＥＮ Ｊｉｅｙｕ２，ＹＯＵ Ｙｅｂｉｎｇ１，ＳＵＮ Ｃｈａｎｇ１，ＹＵＡＮ Ｌｉｈｏｎｇ３，ＸＵ Ｌｉｎ３
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｋｉｔａ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｋｉｔａ ０１０⁃０１９５，Ｊａｐａｎ；
３．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｈａｖｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎａｌｇｅｓｉａ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ． Ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｉｅｓ
ｏｆ Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，ｂｕｔ ｗｉｌｄ Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｒｅ ｓｃａｒｃｅ． Ｉｎ ａｕｔｈｏｒ′ｓ
ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｗｏｒｋ， ａ ｓｔｒａｉｎ ＣＴＭ⁃１ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ｓｔｒａｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｆｒｅｓｈ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｉｅｓ ｏｆ ｗｉｌｄ Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ａｓ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ． Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣＴＭ⁃１ ａｎｄ Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ⁃ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ
ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｉｎ ｐｌａｔｅ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｍｙｃｅｌｉａ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＣＴＭ⁃１．Ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔａｉｎ ＣＴＭ⁃１ ａｎｄ ｉｔｓ ｐａｒｅｎｔａｌ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｉｅｓ ｈａｄ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｕｐ ｔｏ ９９％ ｗｉｔｈ Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌｙｐｅａｔｕｓ． Ｉｎ ＰＤＡＹ ｐｌａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｙ⁃ｄｉａｍｅｔｅｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ
ｒａｔｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔａｎｔ ａｔ １􀆰 ５ ｍｍ ／ ｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｏｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｄ ２７ ｄ．Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｌｏｎｙ⁃ｄｉａｍｅｔｅｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ
ｒａｔｅ ｗａｓ ０􀆰 ２１ ｄ－１ ａｔ １ ｄ，ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ａｆｔｅｒ ｔｈｅｎ．Ｉｎ ＤＰ ｔ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｙｃｅｌｉａ
ｅｎｔｅｒｅｄ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｐｈａｓｅ ａｔ ９ ｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ｗａｓ ３􀆰 ５７ ｇ ／ Ｌ．Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｗａｓ
２􀆰 ００ ｄ－１ ａｔ １ ｄ，ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ａｆｔｅｒ ｔｈｅｎ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｉｎ ｍｙｃｅｌｉａ ｗａｓ
０􀆰 １５２％ ａｎｄ ０􀆰 ０６６％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ， ｔｈｅ ｌａｒｇｅ⁃ｓｃａｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔ． ｃｌｙｐｅａｔｕｓ ＣＴＭ⁃１ ｃａｎ ｂｅ
ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｗａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅｓ Ａ ａｎｄ Ｂ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ；ｍｙｃｅｌｉｕｍ；ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ；ｐｌａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ
　 　 脑苷脂是单糖或低聚糖与神经酰胺末端羟基
结合所形成的一类化合物，是动物、植物、真菌和海
洋生物细胞膜 ／壁的结构成分。 脑苷脂在细胞分
化、细胞凝集、细胞骨架的迁移、跨膜信号转导等方
面发挥重要的调节作用，还具有调控细胞生长、肿
瘤抑制活性、免疫调节和神经保护、抗菌抗病毒等
生物学活性［１］。
Ｑｉ等［２－３］从鸡枞菌子实体中成功分离出脑苷脂
Ａ～Ｆ。 其中，脑苷脂 Ａ 和 Ｂ 的结构式见图 １。 脑苷
脂 Ａ和 Ｂ作为新型镇痛药物，具有镇痛作用强、持
续时间长、无明显副作用、没有药物成瘾和药物耐
受反应等特点。 通过腹腔注射、口服、皮肤涂抹等
途径给药，都显示对神经性疼痛和炎性疼痛的镇痛
作用，生物利用度高达 ４６􀆰 ７％［４］。 此外，脑苷脂 Ａ
和 Ｂ能通过血脑屏障，减小缺血后的脑梗塞面积和
神经细胞死亡，减轻脑水肿，促进脑卒中后运动和
认知功能的恢复［５－７］。 由于脑苷脂 Ａ和 Ｂ对神经的
多靶点具有保护作用，其治疗脑卒中的有效时间超
过 ２６ ｈ［７－９］。
图 １　 脑苷脂 Ａ和 Ｂ的结构式
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ Ａ ａｎｄ Ｂ
为了防止世界上疯牛病发生对药物安全带来
的危害，脑苷类化合物来源需要从动物脑组织转向
植物、食用菌等。 鸡枞菌是一种肉质细嫩、味道鲜
美、营养丰富的野生珍稀食（药）用菌，但是鸡枞菌
只能在贵州、云南、四川等省的山区生长，而且采收
季节性强。 另外，由于鸡枞菌与白蚁共生，其子实
体仅能在白蚁巢上生长，至今还没有实现鸡枞菌子
实体人工培养的产业化。 因此，鸡枞菌资源稀少、
价格昂贵。 这些问题是脑苷脂 Ａ和 Ｂ成药的瓶颈。
笔者在前期研究中以野生鸡枞菌子实体为原
料，采用组织分离、菌种纯化及筛选的方法，培育出
菌株 ＣＴＭ １［１０］。 通过菌株 ＣＴＭ １ 的大规模培
养，可以生产出制备脑苷脂 Ａ 和 Ｂ 的菌丝体，克服
野生鸡枞菌子实体生产在地域、季节和产量等方面
受限制的困难。 本研究采用分子生物学方法鉴定
菌株 ＣＴＭ １ 与鸡枞菌的菌种同源性。 此外，为了
探明该菌株的生长特性，测定平板培养、液体培养
中菌丝体的生长速率和脑苷脂含量。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 鸡枞菌子实体及菌种
新鲜鸡枞菌子实体采自云南省红河州建水县
山区。 用自来水清洗后，装入密封袋中，在－２０ ℃条
件下冻藏。 使用前，分别用无菌水和 ７５％乙醇和无
菌水各清洗一次，作为子实体试样。
以新鲜鸡枞菌子实体为原料，通过组织分离、
菌种纯化及筛选获得菌种 ＣＴＭ １［１０］。 用接种钩将
菌种接至 ＰＤＡＹ斜面培养基上，在 ２８ ℃下培养至菌
丝长满斜面，置于 ４ ℃的冰箱中保存，并定期转接
活化。
１􀆰 ２　 主要试剂
Ｗｉｚａｒｄ􀳏 Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 试剂盒，
普洛麦格生物技术有限公司；ＮＳ１、ＮＳ４、Ｔａｑ ＤＮＡ 聚
合酶、ｄＮＴＰｓ，宝生物工程（大连）有限公司。
１􀆰 ３　 培养基
ＰＤＡＹ培养基（ｇ ／ Ｌ）：马铃薯浸出粉 １５，葡萄糖
２０，酵母浸粉 ２，琼脂 ２０。 采用 １ ｍｏｌ ／ Ｌ 的柠檬酸调
节 ｐＨ至 ５􀆰 ０，１２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ，倒斜面及平板。
８６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
ＤＰ ｔ液体培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０，蛋白胨 １０，
ＭｇＳＯ４０􀆰 ７５，ＫＨ２ＰＯ４１􀆰 ５。 采用 １ ｍｏｌ ／ Ｌ的柠檬酸调
节 ｐＨ至 ５􀆰 ０，１１５ ℃灭菌 ３０ ｍｉｎ。
１􀆰 ４　 分子生物学鉴定
采用分子生物学方法对子实体及菌丝体的菌
种同源性进行鉴定。
１􀆰 ４􀆰 １　 菌丝体准备
用接种钩挑取斜面菌种接入装有 ２００ ｍＬ 液体
培养基的 ５００ ｍＬ 三角瓶中，在 ２８ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 条
件下振荡培养 ５ ｄ。 培养结束后，进行发酵液的抽
滤，收集菌丝体，分别用 ７５％乙醇和无菌水各清洗 １
次，作为菌丝体试样。
１􀆰 ４􀆰 ２　 基因组的提取
按照 Ｗｉｚａｒｄ􀳏 Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 试
剂盒说明书的方法，进行子实体和菌丝体基因组的
提取。
１􀆰 ４􀆰 ３　 １８Ｓ ｒＲＮＡ的 ＰＣＲ扩增和测序
扩增引物采用通用引物 （上游引物 ＮＳ１：５′
ＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣ ３′；下游引物 ＮＳ４：５′
ＣＴＴＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧ ３′）， 采用 ９７００ 型
ＰＣＲ扩增仪（北京麦百金科技有限公司）进行子实
体和菌丝体基因组的 １８Ｓ ｒＲＮＡ 扩增。 ＰＣＲ 反应体
系：４ μＬ ｄＮＴＰ、５ μＬ １０×Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ ｆｒｅｅ）、２ μＬ
ＮＳ１、２ μＬ ＮＳ４、２ μＬ模板 ＤＮＡ、１ μＬ Ｔａｑ酶，用超纯
水定容至 ５０ μＬ； ＰＣＲ 反应条件：９８ ℃ 预变性 ５
ｍｉｎ、９８ ℃变性 １０ ｓ、５５ ℃退火 ３０ ｓ、７２ ℃延伸 ６０ ｓ、
３０个循环、７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎ。
ＰＣＲ扩增产物的检验通过琼脂糖凝胶电泳进行。
琼脂糖凝胶电泳中，琼脂糖质量浓度为 ８ ｇ ／ Ｌ，电泳电
压为 １９０ Ｖ，缓冲液为 ＴＢＥ缓冲液，时间为 １５ ｍｉｎ。
１８Ｓ ｒＲＮＡ序列分析根据 Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧链终止
法，采用 ＡＢＩ ３７３０型 ＤＮＡ测序仪（天津金思德生物
有限公司）进行。
１􀆰 ４􀆰 ４　 １８Ｓ ｒＲＮＡ进化树的构建
利用序列局部相似性查询系统 ＢＬＡＳＴ（美国国
立生物技术信息中心），将子实体、菌丝体的 １８Ｓ
ｒＲＮＡ序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库（美国国立生物技术
信息中心）中的所有序列进行比较，找出序列相似
的菌种，并用 ＭＥＧＡ４􀆰 １ 软件进行匹配排列，用邻接
法构建系统进化树。
１􀆰 ５　 平板培养
用孔径 ５ ｍｍ的无菌打孔器从平板菌落边缘部
取出菌丝长势均匀、直径为 ５ ｍｍ的圆形菌块，接入
新的 ＰＤＡＹ平板培养基，每个平板培养基上接 ３ 个
菌块。 ２８ ℃恒温培养，定期用十字交叉法测量菌落
直径，观察菌落颜色形态和长势。 每次菌落直径测
定采用 ９个试样，取平均值和标准偏差。
１􀆰 ６　 液体培养
用孔径 ５ ｍｍ的无菌打孔器从平板菌落边缘部
取出长势均匀的圆形菌落，接入装有 ２００ ｍＬ液体培
养基的 ５００ ｍＬ 三角瓶中，每瓶接 ３ 个菌落。 在 ２８
℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ条件下培养 ３ ｄ，作为种子液。 此时，
种子液中的菌体呈短小、均匀的菌丝状，有利于提
高种子液转接时接种量的均匀程度。
将种子液按体积分数 １０％的接种量接入装有
３０ ｍＬ液体培养基的 １５０ ｍＬ三角瓶中，共接 １８ 瓶。
在 ２８ ℃、１５０ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下培养 １０ ｄ。 从第 ２ 天开
始，每天取出 ２瓶发酵液，抽滤，收集菌丝体，在 １０５
℃下干燥 ４ ｈ，测量菌丝体干质量。
１􀆰 ７　 脑苷脂含量测定
１􀆰 ７􀆰 １　 试样处理
称取菌丝体（或子实体）试样 １􀆰 ０ ｇ、石英砂 ３􀆰 ０
ｇ于研钵中，加入甲醇 ５ ｍＬ，于冰浴中研磨 １０ ｍｉｎ。
将匀浆全部移入试管中，加入 ２０ ｍＬ的二氯甲烷 甲
醇溶液（体积比 １ ∶ １），在室温条件下超声处理 ２ ｈ，
静置。 浸提液用 ０􀆰 ４５ μｍ 滤膜过滤，在旋转蒸发仪
上浓缩至适当体积，作为提取物。 取提取物 １ ｍＬ，
再用等体积的二氯甲烷 甲醇溶液稀释适当倍数，作
为测试液。
１􀆰 ７􀆰 ２　 液相色谱 质谱分析
测试样的脑苷脂 Ａ和 Ｂ 含量采用 ＬＣ ＭＳ ／ ＭＳ
系统，ＬＣ １０ＡＤ 型液相色谱仪（ＬＣ），日本岛津公
司；ＡＰＩ ３０００型质谱（ＭＳ），美国 ＡＢ ＳＣＩＥＸ公司）进
行测定。
１）液相色谱分析条件　 色谱柱为 Ａｇｅｌａ Ｖｅｎｕｓｉｌ
ＸＢＰ Ｃ８（５０ ｍｍ × ２􀆰 １ ｍｍ，５ μｍ）；柱温为室温；流
动相 Ａ为甲酸和 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ甲酸铵溶液（体积比 １ ∶
９９９）；流动相 Ｂ 为甲酸和甲醇（体积比 １ ∶ ９９９）；洗
脱按表 １程序进行梯度洗脱；进样量 １０ μＬ。
２）质谱分析条件　 电喷雾离子源（ＥＳＩ）；正离子
模式；离子喷雾电压 ３ ０００ Ｖ；离子源温度 ４００ ℃；多反
应监测（ＭＲＭ）扫描方式。
脑苷脂 Ａ和 Ｂ 的标准品按文献［８］制备，其纯
度为 ９９􀆰 ５％。 采用 １００％甲醇溶液，制备质量浓度
分别为 ４、２０、８０、２００、５００、１ ０００ 和 ２ ０００ ｎｇ ／ ｍＬ 的
脑苷脂 Ａ标准品溶液，质量浓度分别为 ２５、５０、１５０、
９６　 第 ５期 花卫俊等：产脑苷脂鸡枞菌 Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌｙｐｅａｔｕｓ ＣＴＭ １的分子生物学鉴定及生长特性研究
３００、４００、５００、６００和 ７５０ ｎｇ ／ ｍＬ的脑苷脂 Ｂ 标准品
溶液。 以离子流信号强度的峰面积为纵坐标，以浓
度为横坐标，绘制各成分含量测定用的标准曲线。
表 １　 液相色谱洗脱程序
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｌｕｔｉｏｎ ｓｃｈｅｄｕｌｅ ｉｎ ＨＰＬＣ
时间 ／
ｍｉｎ
流速 ／
（μＬ·ｍｉｎ－１）
φ（流动相 Ａ） ／
％
φ（流动相 Ｂ） ／
％
０􀆰 ０１ ３００ １５ ８５
０􀆰 ５０ ３００ １ ９９
４􀆰 ２０ ３００ １ ９９
４􀆰 ２１ ３００ １５ ８５
５􀆰 ００ ３００ １５ ８５
在脑苷脂 Ａ 质量浓度 ０ ～ ２ ０００ ｎｇ ／ ｍＬ 的范围
内，峰面积与脑苷脂 Ａ浓度之间的关系见式（１）。
Ａａ ＝ ５２９􀆰 １７ρａ ＋ １ ８７０　 　 （Ｒ２＝ ０􀆰 ９９６ １） （１）
式中：Ａａ为脑苷脂 Ａ的峰面积，ｃｏｕｎｔｓ；ρａ为脑苷脂 Ａ
的质量浓度，ｎｇ ／ ｍＬ。
在脑苷脂 Ｂ质量浓度 ０～７５０ ｎｇ ／ ｍＬ的范围内，
峰面积与脑苷脂 Ｂ质量浓度之间的关系见式（２）。
Ａｂ ＝ ９２７􀆰 ８９ρｂ ＋ ４６ ８２５　 　 （Ｒ２＝ ０􀆰 ９９５ ２） （２）
式中：Ａｂ为脑苷脂 Ｂ的峰面积，ｃｏｕｎｔｓ；ρｂ为脑苷脂 Ｂ
的质量浓度，ｎｇ ／ ｍＬ。
１􀆰 ７􀆰 ３　 脑苷脂含量计算
菌丝体和子实体中脑苷脂 Ａ 或 Ｂ 的含量 Ｍｃ分
别以菌丝体、子实体的干物基准表示，其计算见式
（３）。
Ｍｃ ＝
ρｔＶｔｎ
ｍ（１ － Ｍｍ）
× １００％ （３）
式中：ρｔ为测试液中脑苷脂 Ａ 或 Ｂ 的质量浓度，
ｇ ／ ｍＬ；Ｖｔ为测试液的体积，ｍＬ；ｎ 为稀释倍数；ｍ 为
菌丝体或子实体试样的质量，ｇ；Ｍｍ为菌丝体或子实
体试样的湿物基准含水率。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 子实体和菌丝体的菌种同源性
对子实体和菌丝体的菌种同源性进行鉴定，结
果如图 ２ 所示。 由图 ２ 可知：子实体和菌丝体的
１８Ｓ ｒＲＮＡ 片段大小一致，大约为 １ ５００ ｂｐ。 通过比
对子实体和菌丝体的 １８Ｓ ｒＲＮＡ 序列（登录号分别
为 ＫＭ６５７８２３、ＫＭ６５７８２４）发现，子实体和菌丝体的
１８Ｓ ｒＲＮＡ 在 ４７８、４７９ 和 ４８０ 位点上有碱基差异。
在这 ３个位点上，子实体的碱基分别为 Ｔ（胸腺嘧
啶）、Ａ（腺嘌呤）和 Ｃ（胞嘧啶），而菌丝体的碱基分
别为 Ｃ（胞嘧啶）、Ｔ（胸腺嘧啶）和 Ａ（腺嘌呤）。 菌
株 ＣＴＭ １及其出发子实体（Ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ５）均与
盾尖鸡枞菌 Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌｙｐｅａｔｕｓ有 ９９％的同源性，
菌株 ＣＴＭ １与出发子实体（Ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ５）之间
也有 ９９％的同源性。 邻接法构建系统进化树（图
３），从进化树看出本实验的子实体和菌株 ＣＴＭ １
均为盾尖鸡枞菌 Ｔ． ｃｌｙｐｅａｔｕｓ。
１—子实体；２—菌丝体
图 ２　 子实体和菌丝体的 １８Ｓ ｒＲＮＡ电泳结果
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ １８Ｓ ｒＲＮＡ ｏｆ
ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ ａｎｄ ｍｙｃｅｌｉａ
图 ３　 基于 １８Ｓ ｒＲＮＡ序列及邻接法构建的系统进化树
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ １８Ｓ ｒＲＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ
０７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
食用菌菌种的鉴定主要有形态学方法和分子
生物学方法。 形态学方法主要根据子实体形态进
行鉴定，而鸡枞菌子实体无法通过菌丝体的人工栽
培获得，因此其菌丝体的菌种鉴定不能采用形态学
方法。 与形态学方法相比，分子生物学方法不但适
用于子实体，而且还适用于菌丝体的鉴定，已被广
泛应用［１１－１３］。 笔者采用分子生物学方法，成功鉴定
了菌株 ＣＴＭ １ 及其出发子实体与盾尖鸡枞菌
Ｔ．ｃｌｙｐｅａｔｕｓ的同源性，为鸡枞菌菌丝体的大规模培养
提供了技术依据。
２􀆰 ２　 菌丝体的生长特性
图 ４为鸡枞菌 ＣＴＭ １ 的菌丝体照片。 由图 ４
可知：菌丝体无色，分支较少，有横隔膜，未见锁状
联合，菌丝体的直径约为 ５～７ μｍ。
图 ４　 鸡枞菌 ＣＴＭ １的菌丝体照片（×６００倍）
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｐｉｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉａ ｏｆ Ｔ．ｃｌｙｐｅａｔｕｓ
ＣＴＭ⁃１ （×６００）
图 ６　 鸡枞菌 ＣＴＭ １在不同平板培养时间的菌落形态
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｃｏｌｏｎｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔ．ｃｌｙｐｅａｔｕｓ ＣＴＭ⁃１ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｔｅ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ
鸡枞菌 ＣＴＭ １平板培养过程中，菌落直径及比
菌落直径增长速率的变化如图 ５所示。 由图 ５可知：
菌落直径的增长速率在 ２７ ｄ 内基本一定，然后逐渐
下降。 ２７ ｄ时，菌落直径达到 ４３􀆰 ９ ｍｍ，培养期间的
平均增长速率为 １􀆰 ５ ｍｍ ／ ｄ。 比菌落直径增长速率在
１ ｄ时为 ０􀆰 ２１ ｄ－１，然后逐渐下降，２７ ｄ 下降到 ０􀆰 ０２
ｄ－１。 据文献［１４］报道，Ｔ． ａｌｂｕｍｉｎｏｓｕｓ、Ｔ． ｆｕｌｇｉｎｏｓｕｓ、
Ｔ． ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｕｓ、Ｔ． Ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ 和 Ｔ． ｍｉｃｒｏｃａｒｐｕｓ 等 ５ 种
鸡枞菌在 ２５ ℃、ＰＤＡ 平板培养基、３０ ｄ 的培养条件
下，菌落直径的平均增长速率分别为 １􀆰 ３、１􀆰 ７、１􀆰 １、
２􀆰 ０和 ２􀆰 ０ ｍｍ ／ ｄ，而鸡枞菌１０ １和鸡枞菌 １０ ２ 在
２８ ℃、ＰＤＡ平板培养基、３０ ｄ 的培养条件下，菌落直
径的平均增长速率分别为 ７􀆰 ５和 １２􀆰 ９ ｍｍ ／ ｄ［１５］。 由
此可见，平板培养中的菌落直径增长速率受到菌种和
培养条件的影响。
图 ５　 鸡枞菌 ＣＴＭ １平板培养过程中菌落直径及
比菌落直径增长速率的变化
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ ｄｉａｍｅｔｅｒ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｌｏｎｙ⁃
ｄｉａｍｅｔｅｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ
Ｔ．ｃｌｙｐｅａｔｕｓ ＣＴＭ⁃１
图 ６为平板培养 ０、１４ 和 ２７ ｄ 时的菌落照片。
在培养初期，菌落呈致密的绒毛状，匍匐生长在培
养基表面，中部稍凸，边缘整齐，表面有褶皱。 ２７ ｄ
后，随着菌丝体的老化，其颜色由纯白色转为棕色。
总的来说，鸡枞菌平板培养的菌落可以分为菌丝
型、孢子型和中间型［１６］。 鸡枞菌 ＣＴＭ １ 的菌落特
征与菌丝型一致。
鸡枞菌 ＣＴＭ １ 液体培养过程中，生物量及比
菌丝体生长速率的变化如图 ７ 所示。 由图 ７ 可知：
１７　 第 ５期 花卫俊等：产脑苷脂鸡枞菌 Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌｙｐｅａｔｕｓ ＣＴＭ １的分子生物学鉴定及生长特性研究
菌丝体生长可以分为 ０ ～ ２ ｄ 的延滞期、３ ～ ８ ｄ 的对
数期以及 ９ ｄ以后的稳定期。 稳定期的生物量约为
３􀆰 ５７ ｇ ／ Ｌ。 比菌丝体生长速率在 １ ｄ时为 ２􀆰 ００ ｄ－１，
然后逐渐下降。
图 ７　 鸡枞菌 ＣＴＭ １液体培养过程中生物量及
比菌丝体生长速率的变化
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｇｒｏｗｔｈ
ｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔ．ｃｌｙｐｅａｔｕｓ ＣＴＭ⁃１
图 ８　 脑苷脂 Ａ和脑苷脂 Ｂ标准品的二级质谱图
Ｆｉｇ􀆰 ８　 ＭＳ２ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ Ａ ａｎｄ Ｂ ｓｔａｎｄａｒｄ
２􀆰 ３　 菌丝体中脑苷脂 Ａ和 Ｂ的含量
图 ８为脑苷脂 Ａ和 Ｂ标准品的二级质谱图。 脑
苷脂 Ａ 和脑苷脂 Ｂ 的相对分子质量分别为 ７２７ 和
７５５。 由图 １可知，脑苷脂 Ａ和 Ｂ均是由葡糖基与含
氮的鞘氨醇及脂肪酸连接而成。 图 ８（ａ）中，ｍ ／ ｚ ＝
７２８􀆰 ６的峰为脑苷脂 Ａ 的［Ｍ＋Ｈ］ ＋。 ｍ ／ ｚ ＝ ７１０􀆰 ８、
ｍ ／ ｚ＝５６６􀆰 ６、ｍ ／ ｚ ＝ ５４８􀆰 ７ 和 ｍ ／ ｚ ＝ ５３０􀆰 ８ 的峰分别对
应脑苷脂 Ａ 的［Ｍ＋Ｈ Ｈ２Ｏ］
＋、［Ｍ＋Ｈ Ｃ６Ｈ１０Ｏ５］
＋、
［Ｍ＋Ｈ Ｃ６Ｈ１２Ｏ６］
＋和［Ｍ＋Ｈ Ｃ６Ｈ１２Ｏ６ Ｈ２Ｏ］
＋。 图 ８
（ｂ）中，ｍ ／ ｚ＝７５６􀆰 ７的峰为脑苷脂 Ｂ的 ［Ｍ＋Ｈ］＋。 ｍ ／ ｚ＝
７３８􀆰 ６、５９４􀆰 ５、５７６􀆰 ５和 ５５８􀆰 ７的峰分别对应脑苷脂 Ｂ 的
［Ｍ＋Ｈ Ｈ２Ｏ］
＋、［Ｍ＋Ｈ Ｃ６Ｈ１０Ｏ５］
＋、［Ｍ＋Ｈ Ｃ６Ｈ１２Ｏ６］
＋
和［Ｍ＋Ｈ Ｃ６Ｈ１２Ｏ６ Ｈ２Ｏ］
＋，因此，用于脑苷脂Ａ和Ｂ定
量分析的离子对分别为 ｍ ／ ｚ ＝ ７２８􀆰 ６／ ５４８􀆰 ７ 和 ｍ ／ ｚ ＝
７５６􀆰 ７／ ５７６􀆰 ５。
菌丝体、子实体的脑苷脂 Ａ 和 Ｂ 含量如表 ２
所示。 菌丝体通过鸡枞菌 ＣＴＭ １ 的液体培养制
备而成，子实体按照取样部位分为子实体菌柄和
子实体菌盖。 由表 ２ 可知，菌丝体的脑苷脂 Ａ 和
Ｂ 质量分数分别为 ０􀆰 １５２％、０􀆰 ０６６％，略低于子
实体菌柄的 ０􀆰 ２６６％、０􀆰 ０８８％以及子实体菌盖的
０􀆰 ２５１％、０􀆰 ０７７％。
表 ２　 菌丝体、子实体的脑苷脂 Ａ和 Ｂ含量
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｉｎ
ｍｙｃｅｌｉａ ａｎｄ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｙ
试样 ｗ（脑苷脂 Ａ） ／ ％ ｗ（脑苷脂 Ｂ） ／ ％
菌丝体 ０􀆰 １５２ ０􀆰 ０６６
子实体菌柄 ０􀆰 ２６６ ０􀆰 ０８８
子实体菌盖 ０􀆰 ２５１ ０􀆰 ０７７
菌丝体与子实体中脑苷脂含量的差异可能与
鸡枞菌的生活史有关。 鸡枞菌的生活史主要由以
下几个阶段组成：①孢子萌发形成单核菌丝；②单
核菌丝融合形成次生菌丝；③由次生菌丝发育成小
白球、原基、假根、子实体［１７－１８］。 与菌丝体相比，子
实体中脑苷脂的含量较高。 这表明在由菌丝体向
子实体发育的阶段中，脑苷脂的合成仍在进行。 此
外，与其他微生物一样，鸡枞菌的生长和代谢受到
培养条件的影响［１９］。 通过对培养基中碳氮源种类
和浓度、无机盐浓度、ｐＨ、接种量、转速、装液量和温
度等条件的优化，Ｔ．ａｌｂｕｍｉｎｏｓｕｓ ＪＮＰＦ ＴＡ０１胞内皂
甙的产量由 ２８􀆰 ４ ｍｇ ／ Ｌ增加到 ５９􀆰 ５ ｍｇ ／ Ｌ［２０］。 在 Ｔ．
ｃｌｙｐｅａｔｕｓ的液体培养基中额外添加 １％的葡萄糖并
培养 ６～８ ｄ后，发酵液中纤维二糖脱氢酶的浓度明
显高于未添加葡萄糖时的浓度［２１］。 在 Ｔ． ｃｌｙｐｅａｔｕｓ
的液体培养基中添加 ０􀆰 １％的 ２ 脱氧 Ｄ 葡萄糖
后，发酵液的纤维二糖酶活力由 １􀆰 ４４ Ｕ ／ ｍＬ 提高到
１４０􀆰 ６０ Ｕ ／ ｍＬ［２２］。 因此，为了提高鸡枞菌菌丝体中
脑苷脂的含量，脑苷脂合成途径的解析、培养条件
对菌丝体的生长和代谢的影响、菌丝体中脑苷脂合
２７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
成的调控等将成为今后研究的主要内容。
３　 结论
采用分子生物学方法鉴定了由笔者自行分离
出来的菌株 ＣＴＭ １ 与鸡枞菌的菌种同源性，测定
了菌丝体的生长速率和脑苷脂含量。 分子生物学
鉴定结果表明，菌株 ＣＴＭ １ 为盾尖鸡枞菌
（Ｔ􀆰 ｃｌｙｐｅａｔｕｓ），菌株 ＣＴＭ １ 及其出发子实体与盾
尖鸡枞菌的同源性为 ９９％。 在 ＰＤＡＹ 平板培养中，
菌落直径的增长速率在 ２７ ｄ 内基本稳定在 １􀆰 ５
ｍｍ ／ ｄ，２７ ｄ后逐渐降低。 比菌落直径增长速率在 １
ｄ时为 ０􀆰 ２１ ｄ－１，然后逐渐下降。 在 ＤＰ ｔ液体培养
中，菌丝体生长可以分为 ０～２ ｄ的延滞期、３～８ ｄ的
对数期以及 ９ ｄ 以后的稳定期，稳定期中的生物量
为 ３􀆰 ５７ ｇ ／ Ｌ。 比菌丝体生长速率在 １ ｄ 时为 ２􀆰 ００
ｄ－１，然后逐渐下降。 菌丝体中脑苷脂 Ａ、Ｂ 的质量
分数分别为 ０􀆰 １５２％和 ０􀆰 ０６６％。 菌丝体中脑苷脂
的含量有望通过培养条件的优化进一步提高。
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ａｓ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＵＳ，２００２０１４８００９Ａ１［Ｐ］．２００２⁃１０⁃１０．
（责任编辑　 管　 珺）
３７　 第 ５期 花卫俊等：产脑苷脂鸡枞菌 Ｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌｙｐｅａｔｕｓ ＣＴＭ １的分子生物学鉴定及生长特性研究